Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
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이 작품은 F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL 및 EPS)에 의해 투자되었다

이 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 샘플은 콜로라도 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 마우스로부터 수득되었습니다.
1. 헤파란 황산염 고립
<ol><li>조직 샘플의 탈지 참고: 탈지화는 지방이 풍부한 조직을 위한 선택 사항입니다.<ol>
<li>메탄올과 디클로로메탄의 1:1 혼합물을 만듭니다. 샘플 당 약 500 μL을 준비; 조직의 큰 조?...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAGs는 다양한 생물학적 프로세스에서 중심적인 역할을 합니다. 황화 GAGs (HS 및 CS와 같은)의 주요 기능 중 하나는 다운스트림 신호 기능을 변경할 수있는 리간드와 상호 작용하고 결합하는 것입니다. 개그 결합 친화성의 중요한 결정요인은 GAG 폴리머 체인 8,9,14의길이이다. 이러한 이유로, 연구원은 합리적인 정밀하게 관심의 생...

글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스 원소이며 많은 기본적인생리적과정에 기여하는 선형 다당류의 다양한 가족이다. 헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 GAGs는 다당류 사슬을 따라 뚜렷한 위치에서 황살이 될 수 있으며, 부정적인 전하의 지리적 영역을 부여한다. 이들 GAGs는 프로테오글리칸으로 알려진 세포 표면 단백질에 테더링될 때 세포 외 공간으로 투영하여 코그네이트 리간드에 결합하여 시스-(동일한 세포에 부착된 리간드) 및 트랜스-(이웃 세포에 부착된 리간드) 신호 공정2의조절을 허용한다. 또한, GAGs는 또한 구체 지하 막3,혈관 내피 글리코릭스4 및 폐 상피 글리코릭스5,및 결합 조직(연골6)과같은 조직에서 구조적 요소로서 중요한 역할을 수행한다.
GAG 다당류 체인의 길이는 생물학적 맥락에 따라 크게 다르며 매우 복잡한 효소 규제 시스템7에의해 동적으로 길어지고, 갈라지고, 수정될 수 있다. 중요한 것은, GAG 폴리머 사슬의 길이는 리간드에 대한 그들의 결합 친화성에 실질적으로 기여하고, 그 후, 그들의 생물학적 기능에8,9. 이러한 이유로, 내인성 GAG의 기능의 결정은 그 크기의 감사를 필요로한다. 불행히도, 단백질과 핵산과는 달리 GAGs를 감지하고 측정하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 기술은 거의 존재하며, 이는 역사적으로 이 다양한 다당류 제품군의 생물학적 역할에 대한 비교적 제한된 조사를 초래했습니다.
이 문서에서는 대부분의 생물학적 조직에서 GAG를 분리하고 정화하는 방법에 대해 설명하고, 또한 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE)을 사용하여 분리된 폴리머의 길이를 공정한 수준의 특이성을 평가하는 방법을 설명합니다. 다른, 매우 복잡 한 (그리고 종종 질량 분광계 기반) 글리코믹 접근 과는 달리, 이 방법은 표준 실험실 장비 및 기술을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 따라서 이러한 실용적인 접근법은 원주민 GAGs의 생물학적 역할과 문맥적으로 중요한 리간드와의 상호 작용을 결정하는 조사관의 능력을 확장할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 황산 글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스이며 다양한 기본적인 생물학적 구조 및 공정에서 중요한 역할을 한다. 폴리머로서 GAG는 4000 Da에서 40,000 Da까지 다양하게 함유된 다당류 체인을 함유하는 다분산 혼합물로 존재합니다. 이러한 사슬 내에는 음전하의 도메인이 존재하며, 이는 cognate 단백질 리간드의 양전하 잔류물과의 상호 작용을 용이하게 하는 음전하 패턴을 부여합니다. GAG의 황질 도메인은 이러한 정전기 상호 작용을 허용하기에 충분한 길이여야 합니다. 생물학적 조직에서 GAG의 기능을 이해하려면 조사원은 GAG의 크기를 분리, 정화 및 측정할 수 있어야 합니다. 이 보고서는 다양한 생물학적 조직 유형에서 분리된 GAGs 간의 크기 차이를 비교적 작은 차이를 해결하기 위해 활용할 수 있는 실용적이고 다재다능한 폴리아크릴아미드 젤 전기포고제 기반 기술을 설명합니다.

알시안 블루는 황산 GAGs 10을염색하는 데 사용된다; 이 신호는 후속 실버 얼룩(11)을사용하여 증폭된다. 도 1은 은 염색 개발 프로세스의 시각적 데모를 제공합니다. 입증된 바와 같이, 발전에이전트가 폴리아크릴아미드 젤을 관통함에 따라 전기포고증에 의해 분리된 GAGs를 나타내는 알시안 청색 신호가 증폭된다. 일반적으로 개발 과정은 ?...

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Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

이 프로토콜은 존재를 감지하고 많은 생물학적 과정에 점점 더 인식되는 중요성의 분자인 글리코사미노글리칸의 길이를 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 기술은 대부분의 생명 과학 실험실에 쉽게 적응할 수 있습니다. 비교 가능한 글리코믹 기술은 종종 글리코케화학 연구 실험실에서만 볼 수 있는 장비와 전문 지식이 필요합니다.이 기술은 글리코칼릭스, 인체의 내피 및 상피 표면을 줄 다당류 코트를 연구에 관심이있는 연구자에게 특히 유용 할 수 있습니다. 먼저 빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에 10% 암모늄 감산에서 갓 제조된 60 마이크로리터와 젤 용액 을 혼합하여 해결 젤을 캐스팅합니다.그런 다음 TEMED의 마이크로리터 10기를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 2~3번 반전시다. 파이펫을 사용하여 활성 폴리 아크릴아미드 젤 용액10 밀리리터를 카세트에 빠르게 추가합니다.2밀리리터의 탈이온화된 여과된 물로 오버레이하고, 30분 동안 젤을 중합할 수 있게 한다. 해결 젤이 완전히 중합된 후 오버레이 된 물을 버리십시오. 스태킹 젤 용액 3밀리리터를 15밀리리터 튜브에 갓 준비한 10% 암모늄 감산의 90 마이크로리터와 혼합하여 스태킹 젤을 캐스팅합니다.그런 다음 TEMED의 마이크로 리터 3 개를 추가하고 튜브를 부드럽게 2 ~ 3 번 반전시면 됩니다. 파이펫을 사용하여 카세트가 가장자리에 채워지도록 응고된 해결 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 빈 폴리아크릴아미드 젤 카세트에 포함된 빗을 완전히 삽입하고 스태킹 젤이 30분 동안 중합되도록 합니다.젤이 중합되면 카세트 바닥에서 테이프 스트립을 제거하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다. 상하 챔버를 각각의 버퍼 솔루션으로 채웁니다. 말린 글리코아미노글리칸 샘플을 최소한의 필요한 양의 탈이온화 여과된 물로 용해하고 샘플 적재 버퍼와 일대일 비율로 혼합합니다.샘플과 HS 올리고당 사다리를 젤에 적재합니다. 젤을 100볼트에서 5분간 예전한 다음, 해결 젤 용액의 아크릴아미드 비율에 따라 20~100분 동안 200볼트에서 실행합니다. 실행이 완료되면 카세트를 분해하고 신중하게 탈이온 여과 된 물로 채워진 큰 깨끗한 용기로 젤을 추출합니다.그런 다음 물을 버리고 알시안 블루 염색 용액에 젤을 5 분 동안 염색하십시오. 알시안 블루 얼룩을 버리고, 알시안 블루 스테닝 용액의 대부분이 제거 될 때까지 탈이온 화 된 여과된 물로 2 ~ 3 번 신속하게 씻으십시오. 젤을 실버 질산염 염색 용액에 넣고 신선한 깨끗한 용기에 30분간 염색합니다.그런 다음 탈온화 된 물에 각각 2 ~ 3 번 세척하여 실버 염색 용액을 완전히 제거하십시오. 물을 버리고 개발 솔루션을 추가합니다. 밴드의 모양을 위해 조심스럽게 젤을 관찰하십시오.얼룩의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 개발은 몇 초에서 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 원하는 밴드가 보이자마자 개발 용액을 즉시 폐기하고 STOP 용액으로 젤을 간단히 세척합니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 밀도 의존적 해결 후 알시안 블루및 은 염색 기술을 사용하여 분리되고 정제된 글리코아미노글리칸을 시각화하였다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 상이한 폴리머 길이의 헤파란 황산염 올리고당류는 이 PAGE 기반 접근법을 사용하여 쉽게 검출할 수 있었다. 이 방법의 검출 한계는 0.5 마이크로그램으로 낮게, 기술이 생물학적 견본에서 분리되고 정제된 글리코사미노글리칸을 검출하는 데 매우 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 시각화된 4개의 다른 헤파린 황산염 올리고당 오리고당라이드 중, 불가분하지 않은 헤파린은 가장 쉽게 검출할 수 있었다.이 샘플에서 각 개별 밴드의 밀도는 정제 된 헤파린 올리고당라이드의 동등한 질량에 의해 생성 된 밴드보다 낮습니다. 액체 생물학적 샘플에서 글리코아미노글리칸 정제의 효율은 원래 글리코미노미노글리칸의 상대적으로 낮은 농도를 포함하는 마우스에서 수집된 기관지포라 라베지 샘플을 사용하여 평가되었다. 또한, 이 기술의 성공은 전체 폐 균질에서 분리된 헤파린 황산염을 사용하여 입증되었으며, 이는 약 10개의 소멸 서브유닛과 동일한 가장 작은 파편으로 충분한 양의 분리된 헤파린 황산염을 산출했습니다.새로 준비된 시약을 사용하고 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약을 필터링하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술을 성공적으로 수행하기 위해 최고 순도와 품질의 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

연구

생물학

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

상업 카세트를 재사용하여 물을 붓는과 단백질 젤 러닝

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...