Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
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इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण किए गए सभी जैविक नमूने चूहों से प्राप्त किए गए थे, कोलोराडो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत ।
1. हेपरन सल्फे?...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAGs कई विविध जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । सल्फेटेड जीओजी (जैसे एचएस और सीएस) के प्रमुख कार्यों में से एक लिगांड के साथ बातचीत करना और बांधना है, जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कार्यों ...

ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (जीएजी) रैखिक पॉलीसैकराइड्स का एक विविध परिवार है जो जीवित जीवों में एक सर्वव्यापी तत्व हैं और कई बुनियादी शारीरिक प्रक्रियाओं में योगदान देते हैं1। हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जैसे जीएजी को पॉलीसैकराइड चेन के साथ अलग-अलग पदों पर सल्फस किया जा सकता है, जो नकारात्मक शुल्क के भौगोलिक डोमेन प्रदान करता है। ये जीएजी, जब प्रोटेओग्लाइकैन के रूप में जाने जाने वाले सेल-सरफेस प्रोटीन के लिए सीमित होते हैं, तो एक्साइटेसेलर स्पेस में प्रोजेक्ट करते हैं और कॉग्नेट लिगांड के लिए बाध्य करते हैं, दोनों सीआईएस के नियमन के लिए अनुमति देते हैं- (एक ही सेल से जुड़ी लिगांड) और ट्रांस-(पड़ोसी सेल से जुड़ी लिगामेंट) सिग्नलिंगप्रक्रियाएं 2। इसके अलावा, जीजीएस ऊतकों में संरचनात्मक तत्वों जैसे ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली3, संवहनी एंडोथेलियल ग्लाइकोलिक्स 4 और पल्मोनरी एपिथेलियल ग्लाइकोलिक्स5 और कनेक्टिव ऊतकों में ऐसे उपास्थि6जैसे महत्वपूर्ण भूमिकाएं भी करते हैं।
गैग पॉलीसैकराइड चेन की लंबाई इसके जैविक संदर्भ के अनुसार काफी भिन्न होती है और इसे अत्यधिक जटिल एंजाइमेटिक नियामक प्रणाली7द्वारा गतिशील रूप से लंबा, क्लीव्ड और संशोधित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि गैग बहुलक श्रृंखलाओं की लंबाई लिगामेंट्स के लिए उनके बाध्यकारी आत्मीयता में काफी योगदान देती है और बाद में, उनके जैविक कार्य8,9में योगदान देती है। इस कारण से, एक अंतर्जात गैग के कार्य के निर्धारण के लिए इसके आकार की सराहना की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विपरीत, बहुत कम आसानी से उपलब्ध तकनीकों का पता लगाने और GAGs, जो ऐतिहासिक रूप से इस विविध पॉलीसैकराइड परिवार की जैविक भूमिकाओं में अपेक्षाकृत सीमित जांच के परिणामस्वरूप है उपाय मौजूद हैं ।
यह लेख सबसे जैविक ऊतकों से जीएजी को अलग और शुद्ध करने का वर्णन करता है, और यह भी बताता है कि विशिष्टता की उचित डिग्री के साथ अलग-थलग पॉलिमर की लंबाई का मूल्यांकन करने के लिए पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग कैसे किया जाए। अन्य, अत्यधिक जटिल (और अक्सर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित) ग्लाइकोमिक दृष्टिकोणों के विपरीत, इस विधि को मानक प्रयोगशाला उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करके नियोजित किया जा सकता है। इसलिए, यह व्यावहारिक दृष्टिकोण, देशी GAGs की जैविक भूमिका और प्रासंगिक रूप से महत्वपूर्ण ligands के साथ उनकी बातचीत का निर्धारण करने के लिए जांचकर्ताओं की क्षमता का विस्तार कर सकता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

सल्फेट ग्लाइकोसिनोग्लिकन (जीजीएस) जैसे हेपरन सल्फेट (एचएस) और कोंड्रोइटिन सल्फेट (सीएस) जीवित जीवों में सर्वव्यापी हैं और विभिन्न प्रकार की बुनियादी जैविक संरचनाओं और प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। पॉलिमर के रूप में, GAGs पॉलीसैकराइड चेन युक्त पॉलीडिस्परज़ मिश्रण के रूप में मौजूद है जो 4000 डीए से लेकर 40,000 डीए से अधिक हो सकता है। इन श्रृंखलाओं के भीतर सल्फेट के डोमेन मौजूद हैं, जो नकारात्मक आवेश का एक पैटर्न प्रदान करते हैं जो कॉग्नेट प्रोटीन लिगांड के सकारात्मक आवेशित अवशेषों के साथ बातचीत की सुविधा प्रदान करता है। इन इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए अनुमति देने के लिए जीएजी के सल्फेटेड डोमेन पर्याप्त लंबाई के होने चाहिए। जैविक ऊतकों में GAGs के कार्य को समझने के लिए, अन्वेषक को GAGs के आकार को अलग करने, शुद्ध करने और मापने में सक्षम होना चाहिए। यह रिपोर्ट एक व्यावहारिक और बहुमुखी पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित तकनीक का वर्णन करती है जिसे विभिन्न जैविक ऊतक प्रकारों से अलग GAGs के बीच आकार में अपेक्षाकृत छोटे मतभेदों को हल करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है।

एल्सियन ब्लू का उपयोग सल्फेटेड जीजीएस 10को दाग देने के लिए किया जाता है; इस संकेत एक बाद चांदी दाग 11के उपयोग से परिलक्षित होता है . चित्रा 1 चांदी धुंधला विकास प्रक्रिया का एक ?...

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Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

इस रिपोर्ट में जैविक नमूनों से सल्फसेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (जीएजी) को अलग और शुद्ध करने की तकनीकों का वर्णन किया गया है और उनके आकार के अनुमानित करने के लिए एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस दृष्टिकोण है। GAGs ऊतक संरचना में योगदान और प्रोटीन के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से संकेत प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं । गैग बहुलक लंबाई कॉग्नेट लिगांड के लिए उनकी बाध्यकारी आत्मीयता में योगदान देती है।

पॉलीएक्रेलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन का पता लगाना

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

यह प्रोटोकॉल एक सरल तकनीक का वर्णन करता है जिसका उपयोग उपस्थिति का पता लगाने और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन की लंबाई को मापने के लिए किया जा सकता है, जो कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए तेजी से मान्यता प्राप्त महत्व के अणु हैं। यह तकनीक अधिकांश जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। तुलनीय ग्लाइकोमिक तकनीकों को अक्सर केवल ग्लाइकोकेमिस्ट्री अनुसंधान प्रयोगशालाओं में पाए जाने वाले उपकरणों और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।यह तकनीक उन शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है जो ग्लाइकोक्लाक्स का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं, एक पॉलीसैकराइड कोट जो मानव शरीर की एंडोथेलियल और एपिथेलियल सतहों को लाइन करता है। पेज टैंक में एक खाली कैसेट रखकर शुरू करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10% अमोनियम अनुसल्फेट पर तैयार हौसले से तैयार 60 माइक्रोलीटर के साथ जेल समाधान को हल करने के 10 मिलीलीटर को मिलाकर एक हल जेल कास्ट करें।इसके बाद इसमें टमेड के 10 माइक्रोलीटर डालें। ट्यूब को धीरे-धीरे दो से तीन बार पलटें। एक पिपेट का उपयोग करके कैसेट में सक्रिय पॉलीएक्रेमाइड जेल समाधान के 10 मिलीलीटर को जल्दी से जोड़ें।दो मिलीलीटर के साथ डिएकाइज्ड फ़िल्टर किए गए पानी के साथ ओवरले करें, और हल करने वाले जेल को 30 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें। हल करने के बाद जेल पूरी तरह से बहुलक हो गया है, मढ़ा पानी त्यागें। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हौसले से तैयार 10% अमोनियम persulfate के 90 माइक्रोलीटर के साथ स्टैकिंग जेल समाधान के तीन मिलीलीटर मिश्रण करके स्टैकिंग जेल कास्ट करें।फिर तेमीड के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को धीरे-धीरे दो से तीन बार उलटा करें। जब तक कैसेट को किनारा नहीं किया जाता है तब तक जमने वाले समाधान जेल पर स्टैकिंग जेल समाधान को जल्दी से जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। खाली पॉलीएक्रेलैमाइड जेल कैसेट के साथ शामिल कंघी को पूरी तरह से डालें और स्टैकिंग जेल को 30 मिनट के लिए पॉलीमराइज करने की अनुमति दें।एक बार जेल बहुलक है, कैसेट के नीचे से टेप पट्टी को हटा दें, और कैसेट वापस पृष्ठ टैंक विधानसभा में जगह है । ऊपरी और निचले कक्षों को संबंधित बफर समाधानों के साथ भरें। डिओनाइज्ड फ़िल्टर किए गए पानी की न्यूनतम आवश्यक मात्रा में सूखे ग्लाइकोसिनोग्लाइकन नमूनों को भंग करें और एक-से-एक अनुपात में नमूना लोडिंग बफर के साथ मिलाएं।नमूनों और एचएस ओलिगोसैकराइड सीढ़ी को जेल में लोड करें। 100 वोल्ट पर पांच मिनट के लिए जेल को प्रीरन करें, फिर इसे हल करने वाले जेल समाधान के एक्रिलामाइड प्रतिशत के आधार पर 20 से 100 मिनट के लिए 200 वोल्ट पर चलाएं। एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, कैसेट को अलग करें और जेल को एक बड़े साफ कंटेनर में सावधानी से निकालें जो डिएकाइज्ड फ़िल्टर किए गए पानी से भरा होता है।फिर पानी को त्यागें और पांच मिनट के लिए एल्सियन ब्लू स्टेनिंग समाधान में जेल को दाग दें। एल्सियन नीले दाग को त्यागें, और जल्दी से दो से तीन बार डिएरियन फ़िल्टर किए गए पानी से धोएं जब तक कि अधिकांश एल्सियन ब्लू स्टेनिंग समाधान हटा नहीं दिया गया है। 30 मिनट के लिए एक ताजा साफ कंटेनर में चांदी नाइट्रेट धुंधला समाधान में जेल दाग।फिर चांदी के धुंधला समाधान को पूरी तरह से हटाने के लिए डिओनाइज्ड फ़िल्टर किए गए पानी में प्रत्येक 30 मिनट के लिए दो से तीन बार धोएं। पानी को त्यागें और विकासशील समाधान जोड़ें। बैंड की उपस्थिति के लिए जेल का ध्यान से निरीक्षण करें।दाग की गुणवत्ता और नमूना लोड के द्रव्यमान के आधार पर, विकास कुछ सेकंड से कई मिनट तक कहीं भी ले जा सकता है। जैसे ही वांछित बैंड दिखाई दे रहे हैं, तुरंत विकासशील समाधान को त्याग दें और जेल को स्टॉप समाधान के साथ संक्षेप में धो लें। एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा घनत्व निर्भर संकल्प के बाद एल्सियन ब्लू और सिल्वर स्टेनिंग तकनीक का उपयोग करके अलग और शुद्ध ग्लाइकोसिनोग्लाइकैन की कल्पना की गई थी।जैसा कि इस आंकड़े में देखा गया है, विभिन्न बहुलक लंबाई के हेपरन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स को इस पेज आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके आसानी से पता लगाया जा सकता था। इस विधि का पता लगाने की सीमा, 0.5 माइक्रोग्राम के रूप में कम, यह दर्शाती है कि जैविक नमूनों से अलग और शुद्ध ग्लाइकोसिनोग्लाइकैन का पता लगाने में तकनीक अत्यधिक संवेदनशील है। इस विधि का उपयोग करके कल्पना किए गए चार अलग-अलग हेपरिन सल्फेट ओलिगोसैकराइड्स में से, बिना उल्लंघन वाले हेपरिन कम से कम आसानी से पता लगाने योग्य था।बिना उल्लंघन हेपरिन की पॉलीडिस्परेसिटी के कारण, इस नमूने से प्रत्येक व्यक्तिगत बैंड का घनत्व शुद्ध हेपरिन ओलिगोसैकराइड्स के समान द्रव्यमान द्वारा उत्पादित बैंड की तुलना में कम है। तरल जैविक नमूनों से ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन शुद्धिकरण की दक्षता का आकलन चूहों से एकत्र किए गए ब्रोंकोलवेओलर लावेज नमूनों का उपयोग करके किया गया था, जिसमें मूल रूप से ग्लाइकोसामिनोग्लाइकैन की अपेक्षाकृत कम सांद्रता थी। इसके अतिरिक्त, इस तकनीक की सफलता को पूरे फेफड़ों के समरूप से अलग हेपरिन सल्फेट का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था, जिसमें पर्याप्त मात्रा में अलग हेपरिन सल्फेट मिला, जिसमें सबसे छोटे टुकड़े द्रव्यमान में लगभग 10 डिसेचराइड सबइकाइकेट्स के बराबर थे।हौसले से तैयार अभिकर्णों का उपयोग करना और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले हर अभिकर् ता को फ़िल्टर करना बहुत महत्वपूर्ण है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक करने के लिए उच्चतम शुद्धता और गुणवत्ता के अभिकर् ता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

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Denaturing ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

अर्ध denaturing डिटर्जेंट - agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा Amyloid एकत्रीकरण के लिए स्क्रीनिंग

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

फास्ट और संवेदनशील कोलाइडयन polyacrylamide जैल में Coomassie जी 250-प्रोटीन के लिए धुंधला

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

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Denaturing यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (यूरिया पृष्ठ)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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ब्लू multiprotein परिसर के सेलुलर lysates से विश्लेषण के लिए मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन पृष्ठ)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

कार्यात्मक मैट्रिक्स Metalloproteinases के Zymography द्वारा जांच

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

घनघोर और वाणिज्यिक कैसेट reusing द्वारा एक प्रोटीन जेल रनिंग

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

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Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

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लाइव की जांच<em&gt; कोलाई</em&gt; O157: PMA-qPCR द्वारा H7 प्रकोष्ठों

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

डीएनए Crosslinked Polyacrylamide Hydrogels की तैयारी

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...