Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)

Alle biologiske prøver analyseret i denne protokol blev fremstillet fra mus, under protokoller godkendt af University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfat isolation
<ol><li>Delipidation af vævsprøver BEMÆRK: Delipidation er et valgfrit skridt for fedt-rige væv.<ol>
<li>Lav en 1:1 blanding af methanol og dichlormethan. Der fremstilles ca. 500 μL pr. prøve. større stykker væv kan kræve op til 1 mL.</li>
		<li>Placer hver vævs...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

Gag'er spiller en central rolle i mange forskellige biologiske processer. En af de vigtigste funktioner i sulfattede GAG'er (såsom HS og CS) er at interagere med og binde sig til ligands, som kan ændre downstream-signalfunktioner. En vigtig faktor for GAG-bindende affinitet til cognate ligands er længden af GAG polymerkæden 8,9,14. Derfor er det vigtigt for forskere med rimelig præcision at kunne definere størrelsen af GAG...

Glycosaminoglycans (GAGs) er en forskelligartet familie af lineære polysaccharider, der er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrager til mange grundlæggende fysiologiske processer1. GAG'er som heparansulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) kan sulfateres i forskellige positioner langs polysaccharidkæden, der giver geografiske domæner af negativ ladning. Disse GAGs, når tøjret til celle-overflade proteiner kendt som proteoglycaner, projekt i ekstracellulære rum og binde sig til cognate ligands, giver mulighed for regulering af både cis- (ligand knyttet til den samme celle) og trans- (ligand knyttet til nabocelle) signalering processer2. Desuden udfører GAG'er også kritiske roller som strukturelle elementer i væv som den glomerulære kældermembran3, den vaskulære endotelglyks4 og lungeehelleleglyks5og i bindevæv sådan brusk6.
Længden af GAG polysaccharidkæder varierer betydeligt alt efter dens biologiske kontekst og kan forlænges dynamisk, spaltes og ændres af et meget komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Det er vigtigt, at længden af GAG-polymerkæder bidrager væsentligt til deres bindende affinitet for ligands og efterfølgende til deres biologiske funktion8,9. Af denne grund kræver bestemmelse af funktionen af en endogen GAG en vurdering af dens størrelse. Desværre findes der i modsætning til proteiner og nukleinsyrer meget få let tilgængelige teknikker til at opdage og måle GAG'er, hvilket historisk har resulteret i relativt begrænset undersøgelse af de biologiske roller i denne forskelligartede polysaccharidfamilie.
Denne artikel beskriver, hvordan man isolerer og renser GAGs fra de fleste biologiske væv, og beskriver også, hvordan man bruger polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) til at vurdere længden af de isolerede polymerer med en rimelig grad af specificitet. I modsætning til andre, meget komplekse (og ofte massespektrometribaserede) glykomiske tilgange kan denne metode anvendes ved hjælp af standard laboratorieudstyr og -teknikker. Denne praktiske tilgang kan derfor udvide efterforskernes evne til at bestemme den biologiske rolle, som indfødte GAG'er spiller, og deres interaktion med kontekstuelt vigtige ligands.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Sulfat glycosaminoglycans (GAGs) såsom heparan sulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en afgørende rolle i en række grundlæggende biologiske strukturer og processer. Som polymerer findes GAG'er som en polydisperseblanding, der indeholder polysaccharidkæder, der kan variere fra 4000 Da til langt over 40.000 Da. Inden for disse kæder findes områder af sulfatering, hvilket giver et mønster af negativ ladning, der letter interaktionen med positivt ladede rester af cognate protein ligands. Sulfaterede områder af GAG'er skal være af tilstrækkelig længde til at muliggøre disse elektrostatiske interaktioner. For at forstå funktionen af GAGs i biologiske væv, investigator skal være i stand til at isolere, rense, og måle størrelsen af GAGs. Denne rapport beskriver en praktisk og alsidig polyacrylamidgel elektroforese-baseret teknik, der kan udnyttes til at løse relativt små forskelle i størrelse mellem GAGs isoleret fra en række biologiske vævstyper.

Alcian blå bruges til at plette sulfat ggs 10; dette signal forstærkes ved brug af en efterfølgende sølvplet 11. Figur 1 giver en visuel demonstration af udviklingen af sølvfarvningsprocessen. Som det fremgår, forstærkes det Alciske blå signal, der repræsenterer GAG'er adskilt af elektroforese, efterhånden som det udviklende middel trænger ind i polyacrylamidgelen. Typisk vil udviklingsprocessen reducere sølv og Alcian blå-farvede ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Denne rapport beskriver teknikker til at isolere og rense sulfat glycosaminoglycaner (GAGs) fra biologiske prøver og en polyacrylamidgelelektroforesetilgang for at tilnærme deres størrelse. GAG'er bidrager til vævsstruktur og påvirker signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer længde bidrager til deres bindende affinitet for cognate ligands.

Påvisning af glykosaminoglykaner ved polyacrylamidgelelektroforese og sølvfarvning

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Denne protokol beskriver en simpel teknik, der kan bruges til at opdage tilstedeværelsen og måle længden af glycosaminoglycans, som er molekyler af stadig mere anerkendt betydning for mange biologiske processer. Denne teknik er let at tilpasse sig de fleste life science laboratorier. Sammenlignelige glykomiske teknikker kræver ofte udstyr og ekspertise, der kun findes i glykokemiforskningslaboratorier.Denne teknik kan være særlig nyttig for forskere, der er interesseret i at studere glycocalyx, en polysaccharid frakke, der linjer endotel og epitel overflader af den menneskelige krop. Start med at placere en tom kassette i SIDE-tanken. Støbt en opløsningsgel ved at blande 10 milliliter opløsning af gelopløsning med 60 mikroliter frisklavet ved 10% ammoniumpersulfat i et 15 milliliterrør.Tilføj derefter 10 mikroliter TEMED. Vend røret forsigtigt to til tre gange. Tilsæt hurtigt 10 milliliter af den aktiverede polyacrylamidgelopløsning til kassetten ved hjælp af en pipette.Overlejring med to milliliter deioniseret filtreret vand, og lad opløsningsgelen polymerisere i 30 minutter. Når den opløsningsgel er fuldt polymeriseret, skal du kassere det overlejrede vand. Støbt stabling gel ved at blande tre milliliter af stabling gel opløsning med 90 mikroliter af frisklavet 10% ammonium persulfat i en 15 milliliter rør.Tilsæt derefter tre mikroliter TEMED og vend røret forsigtigt to til tre gange. Brug en pipette til hurtigt at tilføje stabling gel opløsning over størknet opløsning gel, indtil kassetten er fyldt til randen. Sæt kammen, der følger med den tomme polyacrylamidgelkassette, helt, og lad stablingsgelen polymerisere i 30 minutter.Når gelen er polymeriseret, skal du fjerne båndstrimlen fra bunden af kassetten og placere kassetten tilbage i SIDE-tankens samling. Fyld de øvre og nedre kamre med de respektive bufferløsninger. Udgryd tørrede glykosaminoglycanprøver i det minimum, der er nødvendigt, af deioniseret filtreret vand, og blandes med prøvebelastningsbuffer i et en-til-en-forhold.Læg prøverne og HS-oligosaccharidstigen ind i gelen. Prerun gelen i fem minutter ved 100 volt, derefter køre det på 200 volt i 20 til 100 minutter, afhængigt af acrylamid procent af opløsningen gel løsning. Når løbet er færdigt, demontere kassetten og forsigtigt udtrække gelen i en stor ren beholder fyldt med deioniseret filtreret vand.Kassér derefter vandet og pletter gelen i Alcian blå farvningsopløsning i fem minutter. Kassér den alciske blå plet, og vask hurtigt to til tre gange med deioniseret filtreret vand, indtil det meste af den alciske blå farvningsopløsning er fjernet. Plet gelen i sølvnitrat farvning opløsning i en frisk ren beholder i 30 minutter.Vask derefter to til tre gange i 30 minutter hver i deioniseret filtreret vand for fuldt ud at fjerne sølvfarvningsopløsningen. Kassér vandet og tilsæt udviklende opløsning. Hold forsigtigt gelen for udseendet af bands.Afhængigt af kvaliteten af pletten og massen af den indlæste prøve kan udviklingen tage alt fra et par sekunder til flere minutter. Så snart de ønskede bånd er synlige, skal du straks kassere udviklingsopløsningen og vaske gelen kort med STOP-opløsning. De isolerede og rensede glykosaminoglycaner blev visualiseret ved hjælp af Alcian blå og sølv farvning teknik efter densitet afhængig opløsning af en polyacrylamid gel elektroforese.Som det ses i denne figur, heparan sulfat oligosaccharider af forskellige polymer længder var let påvises ved hjælp af denne SIDE baseret tilgang. Grænsen for påvisning af denne metode, så lavt som 0,5 mikrogram, viser, at teknikken er meget følsom ved påvisning af glycosaminoglycans isoleret og renset fra biologiske prøver. Af de fire forskellige heparin sulfat oligosaccharider visualiseret ved hjælp af denne metode, unfraktioneret heparin var mindst let påvises.På grund af polydispersiteten af ufraktioneret heparin er tætheden af hvert enkelt bånd fra denne prøve lavere end de bånd, der produceres af en lige stor masse af rensede heparin oligosaccharider. Effektiviteten af glycosaminoglycan rensning fra flydende biologiske prøver blev vurderet ved hjælp af bronchoalveolar lavage prøver indsamlet fra mus, som oprindeligt indeholdt relativt lave koncentrationer af glycosaminoglycans. Derudover blev succesen af denne teknik demonstreret ved hjælp af heparin sulfat isoleret fra hele lunge homogenat, som gav en rigelig mængde isolerede heparin sulfat, med de mindste fragmenter svarende til ca 10 disaccharid underenheder i masse.Det er meget vigtigt at bruge frisklavede reagenser og filtrere alle reagenser, der bruges i denne protokol. Det er vigtigt at bruge reagenser af højeste renhed og kvalitet til at udføre denne teknik.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Hælde og køre en proteingel ved at genbruge Commercial Kassetter

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese til adskillelse af DNA fragmenter

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Fremstilling af DNA-tværbundet polyacrylamid Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...