Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
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Alle biologischen Proben, die in diesem Protokoll analysiert wurden, wurden von Mäusen gemäß Protokollen gewonnen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado genehmigt wurden.
1. Heparansulfat-Isolierung
<ol><li>Delipidierung von Gewebeproben HINWEIS: Die Delipidierung ist ein optionaler Schritt für fettreiche Gewebe.<ol>
<li>Stellen Sie eine 1:1-Mischung aus Methanol und Dichlormethan zusammen. Bereiten Sie etwa 500 μL pro Probe v...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAGs spielen eine zentrale Rolle in vielen verschiedenen biologischen Prozessen. Eine der Hauptfunktionen von sulfatierten GAGs (wie HS und CS) besteht darin, mit Liganden zu interagieren und an sie zu binden, was die nachgeschalteten Signalfunktionen verändern kann. Eine wichtige Determinante der GAG-Bindungsaffinität zu verwandten Liganden ist die Länge der GAG-Polymerkette 8,9,14. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Fors...

Glykosaminoglykane (GAGs) sind eine vielfältige Familie linearer Polysaccharide, die ein allgegenwärtiges Element in lebenden Organismen sind und zu vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beitragen1. GAGs wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) können an verschiedenen Positionen entlang der Polysaccharidkette sulfatiert werden, wodurch geografische Domänen negativer Ladung entstehen. Diese GAGs, wenn sie an Zelloberflächenproteine gebunden sind, die als Proteoglykane bekannt sind, projizieren in den extrazellulären Raum und binden an verwandte Liganden, was die Regulation sowohl der cis- (Liganden, der an dieselbe Zelle gebunden ist) als auch der trans- (Liganden, die an benachbarte Zellen gebunden sind) Signalprozesse ermöglichen2. Darüber hinaus spielen GAGs auch eine kritische Rolle als Strukturelemente in Geweben wie der glomerulären Basalmembran3,dem vaskulären endothelialen Glycocalyx4 und dem pulmonalen epithelialen Glycocalyx5und in Bindegeweben wie Knorpel6.
Die Länge von GAG-Polysaccharidketten variiert je nach biologischem Kontext erheblich und kann durch ein hochkomplexes enzymatisches Regulationssystem dynamisch verlängert, gespalten und modifiziert werden7. Wichtig ist, dass die Länge der GAG-Polymerketten wesentlich zu ihrer Bindungsaffinität für Liganden und anschließend zu ihrer biologischen Funktion beiträgt8,9. Aus diesem Grund erfordert die Bestimmung der Funktion eines endogenen GAG eine Wertschätzung seiner Größe. Leider gibt es im Gegensatz zu Proteinen und Nukleinsäuren nur sehr wenige leicht verfügbare Techniken zum Nachweis und zur Messung von GAGs, was in der Vergangenheit zu einer relativ begrenzten Untersuchung der biologischen Rollen dieser vielfältigen Polysaccharidfamilie geführt hat.
Dieser Artikel beschreibt, wie GAGs aus den meisten biologischen Geweben isoliert und reinigt werden, und beschreibt auch, wie man Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verwendet, um die Länge der isolierten Polymere mit einem angemessenen Grad an Spezifität zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen, hochkomplexen (und oft massenspektrometrischen) glykomischen Ansätzen kann diese Methode mit Standardlaborgeräten und -techniken eingesetzt werden. Dieser praktische Ansatz könnte daher die Fähigkeit der Forscher erweitern, die biologische Rolle nativer GAGs und ihre Interaktion mit kontextuell wichtigen Liganden zu bestimmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Sulfatierte Glykosaminoglykane (GAGs) wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) sind in lebenden Organismen allgegenwärtig und spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl grundlegender biologischer Strukturen und Prozesse. Als Polymere existieren GAGs als polydisperse Mischung, die Polysaccharidketten enthält, die von 4000 Da bis weit über 40.000 Da reichen können. Innerhalb dieser Ketten existieren Domänen der Sulfatierung, die ein Muster negativer Ladung verleihen, das die Interaktion mit positiv geladenen Rückständen verwandter Proteinliganden erleichtert. Sulfatierte Domänen von GAGs müssen eine ausreichende Länge haben, um diese elektrostatischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Um die Funktion von GAGs in biologischen Geweben zu verstehen, muss der Prüfer in der Lage sein, die Größe von GAGs zu isolieren, zu reinigen und zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine praktische und vielseitige Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-basierte Technik, die genutzt werden kann, um relativ kleine Größenunterschiede zwischen GAGs zu lösen, die aus einer Vielzahl von biologischen Gewebetypen isoliert wurden.

Alcianblau wird verwendet, um sulfatierte GAGs 10zu färben; Dieses Signal wird durch die Verwendung eines nachfolgenden Silberflecks 11verstärkt. Abbildung 1 zeigt eine visuelle Demonstration des Entwicklungsprozesses der Silberfärbung. Wie gezeigt, wird das alcianblaue Signal, das durch Elektrophorese getrennte GAGs darstellt, verstärkt, wenn das entwicklungsende Mittel in das Polyacrylamidgel eindringt. Typischerweise reduziert der Entwic...

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Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, mit der das Vorhandensein und die Länge von Glykosaminoglykanen, die Moleküle von zunehmend anerkannter Bedeutung für viele biologische Prozesse sind, nachgewiesen und gemessen werden kann. Diese Technik ist leicht an die meisten Life-Science-Labore anpassbar. Vergleichbare glykomische Techniken erfordern oft Ausrüstung und Fachwissen, die nur in glykochemischen Forschungslabors zu finden sind.Diese Technik kann besonders nützlich für Forscher sein, die daran interessiert sind, den Glykokalyx zu untersuchen, eine Polysaccharidschicht, die die Endothel- und Epitheloberflächen des menschlichen Körpers ausknurpt. Beginnen Sie, indem Sie eine leere Kassette in den PAGE-Tank legen. Gießen Sie ein auflösendes Gel, indem Sie 10 Milliliter auflösende Gellösung mit 60 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.Dann fügen Sie 10 Mikroliter TEMED hinzu. Kehren Sie das Rohr zwei- bis dreimal vorsichtig um. Schnell 10 Milliliter der aktivierten Polyacrylamid-Gellösung mit einer Pipette in die Kassette geben.Mit zwei Millilitern entionisiertem gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen. Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser. Gießen Sie das Stapelgel, indem Sie drei Milliliter Stapelgellösung mit 90 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.Dann fügen Sie drei Mikroliter TEMED hinzu und kehren Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal vorsichtig um. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das erstarrte auflösende Gel zu geben, bis die Kassette bis zum Rand gefüllt ist. Setzen Sie den mit der leeren Polyacrylamid-Gelkassette gelieferten Kamm vollständig ein und lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten lang polymerisieren.Sobald das Gel polymerisiert ist, entfernen Sie den Bandstreifen vom Boden der Kassette und legen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe. Füllen Sie die obere und untere Kammer mit den jeweiligen Pufferlösungen. Lösen Sie getrocknete Glykosaminoglykanproben in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem gefiltertem Wasser auf und mischen Sie sie mit dem Probenladepuffer in einem Verhältnis von eins zu eins.Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharidleitern in das Gel. Führen Sie das Gel fünf Minuten lang bei 100 Volt vor und führen Sie es dann mit 200 Volt für 20 bis 100 Minuten aus, abhängig vom Acrylamidanteil der auflösenden Gellösung. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel vorsichtig in einen großen, sauberen Behälter, der mit entionisiertem gefiltertem Wasser gefüllt ist.Dann entsorgen Sie das Wasser und färben Sie das Gel fünf Minuten lang in Alcian Blau färben. Entsorgen Sie den Alcian-Blaufleck und waschen Sie ihn schnell zwei- bis dreimal mit entionisiertem gefiltertem Wasser, bis der größte Teil der Alcian-Blaufärbungslösung entfernt wurde. Das Gel in Silbernitrat-Färbelösung in einem frischen, sauberen Behälter für 30 Minuten einfärben.Anschließend zwei- bis dreimal für jeweils 30 Minuten in entionisiertem gefiltertem Wasser waschen, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie die entwicklungspenstige Lösung hinzu. Beobachten Sie das Gel sorgfältig auf das Auftreten von Bändern.Abhängig von der Qualität des Flecks und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten dauern. Sobald die gewünschten Bänder sichtbar sind, entsorgen Sie sofort die sich entwickelnde Lösung und waschen Sie das Gel kurz mit STOP-Lösung. Die isolierten und gereinigten Glykosaminoglykane wurden mit alcianblauer und silberner Färbetechnik nach dichteabhängiger Auflösung durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese visualisiert.Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, waren Heparansulfat-Oligosaccharide unterschiedlicher Polymerlängen mit diesem PAGE-basierten Ansatz leicht nachweisbar. Die Nachweisgrenze dieser Methode von nur 0,5 Mikrogramm zeigt, dass die Technik beim Nachweis von aus biologischen Proben isolierten und gereinigten Glykosaminoglykanen sehr empfindlich ist. Von den vier verschiedenen Heparinsulfat-Oligosacchariden, die mit dieser Methode visualisiert wurden, war unfraktioniertes Heparin am wenigsten leicht nachweisbar.Aufgrund der Polydispersität von unfraktioniertem Heparin ist die Dichte jedes einzelnen Bandes aus dieser Probe niedriger als die Banden, die durch eine gleiche Masse gereinigter Heparin-Oligosaccharide erzeugt werden. Die Effizienz der Glykosaminoglykan-Reinigung aus flüssigen biologischen Proben wurde anhand von bronchoalveolären Lavage-Proben von Mäusen bewertet, die ursprünglich relativ geringe Konzentrationen von Glykosaminoglykanen enthielten. Darüber hinaus wurde der Erfolg dieser Technik mit Heparinsulfat demonstriert, das aus dem gesamten Lungenhomogenat isoliert wurde, was eine ausreichende Menge an isoliertem Heparinsulfat ergab, wobei die kleinsten Fragmente etwa 10 Disacchariduntereinheiten in der Masse entsprachen.Es ist sehr wichtig, frisch zubereitete Reagenzien zu verwenden und jedes reagenz, das in diesem Protokoll verwendet wird, zu filtern. Es ist wichtig, Reagenzien von höchster Reinheit und Qualität zu verwenden, um diese Technik erfolgreich durchzuführen.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

Forschung

Biologie

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...