Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
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この作品は、F31 HL143873-01(WBL)、R01 HL125371(RJLおよびEPS)によって資金提供されました

このプロトコルで分析されたすべての生物学的サンプルは、コロラド大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、マウスから得られた。
1. ヘパラン硫酸分離
<ol><li>組織サンプルの脱脂 注:脱脂は、脂肪が豊富な組織のためのオプションのステップです。<ol>
<li>メタノールとジクロロメタンを1:1の混合物にします。サンプ?...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAGsは、多くの多様な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。硫酸化GAGs(HSやCSなど)の主な機能の1つは、リガンドと相互作用して結合し、下流のシグナル伝達機能を変化させることです。コグネイトリガンドに対するGAG結合親和性の重要な決定要因は、GAGポリマー鎖8、9、14の長さである。 このため、研?...

グリコサミノグリカン(GAG)は、生物の中でユビキタスな要素であり、多くの基本的な生理学的プロセスに寄与する線形多糖の多様なファミリーである1。ヘパラン硫酸(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などのGAGsは、多糖鎖に沿った異なる位置で硫酸化され、負電荷の地理的領域を付与する。これらのGAGsは、プロテオグリカンとして知られている細胞表面タンパク質に連結すると、細胞外空間に突出してコクネートリガンドに結合し、シス−(同じ細胞に結合したリガンド)およびトランス(隣接する細胞に結合したリガンド)の両方の調節を可能にするシグナル伝達プロセス2。さらに、GGsはまた、糸球体基質膜3、血管内皮グリコカリックス4 および肺上皮グリコカリックス5、および軟骨6のような結合組織における組織における構造要素としての重要な役割を果たす。
GAG多糖鎖の長さは、その生物学的文脈に応じて実質的に異なり、動的に長く、切断し、非常に複雑な酵素調節システム7によって修飾することができる。重要なことに、GAGポリマー鎖の長さは、リガンドに対するそれらの結合親和性に大きく寄与し、その後、その生物学的機能8、9に寄与する。このため、内因性GAGの機能の決定は、そのサイズの鑑賞を必要とする。残念ながら、タンパク質や核酸とは異なり、GAGsを検出して測定するための容易に入手可能な技術はほとんど存在しません。
この記事では、ほとんどの生体組織からGAGを分離して精製する方法を説明し、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を使用して、分離ポリマーの長さを公正な程度の特異性で評価する方法についても説明します。他の非常に複雑な(そしてしばしば質量分析ベースの)グリコミックアプローチとは対照的に、この方法は標準的な実験室の装置および技術を使用して使用することができる。したがって、この実用的なアプローチは、ネイティブのGAGsの生物学的役割と文脈上重要なリガンドとの相互作用を決定する研究者の能力を拡大する可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

硫酸塩(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などの硫酸塩グリコサミノグリカン(GAG)は、生物に遍在し、様々な基本的な生物学的構造やプロセスにおいて重要な役割を果たしています。ポリマーとして、GAGは4000 Daから40,000 Daをはるかに超える範囲の多糖鎖を含む多分散混合物として存在します。これらの鎖の中には、硫酸化のドメインが存在し、同結合タンパクリガンドの正に帯電した残基との相互作用を促進する負電荷のパターンを与える。GAGsの硫酸化ドメインは、これらの静電相互作用を可能にするのに十分な長さでなければならない。生物学的組織におけるGAGsの機能を理解するには、研究者がGAGsのサイズを単離し、精製し、測定できる必要があります。本報告書は、様々な生体組織タイプから分離されたGAGs間のサイズの比較的小さな違いを解決するために活用できる実用的で汎用性の高いポリアクリルアミドゲル電気泳動ベースの技術について説明しています。

アルシアンブルーは、硫酸化GAGs 10を染色するために使用されます。この信号は、後続の銀染色 11を用いて増幅される。 図1 は、銀染色開発プロセスの視覚的なデモンストレーションを示しています。実証されるように、電気泳動によって分離されたGAGを表すアルシアンブルー信号は、現像剤がポリアクリルアミドゲルに浸透するにつ...

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Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

本報告書では、生物学的試料から硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を分離して精製する技術と、そのサイズを近似するポリアクリルアミドゲル電気泳動法について説明する。GAGsは、組織構造に寄与し、タンパク質との静電相互作用を通じてシグナル伝達プロセスに影響を与えます。GAGポリマー長は、同結合リガンドに対する結合親和性に寄与する。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によるグリコサミノグリカンの検出

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

このプロトコルは、存在を検出し、多くの生物学的プロセスにとってますます認識される重要性の分子であるグリコサミノグリカンの長さを測定するために使用できる簡単な技術を記述する。この技術は、ほとんどのライフサイエンス研究所に容易に適応可能である。同等のグリコミック技術は、多くの場合、グリコ化学研究所でしか見つからならない装置や専門知識を必要とします。この技術は、人体の内皮および上皮表面に並ぶ多糖コートであるグリコカリックスの研究に興味がある研究者にとって特に有用である可能性がある。まず、空のカセットをPAGEタンクに入れます。15ミリリットルチューブに10%の過硫酸アンモニウムで調製したての60マイクロリットルとゲル溶液を分解する10ミリリットルを混合して、溶解ゲルをキャストします。その後、10マイクロリットルのTEMEDを加えます。チューブを2~3回やさしく反転します。ピペットを使用して、活性化ポリアクリルアミドゲル溶液の10ミリリットルをカセットに素早く加えます。2ミリリットルの脱イオン濾過水で重ね、30分間重合するゲルを分解させます。溶解ゲルが完全に重合した後、重ね合わされた水を捨てます。積層ゲル溶液の3ミリリットルを、15ミリリットルのチューブに作りたての10%過硫酸アンモニウムの90マイクロリットルと混合して、積み重ねゲルをキャストします。その後、TEMEDの3マイクロリットルを追加し、チューブを2〜3回穏やかに反転します。ピペットを使用して、カセットがつばに充填されるまで、固化した解決ゲルの上に積み重ねゲル溶液を素早く加えます。空のポリアクリルアミドゲルカセットに含まれる櫛を完全に挿入し、積層ゲルを30分間重合させます。ゲルを重合したら、カセットの底面からテープストリップを取り出し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。上部および下部のチャンバーに、それぞれのバッファー溶液を充填します。乾燥したグリコサミノグリカンサンプルを最小必要量の脱イオン濾過水に溶解し、サンプルローディングバッファーと1対1の比率で混合します。サンプルとHSオリゴ糖のはしごをゲルに入れます。ゲルを100ボルトで5分間前走し、200ボルトで200ボルトで200ボルトで200ボルトで、分解ゲル溶液のアクリルアミド率に応じて実行します。実行が完了したら、カセットを分解し、除去されたろ過水で満たされた大きなきれいな容器にゲルを慎重に抽出します。その後、水を捨て、5分間アルシアブルー染色液でゲルを染色します。アルシアブルーの汚れを捨て、アルシアブルー染色液の大部分が取り除かれるまで、脱イオン濾過水で2〜3回素早く洗浄します。新鮮な清潔な容器にゲルを硝酸銀染色液で30分間染色します。その後、脱イオン濾過水でそれぞれ30分間2〜3回洗浄し、銀染色液を完全に除去します。水を捨て、開発ソリューションを追加します。バンドの外観についてはゲルをよく観察してください。汚れの品質とサンプルの質量に応じて、開発は数秒から数分かかる場合があります。目的のバンドが見えなければすぐに現れるので、現像液をすぐに捨て、STOP溶液でゲルを短時間洗います。単離および精製グリコサミノグリカンを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による密度依存分解後にアルシアンブルーおよび銀染色法を用いて可視化した。この図に見られるように、異なるポリマー長のヘパラン硫酸オリゴ糖は、このPAGEベースのアプローチを用いて容易に検出可能であった。この方法の検出限界は、0.5マイクログラムと低く、生物学的サンプルから単離および精製されたグリコサミノグリカンの検出において非常に敏感であることを示している。この方法を用いて可視化した4種類の異なるヘパリン硫酸オリゴ糖のうち、未分離ヘパリンは最も容易に検出できなかった。分離ヘパリンの多分散性のために、このサンプルからの個々のバンドの密度は、精製ヘパリンオリゴ糖の等質量によって生成されるバンドよりも低い。液体生物学的試料からのグリコサミノグリカン精製の効率を、もともと比較的低濃度のグリコサミノグリカンを含んでいたマウスから採取した気管支肺胞洗浄サンプルを用いて評価した。さらに、この技術の成功は、肺ホモジネート全体から分離されたヘパリン硫酸塩を使用して実証され、十分な量の分離ヘパリン硫酸塩を生み出し、最小の断片は質量で約10の二糖類を含む。作りたての試薬を使用し、このプロトコルで使用されるすべての試薬をフィルタリングすることは非常に重要です。この技術を成功させるためには、最高の純度と品質の試薬を使用することが重要です。

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマG - 250染色

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

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Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

商業カセットを再利用することでタンパク質ゲルを注ぐと実行

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

DNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルの調製

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...