Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) och Programmet för framstående professor i Liaoning-provinsen (LJH2018-35).

Perifert blod från frivilliga som tillämpades i denna forskning godkändes av Institutional Review Board vid det första sjukhuset vid China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Beredning av reagenser och odlingsmedium
<ol><li>Förbered lysbufferten för röda blodkroppar genom att tillsätta 8, 29 g NH4Cl, 1 g KHCO3,37,2 mg Na2EDTA i 1 L dubbeldestillerat vatten och justera pH-värdevärdet till 7, 2-7,4. Avlägsna bakterierna genom filtrering med 0,2...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

Neutrofiler fungerar som den vanligaste komponenten i vita blodkroppar i människans blodcirkulation. De är viktiga effektorceller i det medfödda mänskliga immunsystemet, som bygger den första försvarslinjen mot invasionen av patogener11. Generationen av ROS representerar en av de viktigaste bakteriedödande mekanismerna för neutrofiler efter faagocytos11. Nyligen genomförda studier har visat att en nätliknande struktur som frigörs av en neutrofil som kallas neutro...

Neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation är en vanlig pediatrisk infektionssjukdom. Escherichia coli (E. coli) med en K1-kapsel är den vanligaste gramnegativa patogenen som orsakar neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation, som står för cirka 80% av den totalaincidensen 1,2,3. Trots framstegen inom antimikrobiell kemoterapi och stödjande vård är bakteriell hjärnhinneinflammation fortfarande ett av de mest förödande tillstånden med hög sjuklighet ochdödlighet 4.
Förekomsten av neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation börjar vanligtvis med bakteriemi orsakad av inträdet av patogena bakterier i perifera cirkulationen från de nyföddas lokala skador, följt av penetration genom blod - hjärnbarriären (BBB) i hjärnan, vilket resulterar i inflammation i hjärnhinnorna4. Uppkomsten av bakteriemi beror på interaktionen mellan bakterier och värd immunceller inklusive neutrofiler och makrofager, etc. Neutrofiler, som står för ~ 50-70% av vita blodkroppar, är den första försvarslinjen mot bakteriella infektioner5,6. Under invasionen av bakterier rekryteras de aktiverade neutrofilerna till de smittsamma platserna och släpper ut reaktiva syrearter (ROS) inklusive superoxidanjon, väteperoxid, hydroxylradikaler och singlet syre7. ROS genomgår redoxreaktioner med bakteriernas cellmembran, nukleinsyramolekyler och proteiner, vilket resulterar i skador och död hos de invaderande bakterierna8. Mitokondrierna är huvudplatsen för ROS-produktion i eukaryota celler och olika oxidaser (t.ex. nikotinamid adenin dinukleotidfosfat (NADPH) oxidaskomplex, lipoxygenassystem, proteinkinas C och cyklooxygenassystem) förmedlar produktionen av ROS9,10. Realtidsmätningen av produktionen av ROS, som representerar den primära antimikrobiella mekanismen i neutrofiler, är en användbar metod för att studera värdförsvar under bakterie-värdinteraktionen.
I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med en fluorescerande ROS sond DHE, upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömningen av produktionen av försäljning i andra däggdjursceller under interaktionen mellan patogen och värd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) är de vanligaste gramnegativa bakterierna som orsakar neonatal hjärnhinneinflammation. Förekomsten av bakteriemi och bakteriell penetration genom blod - hjärnbarriären är oumbärliga steg för utvecklingen av E. coli hjärnhinneinflammation. Reaktiva syrearter (ROS) representerar de viktigaste bakteriedödande mekanismerna hos neutrofiler för att förstöra de invaderade patogenerna. I detta protokoll kvantifierades den tidsberoende intracellulära ROS-produktionen i neutrofiler infekterade med meningitic E. coli med fluorescerande ROS sonder upptäckt av en realtid fluorescens microplate läsare. Denna metod kan också tillämpas vid bedömning av produktion av försäljning i däggdjursceller under interaktioner mellan patogen och värd.

Med hjälp av protokollet som beskrivs i denna artikel isolerades neutrofiler från humant perifert blod och laddades med fluorescens sond DHE för att upptäcka förändringar av ROS nivåer som svar på E44 infektion. Här tillhandahåller vi representativa data som visar den ROS-produktion som framkallas av E44-stammen som bestäms av en mikroplåtläsare i realtid. Genom att lägga till E44-stammar till en moi på 100, ökade ROS-nivåerna omedelbart och visade en kontinuerlig uppåtgående trend med ett tidsberoende...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli är den främsta orsaken till neonatal gramnegativ bakteriell hjärnhinneinflammation. Under bakterieinfektionen spelar reaktiva syrearter som produceras av neutrofiler en viktig bakteriedödande roll. Här introducerar vi en metod för att upptäcka de reaktiva syrearterna i neutrofiler som svar på hjärnhinneinflammation E. coli.

Kvantifiering i realtid av reaktiva syrearter i neutrofiler infekterade med meningitisk escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli är de vanligaste gramnegativa bakterierna som orsakar neonatal hjärnhinneinflammation. Förekomsten av neonatal bakteriell hjärnhinneinflammation börjar helt med bakterien och sedan tränger bakterierna i blodet genom blodhjärnbarriären för att orsaka hjärnhinneinflammation. Neutrofiler är den första försvarslinjen mot bakterieinfektionerna.Under bakteriell invasion släpper de aktiva neutrofilerna ROS. ROS representerar de viktigaste bakteriocidmekanismerna hos värdceller för att förstöra de invaderande patogenerna. Att mäta produktionen av ROS i neutrofiler är en användbar metod för att starta värdens försvar under interaktion mellan bakterier och värd.Ta en enda bakteriekoloni från plattan med en steril pipett och lägg den i fem milliliter Brain-Heart infusionsmedium som innehåller Rifampicin i en konkav kolv. Inkubera bakteriekulturen vid 37 centigrade, med 90 RPM i 17 timmar i inkubationsskakapparaten. Centrifugera de perifera blodproverna vid 2000 RPM i fem minuter.Efter centrifug är blodproverna uppdelade i tre lager. Från botten till toppen, det röda blodkropparna lager, vita blodkroppar lager och plasmaskiktet. Aspirera de vita blodkropparna till ett nytt rör med en steril pipett.Tillsätt trefaldig röd blodcellslysbuffert. Blanda blandningen noggrant och placera vid rumstemperatur i fem minuter. Centrifugera röret vid 2000 varv/min i fem minuter.Aspirera supernaten helt och kassera. Upprepa lysproceduren hos röda blodkroppar i en eller två gånger tills sedimenten blir vita. Tvätta cellerna genom att suspendera sedimentet igen med två milliliter PBS.Centrifugera sedan röret vid 1000 RPM i fem minuter. Återanvänd sedimentet med 15 mikroliter förkoda magnetisk cellsorteringsbuffert för 15 miljoner celler. Tillsätt 15 mikroliter magnetiska mikrober och blanda noggrant.Inkubera blandningen vid fyra centigrade i 30 minuter. Under normala förhållanden har den vuxna människan cirka fyra till tio 000 vita blodkroppar per mikroliterblod. Så kostnaden för totala vita blodkroppar i fem milliliter humant perifert blod, nästan mindre än 50 miljoner.Och 50 mikroliter magnetiska pärlor i 15 mikroliter magnetisk sorteringsbuffert räcker. Den normala andelen neutrofiler är 50 till 70% av de totala vita blodkropparna. Så cirka 10 miljoner neutrofiler kan erhållas från fem milliliter blod.Tvätta cellerna genom att tillsätta två milliliter magnetisk sorteringsbuffert, per 10 miljoner celler till röret, och centrifugera vid fyra centigrade, 1 200 varv/min i 10 minuter. Montera magnetkolonnen och separera hyllan. Kassera supernatanten helt och återanvänd sedimenten med 500 mikroliter magnetisk sorteringsbuffert för upp till 100 miljoner celler.Skölj kolonnen med tre milliliter magnetisk sorteringsbuffert. Applicera cellfjädringen på kolonnen så att neutrofiler som är märkta med de magnetiska pärlor som är fästa vid kolonnen. Tvätta bort de icke-specifika specifika cellerna genom att tillsätta tre milliliter buffert tre gånger, när kolumnbehållaren är tom varje gång.Ta bort kolonnen från magnetavskiljaren och lägg den i ett nytt rör. Lägg till fem milliliter magnetisk sorteringsbuffert i kolumnen. Tryck ut de magnetiskt märkta cellerna med en kolv.Centrifugera röret vid 1 200 varv/min i fem minuter. Aspirera supernatanten helt och återanvänd sedimentet med ett milliliter odlingsmedium. Bestäm cellnumret med en räknare.Justerat cellkoncentrationen till 2 miljoner per milliliter i odlingsmediet som innehåller DHE fluorescens sond. Placera neutrofilerna i inkubatorn i 30 minuter för att ladda DHE-sonden. Fördela cellupphängningen till en 96-brunns svart mikroplatta med 200 mikroliter per brunn.Slå på mikroplåtsläsaren. Ställ in temperaturen på 37 centigrade, välj fluorescensläsningsläge, kinetisk lästyp, ställ in fluorescensvåglängden. Välj plåtformat.Bestäm läsområdet. Mät fluorescensintensiteten var femte minut i en timme. Skaka plattan i tre sekunder före varje avläsning.Ta ut mikroplattan från inkubatorn. Tillsätt PMA- eller E44-stammar med tre repetitioner. Sätt plattan i mikroplattans läsare, tryck på startknappen för att börja analysen omedelbart.Med hjälp av protokollet disposition i denna artikel isolerades neutrophils från den mänskliga perifera blodet och laddas med fluorescens sond DHE. Genom att lägga till PMA, intracellulära ROS i neutrofiler, visade en betydande ökning från 20 till 40 minuter och nådde topp vid 60 minuter. Men jag tror att E44-stammar, ROS-produktionen sker omedelbart och ökar tiden beroende på.Uttrycket av ROS orsakad av E44-belastning liknar det som orsakas av PMA. Påvisande av ROS produktion i neutrophils kan bidra till ytterligare studie av bakteriocidal mekanismer av neutrophils. I detta protokoll ger vi ett enklare sätt att upptäcka ROS-produktionen i neutrofiler i realtid.Den enkla metoden kan också användas för att övervaka ROS-produktionen i andra värdcelltyper under värd-bakterieinteraktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Direkt observation av fagocytos och NET-bildande genom Neutrofiler i infekterade lungor med hjälp av två-photon Mikroskopi

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Icke-invasiv Modell av Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Enstegs Negativ kromatografisk rening av<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverande Protein överuttryckt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-läge

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisande av entrohemoragiska Escherichia Coli koloniseringen i murina mottagande av icke-invasiva In Vivo Mareld System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Ett lättköpt protokoll att generera anläggningsvis acetylerade proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Mäta denguefeber Virus RNA i kultur supernatanten av infekterade celler av realtid kvantitativa Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Avbildning av reaktiva syreradikaler i en murin sår modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...