Name: assessing agrochemical risk to mated honey bee queens
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00
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感谢Amy Cash-Ahmed博士，Nathanael J. Beach和Alison L. Sankey在开展这项工作时提供的帮助。本出版物中提及商品名称或商业产品仅用于提供特定信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。这项研究得到了国防高级研究计划局#HR0011-16-2-0019对Gene E. Robinson和Huimin Zhao，USDA项目2030-21000-001-00-D以及伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校社区学院学生表型可塑性研究经验的支持。

1. QMC组装
<ol><li>从部件（图1A）组装QMC，插入一个产卵板（ELP），如图 1B所示。在将工人添加到笼子之前，不要添加喂料管。用实验室级胶带暂时覆盖 4 个进纸器孔。</li>
	<li>将蜂王排除器和喂食室门插入喂养室上方，以防止蜂王进入喂养室并接触经过处理的饮食。有关更多组装详细信息，请参见 Fine 等人32。</li>
	<li>在成年休养前24?...

雌性独居昆虫以及真社会昆虫群落中的蚁后的繁殖力可能受到非生物应激源的影响，例如农用化学品25，28，29，30，33。在蜜蜂中，农用化学品对蜂王的影响可能是间接的，因为它们可以通过工蜂的护理和喂养的变化而发生。我们的代表性结果与基于现场的研究2...

由于全球对农产品的需求增加，现代农业实践通常需要使用农用化学品来控制已知会降低或损害作物产量的众多害虫1。同时，许多水果，蔬菜和坚果作物的种植者依靠商业蜜蜂群落提供的授粉服务来确保丰收2。这些做法可能导致传粉媒介，包括蜜蜂（Apis mellifera），暴露于有害水平的农药残留3。同时，蜜蜂群落中广泛存在的寄生Varroa破坏螨虫侵扰经常需要养蜂人用杀螨剂处理其蜂巢，这也可能对蜂群的健康和寿命产生负面影响4，5，6。为了减少和减轻农用化学品的有害影响，有必要在实施之前全面评估其对蜜蜂的安全性，以便提出使用建议以保护有益昆虫。
目前，环境保护署（EPA）依靠对蜜蜂农药暴露的分层风险评估策略，其中包括对成年蜜蜂和有时对蜜蜂幼虫7进行实验室测试。如果较低级别的实验室检查无法减轻对毒性的担忧，则可能建议进行高级别的现场和半现场测试。虽然这些实验室测试为农用化学品对工人寿命的潜在影响提供了有价值的见解，但它们并不一定预测它们对女王的影响，这与工人生物学8和行为9显着不同。此外，农用化学品对昆虫有许多潜在的影响，除了死亡之外，这可能对依靠协调行为作为殖民地单位10，11的社会昆虫产生相当大的影响。
虽然死亡率是农用化学品最普遍考虑的影响12，但这些产品可以对目标和非目标节肢动物产生广泛的影响，包括改变行为13，14，15，16，排斥性或吸引性17，18，19，进食模式的变化20，21，22和增加或减少的生育能力20，21，22，23，24，25。对于群居昆虫来说，这些影响会系统性地破坏群体的相互作用和功能11。在这些功能中，严重依赖由殖民地单元9的其余部分支持的单个产卵女王的繁殖可能特别容易受到农药暴露的干扰。
对未成熟的蚁后进行的研究表明，发育暴露于杀螨剂会影响成年蚁后的行为，生理学，存活率26，27。类似地，使用全尺寸或缩小尺寸的菌落的研究表明，农用化学品可以通过减少交配成功率28，减少产卵29和降低产生的卵的生存能力来影响成年蜂王25，30，31。以前，如果不使用整个菌落，这些现象很难观察到，这主要是由于缺乏可用的实验室方法。然而，最近已经采用了一种使用女王监测笼（QMC）32在严格控制的实验室条件下研究女王产卵的方法，以检查农用化学品对女王生育能力的影响33。在这里，详细介绍了这些技术以及测量和跟踪QMC中工人饮食消耗的其他方法。
这些方法比需要全尺寸菌落的实验更有利，因为它们允许向大大减少的工人数量施用精确剂量的农用化学品，相对于通常存在于蚁群内的数万人，然后蚁后提供蚁后。这种曝光技术反映了女王在现实世界中会经历的二手曝光，因为在蚁群中，蚁后不会自己进食，而是依靠工人为它们提供饮食9。同样，蚁后通常不会离开蜂巢，除非在蜂群繁殖（蜂群）期间交配飞行35。交配的蜂王可以从商业蜂王种购买并在一夜之间发货。通常，女王育种者在确认它们已经开始产卵后直接出售女王，这被视为成功交配的标志。如果需要有关女王年龄或亲缘关系的更精确信息，研究人员可以在下订单之前咨询女王育种者。
QMC可以精确观察和量化蜂王的产卵和卵孵化率32，33，产生与农用化学品暴露对蜂王繁殖力的影响相关的宝贵数据。这里提出的代表性结果描述了在长期暴露于全身性神经毒性剂新烟碱类杀虫剂吡虫啉36的现场相关浓度下量化QMC的产卵，饮食消耗和胚胎活力的实验。一旦施用，吡虫啉会转移到植物组织37，并且已经检测到许多蜜蜂授粉植物的花粉和花蜜38，39，40的残留物。暴露于吡虫啉会对蜜蜂产生广泛的不利影响，包括觅食性能受损16，免疫功能受损41，以及群体扩张和存活率下降42，43。在这里，选择吡虫啉作为测试物质，因为田间实验表明它可以影响蜂王产卵29

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluon</td>
			<td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td>
			<td>2871A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honey bee queens</td>
			<td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>37894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaBee Powder</td>
			<td>MegaBee, San Dieago, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>02-682-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 20 gauge</td>
			<td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td>
			<td>5FVK4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Queen Monitoring Cages</td>
			<td>University of Illinois Urbana-Champaign</td>
			<td></td>
			<td>Patent application number: 20190350175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Microplate Lids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>5500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing agrochemical risk to mated honey bee queens

目前对蜜蜂的风险评估策略在很大程度上依赖于对成年或未成熟的工蜂进行的实验室测试，但这些方法可能无法准确捕获农用化学品暴露对蜂王的影响。作为蜜蜂群落内受精卵的唯一生产者，蜂王可以说是一个正常运作的蜂群中最重要的单一成员。因此，了解农用化学品如何影响蜂王健康和生产力应被视为农药风险评估的一个关键方面。在这里，提出了一种适应性的方法，使蜜蜂蜂王和工蜂王服务员暴露于通过工人饮食施用的农用化学品应激源，然后在实验室中跟踪产卵量，并使用专门的笼子（称为蜂王监测笼）评估第一龄的关闭情况。为了说明该方法的预期用途，描述了一项实验的结果，其中工人女王服务员被喂食含有亚致死剂量的吡虫啉的饮食，并监测了对女王的影响。

在如上所述组装和维护的QMC中监测鸡蛋的产量，每天观察一次鸡蛋产量和每个处理组15个网箱。新交配的主要是卡尼奥兰种的蜂王从女王饲养员那里购买并连夜运输，并且蜜蜂工人是从伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校的蜜蜂研究设施中按照标准商业方法维护的3个蜂群中获得的。这里，使用4个饮食治疗组：1）蔗糖溶液和花粉补充剂中的50 ppb（g / g）吡虫啉（50 ppb - p + s），2）蔗糖溶液和花粉补充剂...

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Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

该协议的制定是为了加强对农用化学品如何影响蜜蜂（Apis mellifera）繁殖的理解，方法是建立方法，在受控的实验室环境中将蜜蜂及其工人看护人暴露于农用化学品中，并仔细监测它们的相关反应。

评估交配蜜蜂女王的农用化学品风险

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

农用化学品暴露会对蜜蜂群落的所有成员产生重大影响，包括最重要的成员，蜂王。但直到最近，很少有工具可用于研究这些影响。这种技术使研究人员能够在受控条件下将蜂王暴露在农用化学品中，模拟它们在田间可能经历的条件。很容易干扰蜜蜂女王的产卵行为，因此在实验之前和实验期间处理工人和蜂王时要小心。展示这些程序的将是Amy Floyd和Eliza Litsey，他们是蜜蜂研究实验室入侵物种和传粉媒介健康研究部门的实验室技术人员。首先，通过插入门板来组装蜂王监测笼或QMC，然后将蜂王排除器插入喂食室上方的喂食室门中，以防止蜂王进入和接触经过处理的饮食。插入单个电子学习产品。在将工人添加到笼子之前，不要添加喂料管，并暂时用实验室级胶带覆盖四个喂料器孔。在收集并孵育含有蜜蜂群落的有盖工人育雏的蜡梳架后，将封闭的蜜蜂刷到衬有防虫涂料的开放式容器中，以防止蜜蜂爬出。将至少50只按重量计蜜蜂加入每个QMC的产卵室中。为了确保引入多样化的基因库，请从至少三个菌落中获得相似数量的工蜂，并允许它们在将蜜蜂添加到QMC之前进行混合。使用在收到后48小时内从商业育种者处购买的女王。当女王仍在运输笼内时，将其放入透明塑料袋中。然后将塑料管的一端连接到袋内的二氧化碳气体罐，并轻轻打开罐阀，让二氧化碳气体流动。当袋子被气体充气时，同时关闭罐阀并保持袋子关闭以将气体捕获在内部。保持袋子关闭30秒或直到蜂王停止移动。一旦观察到蚁后失去知觉，通过打开装运笼子来移除蚁后。部分打开产卵室的门，轻轻地将失去知觉的女王放在里面并合上盖子。将第二个电子学习产品添加到每个 QMC。在两个电子学习产品的顶部放置一块实验室胶带，以防止它们与QMC框架分离，并防止工人离开笼子。将笼子置于环境条件稳定在34至35摄氏度和相对湿度为50-70%的黑暗培养箱中。为了施用掺有农用化学品的日粮，请在适当的溶剂（如丙酮）中制备农用化学品的储备溶液，其浓度可以添加到日粮中以达到感兴趣的农用化学品的所需最终浓度。在蔗糖溶液，商业花粉补充剂或两者中施用农用化学品处理。准备实验性饮食以在同一天使用，通过加入适量的储备溶液到冷藏或室温，50%蔗糖溶液中。通过中速涡旋彻底混合。对于花粉补充剂，将计算量的农用化学品储备溶液添加到蔗糖溶液中，并在将其添加到粉末补充剂之前彻底涡旋。将饲料添加到喂料管中，并在将其放入QMC之前记录喂食器重量。要量化产卵，首先从孵化器中取出QMC。检查透明电子学习产品背面，如果存在鸡蛋，请取下感兴趣板前的门板。从电子学习产品上取下胶带，并在电子学习产品与QMC内的蜜蜂之间滑动门板。将门板安装到位后，取出ELP并计数并记录ELP细胞内的卵子数量。通过在坚硬的表面上敲击ELP开孔侧的边缘来去除卵子。一旦卵落出，在QMC中更换空的ELP。轻轻地卸下并更换QMC外部ELP后面的门板。根据需要对第二个 ELP 重复上述步骤，完成后在 QMC 上更换磁带。为了监测食物的消耗，每两天用新鲜烹制的饮食代替食物。准备新的育肥管并在开始产蛋监测活动之前称重。将旧管换成新管，并在处理旧管子之前称量旧管子。将喂食管和未消耗饮食的最终重量与同一管子的重量进行比较，以估计饮食消耗。每天检查一次，以确保进纸器永远不会是空的。如果喂食管是空的或接近空的，请将其取出，重新填充，记录试管前后的重量，并将差额添加到QMC的两天饮食消耗总量中。在QMC实验的选定时间点，如前所述，从QMC中取出含有新鲜产卵的电子学习产品，但不要将鸡蛋从电子学习产品中移走。首先用PCR板密封覆盖ELP，然后用通用微孔板盖住ELP，并将其放入具有饱和硫酸钾溶液的干燥器内。从QMC移除电子学习产品后约78小时评估孵化率。细胞底部的C形幼虫表明孵化事件成功。如果QMC中充满了多余的工人，请在实验过程中的选定时间点对工蜂进行采样，以评估治疗引起的生理变化。在取样之前，在电子学习产品与QMC内部之间放置一块门板，然后取下电子学习用品。小心地将门板从笼子的底部抬起约0.5厘米，然后使用羽量级镊子从QMC内部取出一只工蜂。对于基因表达分析，将蜜蜂快速冷冻在液氮中，并将其储存在80摄氏度。保存收集的蜜蜂进行后续分析，并重复此过程，直到收集到所需数量的样品。通过实施泊松对数线性广义估计方程和自回归相关矩阵，评估日产卵计数中与膳食吡虫啉治疗相关的变化。鉴于花粉补充剂和蔗糖含有50十亿分之一的吡虫啉，QMC的每日产卵量显着降低。在蔗糖和花粉补充剂中施用吡虫啉治疗的每个QMC中产生的卵总数上观察到剂量依赖性效应。QMC中观察到的减少量最大，喂养了50十亿分之五的吡虫啉，其次是十亿分之10的花粉补充剂和蔗糖。在对照组和仅喂食十亿分之10吡虫啉和花粉补充剂的QMC之间没有观察到总产卵的差异。花粉补充剂，水和蔗糖的消耗量每48小时记录一次，持续10或12天。随着实验的进展，蔗糖的每日消费率显着增加，但花粉补充剂的消费率下降。当仅在花粉补充剂中施用十亿分之10吡虫啉时，观察到花粉消耗率较高。当10或50个十亿分之一的花粉补充剂和蔗糖溶液一起施用时，该比率降低。使用日龄蜜蜂对于确保女王的接受度和减少工人过度重新激活至关重要。同样关键的是，要小心处理蜂王，并将笼子保持在稳定的环境中。

Research

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