Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31670845, 31870832, 32000811) и Программой заслуженного профессора провинции Ляонин (LJH2018-35).

Периферическая кровь добровольцев, применяемых в этом исследовании, была одобрена Институциональным советом по обзору первой больницы Китайского медицинского университета (#2020-2020-237-2).
1. Подготовка реагентов и среды культуры
<ol><li>Подготовь буфер лиза красных кровяных ?...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

Нейтрофили действуют как наиболее распространенный компонент белых кровяных телец в крови человека. Они являются важными клетками-эффекторами в врожденной иммунной системе человека, которая строит первую линию защиты от вторжения патогенных микроорганизмов11. Поколение...

Неонатальный бактериальный менингит является распространенным детским инфекционным заболеванием. Escherichia coli (E. coli) с капсулой K1 является наиболее распространенным грам-отрицательным патогеном, вызывающим неонатальный бактериальный менингит, на который приходится около 80% от общейзаболеваемости 1,2,3. Несмотря на достижения в области антимикробной химиотерапии и поддерживающей помощи, бактериальный менингит по-прежнему является одним из самых разрушительных состояний с высокой заболеваемостью исмертностью 4.
Возникновение неонатального бактериального менингита обычно начинается с бактериемии, вызванной входом патогенных бактерий в периферическую циркуляцию от местных поражений новорожденных, а затем проникновение через геммозео-мозговой барьер (BBB) в мозг, в результате чего воспаление опоясывания4. Начало бактериемии зависит от взаимодействия между бактериями и иммунными клетками хозяина, включая нейтрофилы и макрофаги и т.д. Нейтрофилов, на которые приходится 50-70% белых кровяных телец, являются первой линией защиты отбактериальных инфекций 5,6. Во время вторжения бактерий, активированные нейтрофилов набираются в инфекционные сайты и высвобождают реактивные виды кислорода (ROS), включая супероксидный анион, перекись водорода, гидроксиловы радикалы и синглетныйкислород 7. ROS проходят редокс реакции с клеточной мембраны, молекулы нуклеиновой кислоты и белки бактерий, в результате чего травмы и смерти вторжениябактерий 8. Митохондрии является основным местом производства ROS в эукариотических клетках, и различные оксидазы (например, никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы комплекс, липоксигеназа системы, белка киназы C и циклоксигеназы системы) посредником производства ROS9,10. Измерение в режиме реального времени производства ROS, представляющего первичный противомикробный механизм в нейтрофилах, является полезным методом для изучения защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.
В этом протоколе, зависит от времени производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с флуоресцентным зондом ROS DHE, обнаруженный в режиме реального времени флуоресцентной микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в других клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) является наиболее распространенными грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение бактериемии и проникновение бактерий через геммозеозный барьер являются незаменимыми шагами для развития менингита кишечной палочки. Реактивные виды кислорода (ROS) представляют собой основные бактерицидные механизмы нейтрофилов для уничтожения вторгшихся патогенов. В этом протоколе, зависит от времени внутриклеточного производства ROS в нейтрофилов, инфицированных менингитом кишечной палочки была количественно с помощью флуоресцентных зондов ROS обнаружены в режиме реального времени флуоресценции микроплеся читателя. Этот метод также может быть применен к оценке производства ROS в клетках млекопитающих во время взаимодействия патогена-хозяина.

Используя протокол, изложенный в этой статье, нейтрофили были выделены из периферической крови человека и загружены флуоресцентным зондом DHE для обнаружения изменений уровней ROS в ответ на инфекцию E44. Здесь мы предоставляем репрезентативные данные, демонстрирующие производство ROS, вы?...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli является основной причиной неонатального грамотрицательных бактериального менингита. Во время бактериальной инфекции, реактивные виды кислорода, производимые нейтрофилов играют важную бактерицидную роль. Здесь мы представляем метод обнаружения реактивных видов кислорода в нейтрофилов в ответ на менингит E. coli.

Количественная оценка видов реактивного кислорода в нейтрофилах, инфицированных менингитом Escherichia Coli в реальном времени

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli является наиболее распространенным грамотрицательных бактерий, вызывающих неонатальный менингит. Возникновение неонатального бактериального менингита чисто начинается с бактериемии, а затем бактерии в крови проникают через гемовой мозговой барьер, чтобы вызвать менингит. Нейтрофилов являются первой линией защиты от бактериальных инфекций.Во время бактериального нашествия активные нейтрофилов высвобождает ROS. ROS представляет собой основные бактериоцидные механизмы клеток-хозяй для уничтожения вторгшихся патогенов. Измерение производства ROS в нейтрофилов является полезным методом для начала защиты хозяина во время взаимодействия бактерий-хозяина.Возьмите одну бактериальную колонию из пластины со стерильной пипеткой и положите ее в пятими миллилитр brain-Heart инфузионной среды, содержащей рифампицин в вогнутой колбе. Инкубировать бактериальную культуру на 37 по Цельсию, с 90 об /мин в течение 17 часов в инкубации шейкер. Центрифуга периферических образцов крови при 2000 об/мин в течение пяти минут.После центрифуги образцы крови делятся на три слоя. Снизу вверх, слой красных кровяных телец, слой белых кровяных телец, и плазменный слой. Аспирировать слой белых кровяных телец в новую трубку с стерильной пипеткой.Добавьте трехкратный буфер лиза красных кровяных телец. Смешайте смесь тщательно, и место при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифуга трубки при 2000 об/мин в течение пяти минут.Аспирировать супернатант полностью и отказаться. Повторите процедуру лиза эритроцитов в течение одного или двух раз, пока осадки не побелеет. Вымойте клетки, повторно приостановив осадок с двумя миллилитров PBS.Затем центрифуга трубки при 1000 об/мин в течение пяти минут. Перерасходовать осадок с 15 микролитер прекод магнитных ячеек сортировки буфера для 15 миллионов клеток. Добавьте 15 магнитных микробусов микролитров и тщательно перемешайте.Инкубировать смесь по четыре по Цельсию в течение 30 минут. В нормальных условиях у взрослого человека есть от четырех до 10 000 белых кровяных телец на микролитерную кровь. Таким образом, стоимость общих белых кровяных телец в пяти миллилитров человеческой периферической крови, почти менее 50 миллионов.И 50 микролитров магнитных бусин в 15 микролитров магнитной сортировки буфера достаточно. Нормальный процент нейтрофилов составляет от 50 до 70% от общего количества белых кровяных телец. Таким образом, около 10 миллионов нейтрофилов могут быть получены из пяти миллилитров крови.Вымойте клетки, добавив два миллилитров магнитного буфера сортировки, на 10 миллионов клеток в трубку, и центрифуги на четыре по Цельсию, 1200 об /мин в течение 10 минут. Соберите магнитную колонку и разделив полку. Отбросьте супернатант полностью, и resuspend отложения с 500 микролитер магнитного буфера сортировки до 100 миллионов клеток.Промыть столбец с помощью трехмилитрового магнитного буфера сортировки. Нанесите подвеску клетки на колонку, чтобы нейтрофиловы, помеченные магнитными бусинами, прикреплялись к столбецу. Смыл неспецифические специфические ячейки, добавив три миллилитровых буфера в течение трех раз, как только столбец резервуар пуст каждый раз.Снимите столбец с магнитного сепаратора и поместите его в новую трубку. Добавьте в столбец пятими миллилитровый буфер магнитной сортировки. Выталкивайте магнитные помеченные клетки с помощью поршеня.Центрифуга трубки при 1200 об/мин в течение пяти минут. Аспирировать супернатант полностью, и повторно изложения отложений с одной миллилитр культуры среды. Определите номер ячейки с помощью счетчика.Скорректирована концентрация клеток до 2 миллионов на миллилитр в среде культуры, содержащей зонд DHE флуоресценции. Поместите нейтрофилов в инкубатор на 30 минут, чтобы загрузить зонд DHE. Выделите подвеску ячейки на черную микроплюжнику на 96 колодец с 200 микролитров на колодец.Включите считыватель микроплатформ. Установите температуру до 37 градусов по Цельсию, выберите режим чтения флуоресценции, кинетический тип чтения, установите длину волны флуоресценции. Выберите формат пластины.Определите область чтения. Измерьте интенсивность флуоресценции каждые пять минут в течение часа. Встряхните тарелку в течение трех секунд перед каждым чтением.Вынюхив микроплюс из инкубатора. Добавьте штаммы PMA или E44 с тремя повторениями. Положите пластину в считыватель микропластиц, нажмите кнопку запуска, чтобы начать анализ немедленно.Используя наброски протокола в этой статье, нейтрофили были выделены из периферической крови человека и загружены зондом DHE с флуоресценцией. Добавив PMA, внутриклеточный ROS в нейтрофилов, показал значительное увеличение от 20 до 40 минут, и достиг пика в 60 минут. Но я думаю, E44 штаммов, ROS производство происходит сразу и увеличивает время в зависимости.Выражение ROS, вызванное штаммом E44, аналогично выражению, вызванному PMA. Обнаружение производства ROS в нейтрофилах может способствовать дальнейшему изучению бактериоцидных механизмов нейтрофилов. В этом протоколе мы предоставляем более простой способ обнаружения производства ROS в нейтрофилах в режиме реального времени.Простой метод может также использоваться для мониторинга производства ROS в других типах клеток хостов во время взаимодействия хост-бактерий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Прямое наблюдение Фагоцитоз и NET-формации Нейтрофилы в Зараженные легкие с помощью 2-фотонной микроскопии

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Неинвазивного Модель Neuropathogenic<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Инфекция в новорожденной крысы

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Измерения вирус денге РНК в надосадке культуры зараженных клеток в реальном времени количественные полимеразной цепной реакции

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

В естественных условиях Визуализация реактивнооксигенных видов мышиных раны модель

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

В реальном времени обработки изображений и количественная оценка развития грибковых биопленки, с использованием двухфазной системы рециркуляции потока

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...