Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل F31 HL143873-01 (WBL) ، R01 HL125371 (RJL و EPS)

تم الحصول على جميع العينات البيولوجية التي تم تحليلها في هذا البروتوكول من الفئران، بموجب بروتوكولات وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كولورادو.
1. عزل كبريتات الهيباران
<ol><li>تهذي عينات الأنسجة ملاحظة: Delipidation هو خطوة اختيارية للأن...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

تلعب مجموعات GAGs دورا مركزيا في العديد من العمليات البيولوجية المتنوعة. واحدة من الوظائف الرئيسية لغاغات كبريتات (مثل HS و CS) هو التفاعل مع وربط ليغاندس، والتي يمكن أن تغير وظائف الإشارات المصب. محدد مهم لتقارب GAG ملزمة لgnate ligands هو طول سلسلة البوليمر GAG 8،9،</s...

الجليكوسامينوغليكان (GAGs) هي عائلة متنوعة من السكريات الخطية التي هي عنصر في كل مكان في الكائنات الحية وتساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية1. ويمكن كبريتات GAGs مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) في مواقع متميزة على طول سلسلة البوليساكريد ، مما يضفي مجالات جغرافية من الشحنة السلبية. هذه GAGs، عندما المربوطة إلى البروتينات سطح الخلية المعروفة باسم البروتيوغليكان، المشروع في الفضاء خارج الخلية وربط ليغاندس cognate، مما يسمح لتنظيم كل من رابطة الدول المستقلة- (ligand تعلق على نفس الخلية) وعبر -(ligand تعلق على الخلية المجاورة) عمليات الإشارة2. وعلاوة على ذلك، GAGs أيضا أداء الأدوار الحاسمة كعناصر هيكلية في الأنسجة مثل غشاء الطابق السفلي الكبيبي3،والغليكولايل البطانيةالوعائية 4 والظهارية الرئوية الجليكوكاليك5،وفي الأنسجة الضامة مثل الغضاريف6.
يختلف طول سلاسل الكمامات متعددة الشاريد بشكل كبير وفقا لسياقها البيولوجي ويمكن إطالته بشكل ديناميكي ، وتكبيله ، وتعديله بواسطة نظام تنظيمي أنزيمي معقد للغاية7. الأهم من ذلك ، فإن طول سلاسل البوليمر GAG يساهم بشكل كبير في تقاربها الملزم للليجاند ، وبالتالي ، إلى وظيفتها البيولوجية8،9. ولهذا السبب، فإن تحديد وظيفة GAG الداخلي يتطلب تقديرا لحجمها. لسوء الحظ ، على عكس البروتينات والأحماض النووية ، لا يوجد سوى عدد قليل جدا من التقنيات المتاحة بسهولة للكشف عن GAGs وقياسها ، مما أدى تاريخيا إلى تحقيق محدود نسبيا في الأدوار البيولوجية لهذه العائلة المتنوعة من السكريات المتعددة.
توضح هذه المقالة كيفية عزل وتنقية GAGs من معظم الأنسجة البيولوجية ، وتصف أيضا كيفية استخدام البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (PAGE) لتقييم طول البوليمرات المعزولة بدرجة معقولة من التحديد. وعلى النقيض من النهج الجليكومية الأخرى البالغة التعقيد (والتي غالبا ما تكون قائمة على قياس الطيف الكتلي)، يمكن استخدام هذه الطريقة باستخدام معدات وتقنيات مختبرية قياسية. ولذلك، فإن هذا النهج العملي قد يوسع قدرة المحققين على تحديد الدور البيولوجي لغاغس الأصلية وتفاعلها مع الليجاندات ذات الأهمية السياقية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

الكبريتات الجليكوسامينوغليكان (GAGs) مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) موجودة في كل مكان في الكائنات الحية وتلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات البيولوجية الأساسية. كما البوليمرات، GAGs موجودة كخليط متعدد الأضلاع التي تحتوي على سلاسل البوليساكريد التي يمكن أن تتراوح بين 4000 دا إلى أكثر من 40،000 دا. داخل هذه السلاسل توجد مجالات الكبريت، مما يمنح نمطا من الشحنة السلبية التي تسهل التفاعل مع بقايا مشحونة إيجابيا من ليغند البروتين cognate. يجب أن تكون المجالات الكبريتية من GAGs من طول كاف للسماح لهذه التفاعلات الكهربائية. لفهم وظيفة GAGs في الأنسجة البيولوجية ، يجب أن يكون المحقق قادرا على عزل وتنقية وقياس حجم GAGs. يصف هذا التقرير تقنية عملية ومتعددة الاستخدامات تعتمد على جل البولي أكريلاميد تعتمد على الكهروفورسيس والتي يمكن الاستفادة منها لحل الاختلافات الصغيرة نسبيا في الحجم بين GAGs المعزولة عن مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة البيولوجية.

يستخدم الأزرق الألسيان ل وصمة عار GAGs كبريتيد 10; يتم تضخيم هذه الإشارة باستخدام بقعة فضية لاحقة 11. الشكل 1 يوفر عرضا مرئيا لعملية تطوير تلطيخ الفضة. كما هو موضح، يتم تضخيم الإشارة الزرقاء الألسيان تمثل GAGs مفصولة الكهربائي كما وكيل النامية تخترق هلا?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.

الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

يصف هذا البروتوكول تقنية بسيطة يمكن استخدامها للكشف عن وجود وقياس طول الجليكوسامينوغليكان، وهي جزيئات ذات أهمية متزايدة للعديد من العمليات البيولوجية. هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة مع معظم مختبرات علوم الحياة. تقنيات الجليكومية المقارنة غالبا ما تتطلب المعدات والخبرات الموجودة فقط في مختبرات أبحاث الكيمياء الجليكوكيميائية.قد تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للباحثين المهتمين بدراسة الجليكوكاليك، وهو معطف متعدد السكريات يبطن السطوح البطانية والظهارية لجسم الإنسان. ابدأ بوضع كاسيت فارغ في خزان PAGE. يلقي هلام حل عن طريق خلط 10 ملليلتر من حل هلام مع 60 ميكرولتر من أعدت حديثا في 10٪ بيرسولفيت الأمونيوم في أنبوب 15 ملليلتر.ثم أضف 10 ميكرولترات من TEMED. عكس الأنبوب بلطف مرتين إلى ثلاث مرات. أضف بسرعة 10 ملليلترات من محلول هلام البولي أكريلاميد المنشط إلى الكاسيت باستخدام ماصة.تراكب مع اثنين من ملليلتر من المياه المصفاة deionized، والسماح للهلام حل لبوليمرة لمدة 30 دقيقة. بعد أن يبوليمر الجل الحل بالكامل ، تجاهل الماء المتراكب. يلقي هلام التراص عن طريق خلط ثلاثة ملليلتر من محلول هلام التراص مع 90 ميكرولتر من persulfate الأمونيوم المعدة حديثا 10٪ في أنبوب 15 ملليلتر.ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من TEMED وعكس الأنبوب بلطف مرتين إلى ثلاث مرات. استخدام ماصة لإضافة بسرعة حل هلام التراص على هلام حل صلبة حتى يتم تعبئة كاسيت إلى حافة. إدراج تماما المشط المدرجة مع كاسيت هلام البولي أكريلاميد فارغة والسماح للهلام التراص لبوليميراز لمدة 30 دقيقة.بمجرد أن يتم بلمرة الجل ، قم بإزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ووضع الكاسيت مرة أخرى في تجميع خزان PAGE. املأ الغرف العلوية والسفلية بحلول المخزن المؤقت المعنية. حل عينات الجليكوسامينوغليكان المجففة في الحد الأدنى من الحجم اللازم من المياه المصفاة deionized وخلط مع عينة تحميل العازلة في نسبة واحد إلى واحد.تحميل العينات وسلالم Oligosaccharide HS في هلام. قم بتشغيل الجل لمدة خمس دقائق عند 100 فولت، ثم قم بتشغيله عند 200 فولت لمدة 20 إلى 100 دقيقة، اعتمادا على نسبة الأكريلاميد من محلول الجل الحل. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بتفكيك الكاسيت واستخراج الجل بعناية في حاوية نظيفة كبيرة مليئة بالماء المصفاة deionized.ثم تجاهل الماء وصمة عار الجل في محلول تلطيخ الأزرق Alcian لمدة خمس دقائق. تجاهل البقعة الزرقاء الألسيان، ويغسل بسرعة مرتين إلى ثلاث مرات مع المياه المصفاة deionized حتى تمت إزالة معظم محلول تلطيخ الأزرق Alcian. لطخ الجل في محلول تلطيخ نترات الفضة في وعاء نظيف طازج لمدة 30 دقيقة.ثم يغسل مرتين إلى ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في المياه المصفاة deionized لإزالة تماما محلول تلطيخ الفضة. تجاهل الماء وإضافة حل النامية. مراقبة بعناية هلام لظهور العصابات.اعتمادا على نوعية وصمة عار وكتلة العينة المحملة، يمكن أن يستغرق التطوير في أي مكان من بضع ثوان إلى عدة دقائق. بمجرد أن تكون العصابات المطلوبة مرئية ، تجاهل على الفور الحل النامي وغسل الجل لفترة وجيزة مع حل STOP. تم تصور الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمنقورة باستخدام تقنية تلطيخ الأزرق والفضة الألسيان بعد دقة تعتمد على الكثافة بواسطة إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد.كما رأينا في هذا الشكل، كانت كبريتات الهيباران oligosaccharides من أطوال البوليمر المختلفة يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام هذا النهج القائم على PAGE. ويبين الحد الأقصى للكشف عن هذه الطريقة، التي لا تبلغ 0.5 ميكروغرام، أن هذه التقنية حساسة للغاية في الكشف عن الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمطهرة من العينات البيولوجية. من بين أربعة من كبريتات الهيبارين المختلفة التي تصورها أوليغوساكاريد باستخدام هذه الطريقة، كان الهيبارين غير المفرخ أقل قابلية للكشف بسهولة.نظرا لتعدد أضلاع الهيبارين غير المفرخ ، فإن كثافة كل نطاق فردي من هذه العينة أقل من النطاقات التي تنتجها كتلة متساوية من أوليغوساكاريد الهيبارين النقي. تم تقييم كفاءة تنقية الجليكوسامينوغليكان من العينات البيولوجية السائلة باستخدام عينات الحمم الهوائية التي تم جمعها من الفئران ، والتي كانت تحتوي في الأصل على تركيزات منخفضة نسبيا من الجليكوسامينوغليكان. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات نجاح هذه التقنية باستخدام كبريتات الهيبارين المعزولة عن متجانسة الرئة بأكملها ، والتي أسفرت عن كمية وافرة من كبريتات الهيبارين المعزولة ، مع أصغر الشظايا تساوي حوالي 10 وحدات فرعية من التفكيك في الكتلة.من المهم جدا استخدام الكواشف الطازجة، وتصفية كل كاشف يستخدم في هذا البروتوكول. من المهم استخدام الكواشف ذات أعلى درجة من النقاء والجودة لتنفيذ هذه التقنية بنجاح.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

صب وتشغيل جل البروتين عن طريق إعادة استخدام شرائط التجاري

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...