Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31670845, 31870832, 32000811) y el Programa de Profesor Distinguido de la Provincia de Liaoning (LJH2018-35).

La sangre periférica de los voluntarios aplicados en esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del primer Hospital de la Universidad Médica de China (#2020-2020-237-2).
1. Preparación de reactivos y medios de cultivo
<ol><li>Preparar el tampón de lisis de glóbulos rojos añadiendo 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3,37,2 mg de Na2EDTA en 1 L de agua destilada doble y ajustar el pH a 7,2-7,4. Retire la bacteria mediante filtració...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. 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Los neutrófilos actúan como el componente más abundante de los glóbulos blancos en la circulación sanguínea humana. Son células efectoras importantes en el sistema inmune humano innato, que construye la primera línea de defensa contra la invasión de patógenos11. La generación de ROS representa uno de los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos después de la fagocitosis11. Estudios recientes han demostrado que una estructura similar a la red liber...

La meningitis bacteriana neonatal es una enfermedad infecciosa pediátrica común. Escherichia coli (E. coli)con una cápsula K1 es el patógeno gram-negativo más común que causa meningitis bacteriana neonatal, representando alrededor del 80% de la incidencia total1,2,3. A pesar de los avances en la quimioterapia antimicrobiana y la atención de apoyo, la meningitis bacteriana sigue siendo una de las afecciones más devastadoras con alta morbilidad y mortalidad4.
La aparición de meningitis bacteriana neonatal generalmente comienza con la bacteremia causada por la entrada de bacterias patógenas en la circulación periférica de las lesiones locales de los recién nacidos, seguida de la penetración a través de la barrera blood - brain (BBB) en el cerebro, lo que resulta en la inflamación de las meninges4. La aparición de la bacteremia depende de la interacción entre las bacterias y las células inmunes huésped, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, etc. Los neutrófilos, que representan ~50-70% de los glóbulos blancos, son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas5,6. Durante la invasión de bacterias, los neutrófilos activados son reclutados en los sitios infecciosos y liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) incluyendo el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y oxígeno singlete7. El ROS se somete a reacciones redox con la membrana celular, moléculas de ácido nucleico y proteínas de la bacteria, lo que resulta en la lesión y muerte de la bacteria invasora8. Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ROS en células eucariotas, y varios oxidases (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) complejo oxidasa, sistema lipoxigenasa, proteína quinasa C y sistema ciclooxigenasa) median la producción de ROS9,10. La medición en tiempo real de la producción de ROS, que representa el mecanismo antimicrobiano primario en neutrófilos, es un método útil para estudiar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.
En este protocolo, la producción de ROS dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó con una sonda ROS fluorescente DHE, detectada por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en otras células de mamíferos durante la interacción patógeno-huésped.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli)es la bacteria Gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de bacteremia y penetración bacteriana a través de la barrera hematoencefálica son pasos indispensables para el desarrollo de la meningitis E. coli. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) representan los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos para destruir los patógenos invadidos. En este protocolo, la producción de ROS intracelular dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó utilizando sondas ROS fluorescentes detectadas por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en células de mamíferos durante las interacciones patógeno-huésped.

Utilizando el protocolo descrito en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana y cargados con la sonda de fluorescencia DHE para detectar los cambios de los niveles de ROS en respuesta a la infección por E44. Aquí, proporcionamos datos representativos que demuestran la producción ROS evocada por la cepa E44 determinada por un lector de microplacas en tiempo real. Al añadir cepas E44 a un MOI de 100, los niveles ROS aumentaron inmediatamente y mostraron una tendencia continua al a...

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Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli es la bacteria gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de meningitis bacteriana neonatal comienza únicamente con la bacteremia y luego las bacterias en la sangre penetran a través de la barrera hematoencefálica para causar meningitis. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas.Durante la invasión bacteriana, los neutrófilos activos liberan ROS. ROS representa los principales mecanismos bacteriocidas de las células huésped para destruir los patógenos invasores. Medir la producción de ROS en neutrófilos es un método útil para iniciar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.Tome una sola colonia bacteriana de la placa con una pipeta estéril y colóquela en un medio de infusión cerebro-corazón de cinco mililitros que contiene rifampicina en un matraz cóncavo. Incubar el cultivo bacteriano a 37 grados centígrados, con 90 RPM durante 17 horas en la incubadora. Centrífuga las muestras de sangre periférica a 2000 RPM durante cinco minutos.Después de la centrífuga, las muestras de sangre se dividen en tres capas. Desde la parte inferior hasta la parte superior, la capa de glóbulos rojos, la capa de glóbulos blancos y la capa plasmática. Aspirar la capa de glóbulos blancos a un nuevo tubo con una pipeta estéril.Agregue tres veces el tampón de lisis de los glóbulos rojos. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrífuga el tubo a 2000 RPM durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante por completo y descartar. Repita el procedimiento de lisis de los glóbulos rojos durante una o dos veces, hasta que los sedimentos se vuelvan blancos. Lave las células re-suspendiendo el sedimento con dos mililitros PBS.A continuación, centrífuga el tubo a 1000 RPM durante cinco minutos. Resuspend el sedimento con 15 microlitros precodificar amortiguador de clasificación de células magnéticas para 15 millones de células. Agregue 15 microperlas magnéticas de microlitro y mezcle bien.Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. En condiciones normales, el ser humano adulto tiene entre cuatro y 10.000 glóbulos blancos por sangre microlitro. Así que el costo del total de glóbulos blancos en sangre periférica humana de cinco mililitros, casi menos de 50 millones.Y 50 cuentas magnéticas de microlitro en 15 microlitros de clasificación magnética es suficiente. El porcentaje normal de neutrófilos es del 50 al 70% del total de los glóbulos blancos. Así que alrededor de 10 millones de neutrófilos se pueden obtener de sangre de cinco mililitros.Lave las células añadiendo dos mililitros de clasificación magnética, por cada 10 millones de células al tubo, y centrífuga a cuatro grados centígrados, 1.200 RPM durante 10 minutos. Monte la columna magnética y el estante de separación. Deseche el sobrenadante por completo, y resuspend los sedimentos con 500 amortiguadores de clasificación magnética de microlitro para hasta 100 millones de células.Enjuague la columna con un búfer de clasificación magnética de tres mililitros. Aplique la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas, unidas a la columna. Lávese las celdas específicas no específicas añadiendo tres mililitros durante tres veces, una vez que el depósito de columnas esté vacío cada vez.Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo nuevo. Agregue cinco mililitros de clasificación magnética en la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo.Centrífuga el tubo a 1.200 RPM durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante por completo, y resuspend el sedimento con un medio de cultivo mililitro. Determine el número de celda con un contador.Se ha ajustado la concentración celular a 2 millones por mililitro en el medio de cultivo que contiene la sonda de fluorescencia DHE. Coloque los neutrófilos en la incubadora durante 30 minutos para cargar la sonda DHE. Asigne la suspensión celular a una microplaca negra de 96 pozos con 200 microlitros por pozo.Encienda el lector de microplacas. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados, elija el modo de lectura de fluorescencia, el tipo de lectura cinética, establezca la longitud de onda de fluorescencia. Elija el formato de placa.Determine el área de lectura. Mida la intensidad de fluorescencia cada cinco minutos durante una hora. Agitar el plato durante tres segundos antes de cada lectura.Saca la microplaca de la incubadora. Añadir cepas PMA o E44 con tres repeticiones. Coloque la placa en el lector de microplacas, pulse el botón de inicio para comenzar el ensayo inmediatamente.Usando el esquema del protocolo en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana, y cargados con sonda de fluorescencia DHE. Al agregar PMA, ros intracelular en neutrófilos, mostró un aumento significativo de 20 a 40 minutos, y alcanzó su pico en 60 minutos. Pero creo que las cepas E44, la producción de ROS se produce inmediatamente y aumenta el tiempo de forma dependiente.La expresión de ROS causada por la cepa E44 es similar a la causada por PMA. La detección de la producción de ROS en neutrófilos puede contribuir al estudio posterior de los mecanismos bacteriócidas de los neutrófilos. En este protocolo, proporcionamos una manera más fácil de detectar la producción ros en neutrófilos de una manera en tiempo real.El método simple también podría utilizarse para monitorear la producción de ROS en otros tipos de células anfitrionas durante las interacciones entre el huésped y las bacterias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

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Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Medición de ARN del Virus del Dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

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En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

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