다세포 시스템을 제어하는 신호 전달 경로는 동적입니다. 이러한 역학의 기능을 이해하려면 전체 신호 활동에 영향을 미치지 않고 이러한 역학을 미묘하게 변조 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아 개발에서 신호 진동의 기능적 해부를 허용하는 미세 유체 시스템을 사용합니다.
신호 역학은 성인 조직을 포함한 많은 조직에서 발견되었습니다. Microfluidics는 세포, 조직 및 오가노이드 배양을 포함한 많은 모델 시스템에 맞게 조정할 수있는 다목적 도구입니다. 시작하기 위해, 중합을 유도하기 위해 단량체와 촉매를 아홉 대 일 비율로 혼합함으로써 필요한 양의 PDMS를 준비한다.
일회용 도구를 사용하고 혼합이 제대로 이루어 졌는지 확인하십시오. PDMS 혼합물을 데시케이터에 넣고 약 30분 동안 진공을 적용하여 공기를 제거한다. 약 3 ~ 5 밀리미터의 PDMS 층을 칩 몰드에 붓고 약 30 분 동안 데시케이터에 다시 넣으십시오.
금형 재료에 따라 섭씨 65도 이하에서 하룻밤 사이에 오븐에 넣어 금형을 치료하십시오. 메스를 사용하여 칩을 금형에서 잘라냅니다. 펀치 입구 및 출구 구멍은 미세 유체 챔버의 내부에서 시작하는 하나의 밀리미터 생검 펀치로 시작됩니다.
유리 슬라이드를 압축 공기로 청소하십시오. 칩을 유리 슬라이드에 결합하려면 칩과 유리 슬라이드를 측면이 위를 향하도록 접착할 수 있도록 플라즈마 오븐에 넣습니다. 사용 된 기계에 특정한 프로토콜을 사용하여 플라즈마를 생성 한 다음 활성화 된 표면을 서로 배치하고 압력을 고르게 가하여 칩을 유리에 결합하십시오.
실험용 튜빙 및 칩을 제조하기 위해, 튜빙을 45도 각도로 절단하고 각각의 튜빙에 하나의 바늘을 부착한다. 바늘, 칩 및 플러그가있는 튜브를 접시에 넣고 약 15 분 동안 자외선에 노출시켜 살균하십시오. 칩을 피브로넥틴으로 코팅하려면, 실온에서 PBS와 1%페니실린 또는 스트렙토마이신을 함유하는 비이커에 칩을 넣는다.
칩을 PBS로 플러시하여 P200 피펫으로 공기를 제거합니다. 칩의 각 챔버에 대해 세 밀리리터 주사기를 로드합니다. 피브로넥틴이 들어있는 주사기에 바늘을 부착하고 주사기를 주사기 펌프에 연결하십시오.
수동으로 플러시 튜브를 사용하여 공기를 제거하십시오. 칩의 출구에 콘센트 튜브를 부착하십시오. 튜브를 바닥까지 끝까지 밀고 칩을 코팅하기 위해 낮은 유량을 설정하십시오.
주사기 펌프를 적어도 두 시간 또는 하룻밤 동안 작동시키십시오. 끝나면 펌프를 멈추고 바늘 바로 뒤에 튜브를 차단하십시오. 실험을 위한 배지로 채워진 주사기를 준비하고, PBS 내에서 배양 배지 및 칩 둘 다를 탈기시킨다.
칩에서 대부분의 기포를 내뿜거나 빨아 들인 다음 펌프에 주사기를 설치하고 주사기에 입구 튜브를 부착하십시오. 조직을 칩에 적재하려면 꼬리의 가장 뒤쪽 끝을 해부하십시오. 칩을 배양 배지로 플러시하여 25 마이크로몰 HEPES로 PBS를 제거하였다.
P200 피펫을 사용하여 조직을 칩에 로드합니다. 각 조직 로딩 단계 후에, PDMS 충전된 튜빙의 조각을 사용하여 상응하는 조직 로딩 입구를 닫는다. 미세유체 설정을 조립하려면 내부에 기포가 생기지 않고 튜브를 미세유체 칩에 부착하십시오.
이렇게하려면 튜브 끝에 배지 한 방울이 있는지 확인하십시오. 모든 튜브가 칩에 부착되면 비이커에서 꺼내어 젖은 티슈가 들어있는 접시에 넣으십시오. 접시와 약 1.5 미터의 입구 튜브를 하룻밤 배양을위한 인큐베이터에 넣으십시오.
배양 중 기포가 형성되지 않도록 높은 습도를 확보하십시오. 대안으로, 칩의 외부를 건조시키고 현미경 홀더에 넣은 다음, 라이브 이미징 실험을 위해 거꾸로 된 현미경의 인큐베이션 챔버 내부에 홀더와 약 1.5 미터의 입구 튜브를 넣는다. 적어도 20분의 일정한 흐름 후에, 실험을 위해 계획된 펌핑을 시작한다.
분절된 마우스 배아에서 노치 신호전달을 훈련시키려면, 실험이 끝날 때까지 100분 배지 및 30분 동안 반복되는 약물 펄스의 펌핑 프로그램을 사용하여, 전형적으로 24시간 동안 반복한다. 실시간 이미징의 경우 최소 30분 후에 이미징을 시작합니다. 신호 진동의 동반을 확인하기 위해 여러 실험이 약물 펄스의 타이밍을 사용하여 정렬되고 캐스케이드 블루 염료로 시각화됩니다.
정량화된 진동은 추세를 낮추고 평균으로 표시할 수 있으며 진동의 표준 편차 또는 위상을 계산할 수 있습니다. 독립적인 후부 배아 배양물의 진동과 외부 약물 펄스 사이의 위상 관계가 분석될 수 있다. 동반을 확인하기 위해, 예를 들어 파이썬 기반 프로그램 pyBOAT를 사용하여 내인성 신호 진동의 기간을 결정할 수 있습니다.
130분의 주기로 펄스를 적용할 때, 노치 신호 진동은 또한 130분의 기간을 나타낸다. 미세 유체 실험 중에 액체의 증발을 방지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 중간 흐름을 방해하는 기포가 칩에 형성됩니다.
이를 방지하려면 배지와 칩을 탈기하고 인큐베이터의 습도가 충분히 높은지 확인하십시오. 이 방법을 사용하여, 신호전달 역학은 변조될 수 있고, 그 효과는 형광 리포터의 실시간 이미징, 면역염색, 또는 계내 혼성화에 의해 분석될 수 있다. 또한, 조직은 또한 추가 분석을 위해 칩으로부터 추출될 수 있다.
이 방법을 사용하여 배아 발달에서 신호 진동의 기능을 연구 할 수 있습니다. 마우스 배아의 분절화를 위한 두 개의 진동 신호전달 경로 사이의 위상 이동의 중요성을 입증하기 위해 적용되었다. 보다 일반적으로, 이제 다세포 시스템에서 동적 시그널링 코딩의 메카니즘을 해부하는데 사용될 수 있다.
