Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL en EPS)

Alle biologische monsters die in dit protocol werden geanalyseerd, werden verkregen van muizen, volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparansulfaat isolatie
<ol><li>Delipidatie van weefselmonsters OPMERKING: Delipidatie is een optionele stap voor vetrijke weefsels.<ol>
<li>Maak een 1:1 mengsel van methanol en dichloormethaan. Bereid ongeveer 500 μL per monster; grotere stukken weefsel kunn...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAG's spelen een centrale rol in veel verschillende biologische processen. Een van de belangrijkste functies van gesulfateerd GAG's (zoals HS en CS) is om te interageren met en te binden aan liganden, die stroomafwaartse signaleringsfuncties kunnen veranderen. Een belangrijke determinant van GAG-bindingsaffiniteit aan verwante liganden is de lengte van de GAG-polymeerketen 8,9,14. Om deze reden is het belangrijk voor onderzoeker...

Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een diverse familie van lineaire polysacchariden die een alomtegenwoordig element zijn in levende organismen en bijdragen aan vele fundamentele fysiologische processen1. GAG's zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) kunnen op verschillende posities langs de polysaccharideketen worden gesulfateerd, waardoor geografische domeinen van negatieve lading worden overgedragen. Deze GAG's, wanneer ze worden vastgebonden aan celoppervlakeiwitten die bekend staan als proteoglycanen, projecteren in de extracellulaire ruimte en binden aan verwante liganden, waardoor de regulatie van zowel cis- (ligand gehecht aan dezelfde cel) als trans- (ligand gehecht aan naburige cel) signaleringsprocessen mogelijk is2. Bovendien vervullen GAG's ook kritieke rollen als structurele elementen in weefsels zoals het glomerulaire keldermembraan3,de vasculaire endotheelglyx4 en pulmonale epitheliale glycocalyx5, en in bindweefsels zoals kraakbeen6.
De lengte van GAG-polysaccharideketens varieert aanzienlijk afhankelijk van de biologische context en kan dynamisch worden verlengd, gesplitst en gewijzigd door een zeer complex enzymatisch regulerend systeem7. Belangrijk is dat de lengte van GAG-polymeerketens substantieel bijdraagt aan hun bindingsaffiniteit voor liganden en vervolgens aan hun biologische functie8,9. Om deze reden vereist de bepaling van de functie van een endogene GAG waardering van de grootte ervan. Helaas bestaan er, in tegenstelling tot eiwitten en nucleïnezuren, zeer weinig direct beschikbare technieken om GAG's te detecteren en te meten, wat historisch heeft geresulteerd in relatief beperkt onderzoek naar de biologische rollen van deze diverse polysaccharidefamilie.
Dit artikel beschrijft hoe GAG's uit de meeste biologische weefsels kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en beschrijft ook hoe polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) kan worden gebruikt om de lengte van de geïsoleerde polymeren met een redelijke mate van specificiteit te evalueren. In tegenstelling tot andere, zeer complexe (en vaak op massaspectrometrie gebaseerde) glycomische benaderingen, kan deze methode worden gebruikt met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en -technieken. Deze praktische benadering kan daarom het vermogen van onderzoekers uitbreiden om de biologische rol van inheemse GAG's en hun interactie met contextueel belangrijke liganden te bepalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) zijn alomtegenwoordig in levende organismen en spelen een cruciale rol in een verscheidenheid aan fundamentele biologische structuren en processen. Als polymeren bestaan GAG's als een polydisperse mengsel met polysaccharideketens die kunnen variëren van 4000 Da tot ruim 40.000 Da. Binnen deze ketens bestaan domeinen van sulfatie, die een patroon van negatieve lading verlenen dat interactie met positief geladen residuen van verwante eiwitliganden vergemakkelijkt. Gesulfateerde domeinen van GAG's moeten voldoende lang zijn om deze elektrostatische interacties mogelijk te maken. Om de functie van GAG's in biologische weefsels te begrijpen, moet de onderzoeker in staat zijn om de grootte van GAG's te isoleren, te zuiveren en te meten. Dit rapport beschrijft een praktische en veelzijdige polyacrylamide gel elektroforese-gebaseerde techniek die kan worden gebruikt om relatief kleine verschillen in grootte tussen GAG's geïsoleerd uit een verscheidenheid aan biologische weefseltypen op te lossen.

Alcian blauw wordt gebruikt om gesulfateerd GAGs 10te kleuren; dit signaal wordt versterkt door het gebruik van een volgende zilvervlek 11. Figuur 1 geeft een visuele demonstratie van het ontwikkelingsproces van zilverkleuring. Zoals aangetoond, wordt het Alcian blauwe signaal dat GAG's vertegenwoordigt, gescheiden door elektroforese, versterkt naarmate het zich ontwikkelende middel de polyacrylamide-gel binnendringt. Typisch, het ontwikkelings...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Dit protocol beschrijft een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om de aanwezigheid te detecteren en de lengte van glycosaminoglycanen te meten, moleculen van steeds meer erkende betekenis voor veel biologische processen. Deze techniek is gemakkelijk aan te passen aan de meeste life science laboratoria. Vergelijkbare glycomische technieken vereisen vaak apparatuur en expertise die alleen te vinden zijn in glycochemische onderzoekslaboratoria.Deze techniek kan vooral nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de glycocalyx, een polysaccharidelaag die de endotheel- en epitheliale oppervlakken van het menselijk lichaam bekleedt. Begin met het plaatsen van een lege cassette in de PAGE-tank. Giet een oplossende gel door 10 milliliter oplossende geloplossing te mengen met 60 microliter vers bereid met 10% ammoniumperssulfaat in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens 10 microliter TEMED toe. Keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Voeg snel 10 milliliter van de geactiveerde polyacrylamide-geloplossing toe aan de cassette met behulp van een pipet.Overlay met twee milliliter gedeioniseerd gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren. Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg. Giet de stapelgel door drie milliliter stapelgeloplossing te mengen met 90 microliter vers bereid 10% ammoniumpersulfaat in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens drie microliter TEMED toe en keer de buis twee tot drie keer voorzichtig om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen totdat de cassette tot de rand gevuld is. Plaats de kam die bij de lege polyacrylamide-gelcassette is meegeleverd volledig en laat de stapelgel gedurende 30 minuten polymeriseren.Zodra de gel is gepolymeriseerd, verwijdert u de tapestrip van de onderkant van de cassette en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage. Vul de bovenste en onderste kamers met de respectieve bufferoplossingen. Los gedroogde glycosaminoglycaanmonsters op in het minimaal noodzakelijke volume gedeïoniseerd gefilterd water en meng met monsterbelastingsbuffer in een één-op-één-verhouding.Laad de monsters en de HS oligosaccharide ladders in de gel. Laat de gel vijf minuten voorlopen op 100 volt en laat hem vervolgens 20 tot 100 minuten op 200 volt lopen, afhankelijk van het acrylamidepercentage van de oplossende geloplossing. Zodra de run is voltooid, demonteer je de cassette en haal je de gel voorzichtig uit in een grote schone container gevuld met gedeïoniseerd gefilterd water.Gooi vervolgens het water weg en kleur de gel gedurende vijf minuten in Alcian blue staining solution. Gooi de Alcian blauwe vlek weg en was snel twee tot drie keer met gedeioniseerd gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd. Kleur de gel in zilvernitraatkleuringsoplossing in een verse schone container gedurende 30 minuten.Was vervolgens twee tot drie keer gedurende 30 minuten elk in gedeioniseerd gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen. Gooi het water weg en voeg de ontwikkelingsoplossing toe. Observeer de gel zorgvuldig voor het verschijnen van banden.Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren. Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u de gel kort met STOP-oplossing. De geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen werden gevisualiseerd met behulp van Alcian blauwe en zilveren kleuringstechniek na dichtheidsafhankelijke resolutie door een polyacrylamidegelelektroforese.Zoals te zien is in deze figuur, waren heparansulfaat oligosacchariden van verschillende polymeerlengtes gemakkelijk detecteerbaar met behulp van deze op PAGE gebaseerde benadering. De detectiegrens van deze methode, zo laag als 0,5 microgram, laat zien dat de techniek zeer gevoelig is bij het detecteren van glycosaminoglycanen geïsoleerd en gezuiverd uit biologische monsters. Van de vier verschillende heparinesulfaat oligosacchariden die met deze methode werden gevisualiseerd, was ongefractioneerde heparine het minst gemakkelijk detecteerbaar.Vanwege de polydispersiteit van ongefractioneerde heparine is de dichtheid van elke individuele band uit dit monster lager dan de banden die worden geproduceerd door een gelijke massa gezuiverde heparine oligosacchariden. De efficiëntie van glycosaminoglycaanzuivering uit vloeibare biologische monsters werd beoordeeld met behulp van bronchoalveolaire lavagemonsters verzameld van muizen, die oorspronkelijk relatief lage concentraties glycosaminoglycanen bevatten. Bovendien werd het succes van deze techniek aangetoond met behulp van heparinesulfaat geïsoleerd uit hele longhomogenaat, wat een ruime hoeveelheid geïsoleerd heparinesulfaat opleverde, waarbij de kleinste fragmenten gelijk waren aan ongeveer 10 disacharide subeenheden in massa.Het is erg belangrijk om vers bereide reagentia te gebruiken en elk reagens dat in dit protocol wordt gebruikt te filteren. Het is van cruciaal belang om reagentia van de hoogste zuiverheid en kwaliteit te gebruiken om deze techniek met succes uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturerende gradiënt Gel Elektroforese (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...