Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ו- EPS)

כל הדגימות הביולוגיות שניתחו בפרוטוקול זה התקבלו מעכברים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.
1. בידוד גופרתי של הפרין
<ol><li>הזיון של דגימות רקמה הערה: הזיון הוא צעד אופציונלי עבור רקמות עשירות בשומן.<ol>
<li>הפוך...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

לגאגים יש תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים ומגוונים. אחת הפונקציות העיקריות של GAGs גופרתי (כגון HS ו- CS) היא לקיים אינטראקציה עם ליגנדים ולאגד, אשר יכול לשנות פונקציות איתות במורד הזרם. גורם חשוב של זיקה מחייבת GAG לליגנדים מודעים הוא אורך שרשרת הפולימר GAG 8,9<s...

גליקוסאמינוגליקנס (GAGs) הם משפחה מגוונת של פוליסכרידים ליניאריים שהם יסוד בכל מקום באורגניזמים חיים ותורמים לתהליכים פיזיולוגיים בסיסיים רבים1. GAGs כגון הפריאן גופרתי (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) עשוי להיות גופרתי בעמדות שונות לאורך שרשרת הפוליסכריד, והענקת תחומים גיאוגרפיים של מטען שלילי. GAGs אלה, כאשר קשורים חלבונים פני התא המכונה proteoglycans, להקרין לתוך החלל החוץ תאי ונקשרים ליגנדים מודעים, המאפשר את הרגולציה של שני cis- (ליגנד מחובר לאותו תא) ו trans- (ליגנד מחובר לתא השכן) תהליכי איתות2. יתר על כן, GAGs גם לבצע תפקידים קריטיים כמו אלמנטים מבניים ברקמות כגוןקרוםהמרתף glomerular 3 , גליקוקליקס אנדותל וסקולרי4 וגליקוקליקס אפיתל ריאתי5, וברקמות חיבור כגון סחוס6.
אורך שרשראות הפוליסכריד GAG משתנה באופן משמעותי בהתאם להקשר הביולוגי שלה וניתן להאריך אותו באופן דינמי, לבקע ולשנותו על ידי מערכת רגולטורית אנזימטית מורכבת מאוד7. חשוב לציין, אורך שרשראות הפולימר GAG תורם באופן משמעותי לזיקתן המחייבת לליגנדים, ולאחר מכן לתפקוד הביולוגי שלהם8,9. מסיבה זו, קביעת הפונקציה של GAG אנדוגני דורש הערכה של גודלו. למרבה הצער, שלא כמו חלבונים וחומצות גרעין, מעט מאוד טכניקות זמינות קיימות כדי לזהות ולמדוד GAGs, אשר מבחינה היסטורית הביא חקירה מוגבלת יחסית לתוך התפקידים הביולוגיים של משפחת פוליסכריד מגוונת זו.
מאמר זה מתאר כיצד לבודד ולטהר GAGs מרוב הרקמות הביולוגיות, וגם, מתאר כיצד להשתמש אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) כדי להעריך את אורך הפולימרים המבודדים עם מידה לא מבוטלת של ספציפיות. בניגוד לגישות גליקומוניות אחרות, מורכבות מאוד (ולעתים קרובות מבוססות ספקטרומטריית מסה), ניתן להשתמש בשיטה זו באמצעות ציוד מעבדה וטכניקות סטנדרטיות. גישה מעשית זו עשויה, אם כן, להרחיב את יכולתם של החוקרים לקבוע את התפקיד הביולוגי של GAGs ילידים ואת האינטראקציה שלהם עם ליגנדים חשובים מבחינה הקשרית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

גליקוסאמינוגליקאנים גופרתיים (GAGs) כגון הפריאן סולפט (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) נמצאים בכל מקום באורגניזמים חיים וממלאים תפקיד קריטי במגוון מבנים ותהליכים ביולוגיים בסיסיים. כפולימרים, GAGs קיימים כתערובת פולידיספרס המכילה שרשראות פוליסכריד שיכולות לנוע בין 4000 Da ליותר מ -40,000 Da. בתוך שרשראות אלה קיימים תחומים של גופרית, המעניקים דפוס של מטען שלילי המאפשר אינטראקציה עם שאריות טעונות חיוביות של ליגנד חלבון קוגנייט. תחומים גופרתיים של GAGs חייב להיות באורך מספיק כדי לאפשר אינטראקציות אלקטרוסטטיות אלה. כדי להבין את הפונקציה של GAGs ברקמות ביולוגיות, החוקר חייב להיות מסוגל לבודד, לטהר, ולמדוד את הגודל של GAGs. דו"ח זה מתאר טכניקה מעשית ורב-תכליתית המבוססת על אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד שניתן למנף כדי לפתור הבדלים קטנים יחסית בגודל בין GAGs מבודדים ממגוון סוגי רקמות ביולוגיות.

כחול אלקי משמש להכתמת GAGs גופרית 10; אות זה מוגבר על ידי שימוש בכתם כסף 11לאחר מכן . איור 1 מספק הדגמה חזותית של תהליך פיתוח כתמי הכסף. כפי שהוכח, האות הכחול האלקי המייצג GAGs מופרדים על ידי אלקטרופורזה מוגבר כמו הסוכן המתפתח חודר ג'ל polyacrylamide. בדרך כלל, התה...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לזהות את הנוכחות ולמדוד את אורך הגליקוזאמינוגליקנים, שהם מולקולות בעלי משמעות מוכרת יותר ויותר לתהליכים ביולוגיים רבים. טכניקה זו ניתנת להתאמה בקלות לרוב המעבדות למדעי החיים. טכניקות גליקומיות דומות דורשות לעתים קרובות ציוד ומומחיות שנמצאים רק במעבדות מחקר גליקוכימיה.טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לחוקרים המעוניינים לחקור את הגליקוליקס, מעיל פוליסכריד המיישר את משטחי האנדהל והאפיתל של גוף האדם. התחל על-ידי הצבת קלטת ריקה במיכל PAGE. יצוק ג'ל פתרון על ידי ערבוב 10 מיליליטר של פתרון ג'ל פתרון פתרון עם 60 microliters של מוכן טרי ב 10% אמוניום אסולפט בצינור 15 מיליליטר.לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטרים של TEMED. הפוך את הצינור בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים. הוסף במהירות 10 מיליליטר של פתרון ג'ל polyacrylamide מופעל לקלטת באמצעות pipette.כיסוי עם שני מיליליטר של מים מסוננים deionized, ולאפשר ג'ל פתרון כדי פולימר במשך 30 דקות. לאחר שהג'ל לפתרון הפך לפולימרי מלא, יש להשליך את המים עם הכיס. להטיל את ג'ל הערימה על ידי ערבוב שלושה מיליליטר של פתרון ג'ל לערום עם 90 microliters של 10% אמוניום אסולפט מוכן טרי בצינור 15 מיליליטר.לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של TEMED והפוך את הצינור בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים. השתמש פיפטה כדי להוסיף במהירות את פתרון ג'ל הערימה מעל ג'ל פתרון מוצק עד הקלטת מתמלאת עד הקצה. הכנס באופן מלא את המסרק הכלול בקלטת ג'ל הפוליקרימיד הריקה ואפשר לג'ל הערימה להסתגר במשך 30 דקות.לאחר הג'ל הוא פולימר, להסיר את רצועת הסרט מתחתית הקלטת, ולהניח את הקלטת בחזרה לתוך הרכבת טנק PAGE. מלא את התאים העליונים והתחתונים בפתרונות המאגר המתאימים. להמיס דגימות glycosaminoglycan מיובש בנפח המינימלי הדרוש של מים מסוננים deionized ומערבבים עם חוצץ טעינה מדגם ביחס של אחד לאחד.טען את הדגימות ואת סולמות האוליגו-סכריד של HS לתוך הג'ל. להריץ את הג'ל במשך חמש דקות ב 100 וולט, ולאחר מכן להפעיל אותו ב 200 וולט במשך 20 עד 100 דקות, בהתאם לאחוז אקרילאמיד של פתרון ג'ל פתרון. לאחר השלמת הריצה, לפרק את הקלטת ולחלץ בזהירות את הג'ל לתוך מיכל גדול ונקי מלא במים מסוננים deionized.לאחר מכן להשליך את המים ולהכתים את הג'ל בתמיסת כתמים כחולים Alcian במשך חמש דקות. יש להשליך את הכתם הכחול האלקי, ולשטוף במהירות פעמיים עד שלוש פעמים במים מסוננים דה-יעו"ד עד להסרת רוב תמסת הכתמים הכחולה האלקית. מכתימים את הג'ל בתמיסת כתמי חנקות מכסף במיכל נקי ורענן למשך 30 דקות.לאחר מכן לשטוף פעמיים עד שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד במים מסוננים deionized כדי להסיר באופן מלא את פתרון כתמי כסף. להשליך את המים ולהוסיף פתרון מתפתח. בזהירות להתבונן ג'ל להופעת להקות.בהתאם לאיכות הכתם ומסת המדגם שנטען, הפיתוח יכול להימשך בין כמה שניות למספר דקות. ברגע הרצועות הרצויות גלויים, מיד להשליך את הפתרון המתפתח לשטוף את הג'ל בקצרה עם פתרון STOP. הגליקוזאמינוגליקנים המבודדים והמטוהרים הוצגו באמצעות טכניקת הכתמת כחול וכסף אלסיאנית לאחר רזולוציה תלויה בצפיפות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד.כפי שניתן לראות באיור זה, אוליגוסכרידים הפרין סולפט באורכים פולימריים שונים היו ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות גישה מבוססת PAGE זו. מגבלת הזיהוי של שיטה זו, נמוכה עד 0.5 מיקרוגרם, מראה כי הטכניקה רגישה מאוד בזיהוי גליקוזאמינוגליקנים מבודדים ומטוהרים מדגימות ביולוגיות. מתוך ארבעת ההפרין סולפטים השונים אוליגוסכרידים שדמיינו בשיטה זו, הפרין לא מפוצל היה פחות ניתן לזיהוי בקלות.בשל polydispersity של הפרין unfractionated, הצפיפות של כל רצועה בודדת מדגם זה נמוכה יותר מאשר להקות המיוצרות על ידי מסה שווה של אוליגוסכרידים הפרין מטוהר. היעילות של טיהור גליקוסאמינוגליקן מדגימות ביולוגיות נוזליות הוערכה באמצעות דגימות שטיפה ברונכואלבולרי שנאספו מעכברים, שבמקור הכילו ריכוזים נמוכים יחסית של גליקוזאמינוגליקנס. בנוסף, ההצלחה של טכניקה זו הודגמה באמצעות הפרין גופרתי מבודד הומוגנט ריאות שלם, אשר הניב כמות גדולה של הפרין גופרתי מבודד, עם השברים הקטנים ביותר השווים כ 10 subaccharide subunits במסה.חשוב מאוד להשתמש בריאגנטים טריים, ולסנן כל ריאגנט המשמש בפרוטוקול זה. זה קריטי להשתמש ריאגנטים של הטוהר והאיכות הגבוהים ביותר כדי לבצע בהצלחה טכניקה זו.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...