Name: real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31670845, 31870832, 32000811) ve Liaoning Eyaleti Seçkin Profesör Programı (LJH2018-35) tarafından desteklenmiştir.

Bu araştırmada uygulanan gönüllülerden alınan periferik kan, ilk Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (#2020-2020-237-2).
1. Reaktiflerin ve kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>Kırmızı kan hücresi liziz tamponunu 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO 3 ,37,2mg Na2EDTA'yı 1 L çift damıtılmış suya ekleyerek hazırlayın ve pH'ı 7,2-7,4'e ayarlayın. 0,22 μm filtreler kullanarak bakteriyi filtrasyonl...

<ol>
	<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children.">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).</li><li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+&lt;/=60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments.">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants &lt;/=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis:+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study.">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).</li><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli.">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li><li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Molecules,+Functions+and+Pathophysiological+Aspects.">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li><li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+(ROS)+and+ROS-induced+ROS+release.">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li><li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses.">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li><li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity.">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li><li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases:+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies.">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis.">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li><li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Neutrophil+Oxidants:+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality.">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li><li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+(ETs)+in+Humans.">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li><li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neutrophil+function+test.">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li><li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection.">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li><li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mitochondrial+Mass,+Damage,+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry.">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li></ol>

Nötrofiller, insan kan dolaşımındaki beyaz kan hücrelerinin en bol bileşeni olarak işlev görür. Patojenlerin istilasına karşı ilk savunma hattını oluşturan doğuştan gelen insan bağışıklık sisteminde önemli efektör hücrelerdir11. ROS'un üretimi, fagositoz11'itakiben nötrofillerin önemli bakterisidal mekanizmalarından birini temsil eder. Son çalışmalar, nötrofil hücre dışı tuzak (NET) adı verilen bir nötrofil tarafından salınan net ben...

Yenidoğan bakteriyel menenjit yaygın bir pediatrik bulaşıcı hastalıktır. Bir K1 kapsülü ile Escherichia coli (E. coli), yenidoğan bakteriyel menenjite neden olan en yaygın Gram negatif patojendir ve toplam insidansin yaklaşık% 80'ini oluşturur1,2,3. Antimikrobiyal kemoterapi ve destekleyici bakımdaki gelişmelere rağmen, bakteriyel menenjit hala yüksek morbidite ve mortalite ile en yıkıcı durumlardan biridir4.
Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu genellikle patojenik bakterilerin yenidoğanların lokal lezyonlarından periferik dolaşıma girmesinden kaynaklanan bakteriyemi ile başlar, ardından kan-beyin bariyerinden (BBB) beyne nüfuz ederek menenjlerin iltihaplanmasına neden olur4. Bakteriseminin başlangıcı, nötrofiller ve makrofajlar vb. Beyaz kan hücrelerinin ~ 50-70% 'ini oluşturan nötrofiller, bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır5,6. Bakterilerin istilası sırasında, aktif nötrofiller enfeksiyöz bölgelere alınır ve süperoksit anion, hidrojen peroksit, hidroksil radikalleri ve singlet oksijen7dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerini (ROS) serbest bırakır. ROS hücre zarı, nükleik asit molekülleri ve bakteri proteinleri ile redoks reaksiyonlarına maruz kalan ve istilacı bakterilerin yaralanmasına ve ölümüne neden olan8. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde ROS üretiminin ana alanıdır ve çeşitli oksidazlar (örneğin, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz kompleksi, lipoksijenaz sistemi, protein kinaz C ve siklooksijenaz sistemi) ROS9,10üretimine aracılık eder. Nötrofillerdeki birincil antimikrobiyal mekanizmayı temsil eden ROS üretiminin gerçek zamanlı ölçümü, bakteri-konak etkileşimi sırasında konak savunmasını incelemek için yararlı bir yöntemdir.
Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağlı ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ros probu DHE ile ölçüldü. Bu yöntem, patojen-konak etkileşimi sırasında diğer memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>DINGGUO</td>
			<td>DH010-1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autuomated cell counter</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>508BR03397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Carbinet</td>
			<td>Shanghai Lishen</td>
			<td>Hfsafe-1200Lcb2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Changsha Xiangyi</td>
			<td>TDZ5-WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>104821-25-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Cellmax</td>
			<td>SA211.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Hera Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Beyoitme</td>
			<td>S1819-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separation Unit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>13292-46-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E600027-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic shaker</td>
			<td>Shanghai Zhicheng</td>
			<td>ZWY-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quantification of reactive oxygen species in neutrophils infected with meningitic escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) yenidoğan menenjite neden olan en yaygın Gram-negatif bakteridir. Kan-beyin bariyeri yoluyla bakteriyemi ve bakteriyel penetrasyon oluşumu E. coli menenjit gelişimi için vazgeçilmez adımlardır. Reaktif oksijen türleri (ROS), istila edilen patojenleri yok etmek için nötrofillerin başlıca bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Bu protokolde, meningitik E. coli ile enfekte olan nötrofillerde zamana bağımlı hücre içi ROS üretimi, gerçek zamanlı bir floresan mikro plaka okuyucusu tarafından tespit edilen floresan ROS probları kullanılarak ölçüldü. Bu yöntem, patojen konak etkileşimleri sırasında memeli hücrelerinde ROS üretiminin değerlendirilmesine de uygulanabilir.

Bu makalede özetlenen protokol kullanılarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve E44 enfeksiyonuna yanıt olarak ROS seviyelerinin değişikliklerini tespit etmek için floresan probu DHE ile yüklendi. Burada, bir mikro plaka okuyucu tarafından gerçek zamanlı olarak belirlenen E44 suşu tarafından uyandırılan ROS üretimini gösteren temsili veriler sunuyoruz. 100 MOI'de E44 suşları eklenerek, ROS seviyeleri hemen arttı ve zamana bağlı bir şekilde sürekli bir yükseliş eğilimi göster...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli at JoVE.com

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli, yenidoğan menenjite neden olan en yaygın gram negatif bakteridir. Yenidoğan bakteriyel menenjitin oluşumu tamamen bakteriyemi ile başlar ve daha sonra kandaki bakteriler menenjite neden olmak için kan beyin bariyerine nüfuz eder. Nötrofiller bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattıdır.Bakteri istilası sırasında, aktif nötrofiller ROS'yi serbest bırakır. ROS, istilacı patojenleri yok etmek için konak hücrelerin ana bakterisidal mekanizmalarını temsil eder. Nötrofillerde ROS üretimini ölçmek, bakteri-konak etkileşimi sırasında konağın savunmasına başlamak için yararlı bir yöntemdir.Steril pipet ile plakadan tek bir bakteri kolonisi alın ve içbükey bir şişede Rifampicin içeren beş mililitre Beyin-Kalp infüzyon ortamına koyun. Bakteri kültürünü 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, kuluçka çalkalayıcıda 17 saat boyunca 90 RPM ile. Periferik kan örneklerini 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, kan örnekleri üç katmana ayrılır. Aşağıdan yukarıya, kırmızı kan hücreleri tabakası, beyaz kan hücreleri tabakası ve plazma tabakası. Beyaz kan hücreleri tabakasını steril pipetli yeni bir tüpe epire edin.Üç kat kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin. Karışımı iyice karıştırın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Tüpü 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı tamamen aspire edin ve atın. Çökeltiler beyazlayıncaya kadar kırmızı kan hücrelerinin liziz prosedürünü bir veya iki kez tekrarlayın. Tortuyu iki mililitre PBS ile yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın.Sonra tüpü 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Tortuyu 15 milyon hücre için 15 mikroliter önkodlu manyetik hücre sıralama tamponu ile yeniden biriktirin. 15 mikroliter manyetik mikrobead ekleyin ve iyice karıştırın.Karışımı 30 dakika boyunca dört santigratta kuluçkaya yatırın. Normal koşullar altında, yetişkin insan mikroliter kan başına yaklaşık 4 ila 10.000 beyaz kan hücresine sahiptir. Yani beş mililitre insan periferik kanındaki toplam beyaz kan hücrelerinin maliyeti, neredeyse 50 milyondan az.Ve 15 mikroliter manyetik ayırma tamponunda 50 mikroliter manyetik boncuk yeterlidir. Nötrofillerin normal yüzdesi toplam beyaz kan hücrelerinin% 50 ila 70'idir. Yani beş mililitre kandan yaklaşık 10 milyon nötrofil elde edilebilir.Tüpe 10 milyon hücre başına iki mililitre manyetik sıralama tamponu ve 10 dakika boyunca dört santigrat, 1.200 RPM'de santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. Manyetik sütunu ve ayırma rafını birleştirin. Süpernatantı tamamen atın ve tortuları 100 milyon hücreye kadar 500 mikroliter manyetik sıralama tamponu ile yeniden biriktirin.Sütunu üç mililitre manyetik sıralama arabelleği ile durulayın. Sütuna bağlı manyetik boncuklar tarafından etiketlenmiş nötrofillere izin vermek için hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın. Sütun rezervuarı her seferinde boşaldıktan sonra, üç kez üç mililitre arabellek ekleyerek spesifik olmayan belirli hücreleri yıkadı.Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir tüpe koyun. Sütuna beş mililitre manyetik sıralama arabelleği ekleyin. Manyetik etiketli hücreleri bir piston kullanarak dışarı itin.Tüpü 1,200 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı tamamen emiş ve tortuyu bir mililitre kültür ortamı ile yeniden canlandırmak. Sayaçla hücre numarasını belirleyin.DHE floresan probu içeren kültür ortamında hücre konsantrasyonu mililitre başına 2 milyon olarak ayarlandı. DHE probını yüklemek için nötrofilleri 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücre süspansiyonu, kuyu başına 200 mikroliter ile 96 kuyulu siyah bir mikro plakaya tahsis edin.Mikro plaka okuyucuyu açın. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın, floresan okuma modunu, kinetik okuma türünü seçin, floresan dalga boyunu ayarlayın. Plaka biçimini seçin.Okuma alanını belirleyin. Bir saat boyunca her beş dakikada bir floresan yoğunluğunu ölçün. Her okumadan önce tabağı üç saniye sallayın.Kuvözdeki mikro plakayı çıkar. Üç tekrarlı PMA veya E44 suşları ekleyin. Plakayı mikro plaka okuyucuya koyun, teste hemen başlamak için başlat düğmesine basın.Bu makaledeki protokol ana hatlarını kullanarak, nötrofiller insan periferik kanından izole edildi ve floresan probu DHE ile yüklendi. Nötrofillerde hücre içi ROS PMA eklenerek 20 dakikadan 40 dakikaya kadar önemli bir artış gösterdi ve 60 dakikada zirveye ulaştı. Ancak E44'ün zorlandığını, ROS üretiminin hemen gerçekleştiğini ve zamanı bağımlı olarak artırdığını düşünüyorum.E44 suşunun neden olduğu ROS ifadesi PMA'nın neden olduğu ifadeye benzer. Nötrofillerde ROS üretiminin tespiti, nötrofillerin bakteriyoidal mekanizmalarının daha fazla incelenmesine katkıda bulunabilir. Bu protokolde nötrofillerdeki ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmenin daha kolay bir yolunu sunuyoruz.Basit yöntem, konak bakteri etkileşimleri sırasında diğer konak hücre tiplerinde ROS üretimini izlemek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...