Signalveier som styrer multicellulære systemer er dynamiske. For å forstå funksjonen til disse dynamikkene, er det viktig å kunne modulere disse dynamikkene subtilt uten å påvirke den generelle signalaktiviteten. Denne protokollen bruker et mikrofluidisk system som muliggjør funksjonell disseksjon av signaloscillasjoner i utviklingen av museembryoer.
Signaldynamikk har blitt funnet i mange vev, inkludert voksne. Mikrofluidikk er et allsidig verktøy som kan tilpasses mange modellsystemer, inkludert celle-, vevs- og organoidkulturer. Til å begynne med, forberede den nødvendige mengden PDMS ved å blande monomeren med katalysatoren i et ni-til-en-forhold for å indusere polymerisering.
Bruk engangsverktøy og sørg for at blandingen oppnås riktig. Plasser PDMS-blandingen i en tørkeapparat og påfør vakuum i ca. 30 minutter for å fjerne luft. Hell et PDMS-lag på omtrent tre til fem millimeter i sponformen og legg tilbake i tørkeapparatet i ca. 30 minutter.
Herd formen ved å plassere den i en ovn over natten ved 65 grader Celsius eller lavere avhengig av formmaterialet. Klipp brikken ut av formen ved hjelp av en skalpell. Stans innløps- og utløpshull med en millimeter biopsistans som starter fra innsiden av mikrofluidisk kammer.
Rengjør glasssklie med trykkluft. For å binde brikken til glasssklie, plasser brikken og glasset gli inn i plasmaovnen med sidene som skal bindes vendt opp. Generer plasma ved hjelp av protokollen som er spesifikk for den brukte maskinen, og bind deretter brikken til glasset ved å plassere de aktiverte overflatene på hverandre og påføre trykket jevnt.
For å forberede slangen og brikken til eksperimentet, kutt slangen i en 45 graders vinkel og fest en nål til hver av slangene. Plasser slangen med nåler, brikken og pluggene i en tallerken og steriliser dem ved å utsette for ultrafiolett lys i ca. 15 minutter. For å belegge brikken med fibronectin, legg brikken i et beger som inneholder PBS pluss 1% penicillin eller streptomycin ved romtemperatur.
Skyll brikken med PBS for å fjerne luft med en P200 pipette. Legg en tre milliliter sprøyte for hvert kammer på brikken. Fest kanylen til sprøyten som inneholder fibronektin, og koble sprøyten til sprøytepumpen.
Skyll slangen manuelt for å fjerne luft. Fest utløpsslangen til utløpet på brikken. Sørg for å skyve slangen helt til bunnen og angi en lav strømningshastighet for å belegge brikken.
La sprøytepumpen gå i minst to timer eller over natten. Når du er ferdig, stopp pumpen og kutt av slangen rett etter nålen. Forbered sprøyter fylt med mediet for eksperimentet og degas både kulturmediet og brikken i PBS.
Prøv å skylle ut eller suge opp de fleste luftboblene fra brikken, installer deretter sprøyter i pumpene og fest innløpsslangen til sprøytene. For å laste vev på brikken, disseker den mest bakre spissen av halen. Skyll brikken med kulturmedium med 25 mikromolar HEPES for å fjerne PBS.
Legg vevet i brikken ved hjelp av en P200 pipette. Etter hvert vevsbelastningstrinn lukker du det tilsvarende vevsbelastningsinntaket ved hjelp av et stykke PDMS-fylt rør. For å montere det mikrofluidiske oppsettet, fest slangen til mikrofluidisk chip uten å få luftbobler inni.
For å gjøre det, sørg for at det er en dråpe medium til stede på slutten av slangen. Når all rør er festet til brikken, ta den ut av begeret og legg det i en tallerken som inneholder et vått vev. Sett parabolen og ca 1,5 meter innløpsrør i en inkubator for nattkultur.
Sørg for høy luftfuktighet for å forhindre dannelse av luftbobler under kultur. Alternativt kan du tørke utsiden av brikken og plassere den i en mikroskopholder, legg deretter holderen og ca. 1,5 meter innløpsrør inne i inkubasjonskammeret til et invertert mikroskop for et levende bildebehandlingseksperiment. Etter minst 20 minutter med konstant strømning, start den planlagte pumpingen for eksperimentet.
For å få signaler i segmentering av museembryo, bruk et pumpeprogram på 100 minutter middels og 30 minutter narkotikapulser gjentatt til slutten av eksperimentet, vanligvis i 24 timer. For sanntidsbilder begynner du å forestille deg etter minst 30 minutter. For å bekrefte entrainment av signal svingninger, flere eksperimenter er justert ved hjelp av tidspunktet for stoffet pulser og visualisert med Cascade Blue fargestoff.
Kvantifiserte svingninger kan dettones og vises som gjennomsnittlige og standardavvik eller faser av svingningene kan beregnes. Faseforholdet mellom svingninger av uavhengige bakre embryokulturer til hverandre og til de eksterne legemiddelpulsene kan analyseres. For å bekrefte entrainment, kan man for eksempel bestemme perioden for endogene signaloscillasjoner ved hjelp av Python-baserte programmet pyBOAT.
Ved påføring av pulser med en periode på 130 minutter viser hakksignalerende svingninger også en periode på 130 minutter. Det er viktig å forhindre fordampning av væske under mikrofluidisk eksperiment. Ellers vil luftbobler dannes i brikken som forstyrrer middels strømning.
For å forhindre dette, degas mediet og brikken og sørg for at fuktigheten i inkubatoren er høy nok. Ved hjelp av denne metoden kan signaldynamikk moduleres, og effektene deres kan analyseres ved sanntidsavbildning av fluorescerende reportere, immunoppfatninger eller in situ hybridisering. Videre kan vevet også ekstraheres fra brikken for videre analyse.
Man kan bruke denne metoden til å studere funksjonen til å signalisere svingninger i embryonal utvikling. Det ble brukt for å demonstrere viktigheten av faseskiftet mellom to oscillerende signalveier for segmentering av museembryoet. Mer generelt kan den nå brukes til å dissekere mekanismen for dynamisk signalkoding i multicellulære systemer.
