Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)

Alle biologiske prøver analysert i denne protokollen ble hentet fra mus, under protokoller godkjent av University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfatisolasjon
<ol><li>Delipidasjon av vevsprøver MERK: Delipidasjon er et valgfritt trinn for fettrikt vev.<ol>
<li>Lag en 1:1 blanding av metanol og dichloromethane. Forbered ca. 500 μL per prøve; større vevsstykker kan kreve opptil 1 ml.</li>
		<li>Legg hver vevsprøve i en liten glas...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAG-er spiller en sentral rolle i mange ulike biologiske prosesser. En av hovedfunksjonene til sulfaterte GAG-er (som HS og CS) er å samhandle med og binde seg til ligander, noe som kan endre nedstrøms signalfunksjoner. En viktig determinant for GAG-bindingsaffinitet for å cognate ligander er lengden på GAG polymerkjeden 8,9,14. Derfor er det viktig for forskerne å kunne definere med rimelig presisjon størrelsen på GAG-kj...

Glykosaminoglykaner (GAG) er en mangfoldig familie av lineære polysakkarider som er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrar til mange grunnleggende fysiologiske prosesser1. GAG-er som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) kan bli sulfatert i forskjellige posisjoner langs polysakkaridkjeden, og gir geografiske domener med negativ ladning. Disse GAG-ene, når de er bundet til celleoverflateproteiner kjent som proteoglykaner, projiserer inn i det ekstracellulære rommet og binder seg til cognate-ligander, noe som muliggjør regulering av både cis- (ligand festet til samme celle) og trans- (ligand festet til nabocellen) signalprosesser2. Videre utfører GAG også kritiske roller som strukturelle elementer i vev som den glomerulære kjellermembranen3, vaskulær endotelglykokalyx4 og lungeeplytelformet glykokalyx5, og i bindevev som brusk6.
Lengden på GAG polysakkaridkjeder varierer betydelig i henhold til den biologiske konteksten og kan forlenges, spaltes og modifiseres dynamisk av et svært komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Viktigst, lengden på GAG polymerkjeder bidrar vesentlig til deres bindende affinitet for ligander og deretter til deres biologiske funksjon8,9. Av denne grunn krever bestemmelse av funksjonen til en endogen GAG verdsettelse av størrelsen. Dessverre, i motsetning til proteiner og nukleinsyrer, finnes det svært få lett tilgjengelige teknikker for å oppdage og måle GAG-er, noe som historisk har resultert i relativt begrenset undersøkelse av de biologiske rollene til denne mangfoldige polysakkaridfamilien.
Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer og renser GAG-er fra de fleste biologiske vev, og beskriver også hvordan du bruker polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) for å evaluere lengden på de isolerte polymerene med en god grad av spesifisitet. I motsetning til andre svært komplekse (og ofte massespektrometribaserte) glykomiske tilnærminger, kan denne metoden brukes ved hjelp av standard laboratorieutstyr og teknikker. Denne praktiske tilnærmingen kan derfor utvide etterforskernes evne til å bestemme den biologiske rollen til innfødte GAG-er og deres interaksjon med kontekstuelt viktige ligander.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en kritisk rolle i en rekke grunnleggende biologiske strukturer og prosesser. Som polymerer eksisterer GAG-er som en polydisperse blanding som inneholder polysakkaridkjeder som kan variere fra 4000 Da til godt over 40.000 Da. Innenfor disse kjedene finnes domener av sulfatasjon, og gir et mønster av negativ ladning som letter samspillet med positivt ladede rester av cognateproteinligander. Sulfaterte domener av GAG-er må ha tilstrekkelig lengde for å tillate disse elektrostatiske interaksjonene. For å forstå funksjonen til GAG-er i biologisk vev, må undersøkeren kunne isolere, rense og måle størrelsen på GAG-er. Denne rapporten beskriver en praktisk og allsidig polyakrylamidgelelektroforesebasert teknikk som kan utnyttes til å løse relativt små forskjeller i størrelse mellom GAG-er isolert fra en rekke biologiske vevstyper.

Alcian blå brukes til å flekke sulfaterte GAG 10; dette signalet forsterkes ved bruk av en påfølgende sølvflekk 11. Figur 1 gir en visuell demonstrasjon av utviklingsprosessen for sølvfarging. Som demonstrert forsterkes det alciske blå signalet som representerer GAG-er atskilt av elektroforese når utviklingsmiddelet trenger inn i polyakrylamidgelen. Vanligvis vil utviklingsprosessen redusere sølv og Alcian blåfargede GAG-er på en tet...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Denne rapporten beskriver teknikker for å isolere og rense sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) fra biologiske prøver og en polyakrylamidgelelektroforese tilnærming til omtrentlig størrelse. GAG bidrar til vevsstruktur og påvirker signalprosesser via elektrostatisk interaksjon med proteiner. GAG polymer lengde bidrar til deres bindende affinitet for cognate ligander.

Påvisning av glykosaminoglykaner ved polyakrylamidgelelektroforese og sølvfarging

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Denne protokollen beskriver en enkel teknikk som kan brukes til å oppdage tilstedeværelsen og måle lengden på glykosaminoglykaner, som er molekyler av stadig mer anerkjent betydning for mange biologiske prosesser. Denne teknikken er lett tilpasningsdyktig til de fleste biovitenskapelige laboratorier. Sammenlignbare glykomteknikker krever ofte utstyr og kompetanse som bare finnes i glykokjemiske forskningslaboratorier.Denne teknikken kan være spesielt nyttig for forskere som er interessert i å studere glykokalyxen, en polysakkaridjakke som linjer endotel- og epitelflatene i menneskekroppen. Begynn med å plassere en tom kassett i PAGE-tanken. Kast en løsende gel ved å blande 10 milliliter oppløsning av geloppløsning med 60 mikroliter fersk tilberedt ved 10% ammoniumpersulfat i et 15 milliliter rør.Legg deretter til 10 mikroliter TEMED. Snu røret forsiktig to til tre ganger. Tilsett raskt 10 milliliter av den aktiverte polyakrylamidgelløsningen til kassetten ved hjelp av en pipette.Overlegg med to milliliter deionisert filtrert vann, og la den løsende gelen polymerisere i 30 minutter. Etter at oppløsningsgelen er fullstendig polymerisert, kast det overlagte vannet. Kast stablingsgelen ved å blande tre milliliter stablingsgeloppløsning med 90 mikroliter nylagde 10% ammoniumpersulfat i et 15 milliliter rør.Tilsett deretter tre mikroliter TEMED og snu røret forsiktig to til tre ganger. Bruk en pipette for raskt å legge til stablingsgelløsningen over den størkne oppløsningsgelen til kassetten er fylt til randen. Sett kammen som følger med den tomme gelkassetten polyakrylamid helt inn, og la stablingsgelen polymerisere i 30 minutter.Når gelen er polymerisert, fjern båndstripen fra bunnen av kassetten, og legg kassetten tilbake i SIDE-tankenheten. Fyll øvre og nedre kamre med de respektive bufferløsningene. Løs opp tørkede glykosaminoglykanprøver i det minste nødvendige volumet av deionisert filtrert vann og bland med prøvelastebuffer i et en-til-en-forhold.Last prøvene og HS oligosakkaridstiger inn i gelen. Forløp gelen i fem minutter ved 100 volt, kjør den deretter på 200 volt i 20 til 100 minutter, avhengig av akrylamidprosenten av den løsende geloppløsningen. Når løpet er fullført, demonter kassetten og trekk gelen forsiktig ut i en stor, ren beholder fylt med deionisert filtrert vann.Kast deretter vannet og flekk gelen i alciansk blå fargingsoppløsning i fem minutter. Kast den alciske blå flekken, og vask raskt to til tre ganger med deionisert filtrert vann til det meste av den alciske blå fargingsløsningen er fjernet. Flekk gelen i sølvnitratfargingsoppløsning i en frisk ren beholder i 30 minutter.Vask deretter to til tre ganger i 30 minutter hver i deionisert filtrert vann for å fjerne sølvfargingsløsningen helt. Kast vannet og tilsett utviklingsløsning. Vær forsiktig oppmerksom på gelen for utseendet på bånd.Avhengig av kvaliteten på flekken og massen av prøven lastet, kan utviklingen ta alt fra noen få sekunder til flere minutter. Så snart de ønskede båndene er synlige, kast straks utviklingsløsningen og vask gelen kort med STOP-løsning. De isolerte og rensede glykosaminoglykanene ble visualisert ved hjelp av alciansk blå og sølvfargingsteknikk etter tetthetsavhengig oppløsning ved en polyakrylamidgelelektroforese.Som vist i denne figuren var heparan sulfat oligosakkarider av forskjellige polymerlengder lett påvisbare ved hjelp av denne SIDE-baserte tilnærmingen. Grensen for påvisning av denne metoden, så lavt som 0,5 mikrogram, viser at teknikken er svært følsom for å oppdage glykosaminoglykaner isolert og renset fra biologiske prøver. Av de fire forskjellige heparinsulfat oligosakkarider visualisert ved hjelp av denne metoden, var ufraksjonert heparin minst lett påviselig.På grunn av polydispersiteten til ufraksjonert heparin er tettheten til hvert enkelt bånd fra denne prøven lavere enn båndene produsert av en lik masse rensede heparin oligosakkarider. Effektiviteten av glykosaminoglykanrensing fra flytende biologiske prøver ble vurdert ved hjelp av bronkoalveolar lavageprøver samlet inn fra mus, som opprinnelig inneholdt relativt lave konsentrasjoner av glykosaminoglykaner. I tillegg ble suksessen til denne teknikken demonstrert ved hjelp av heparinsulfat isolert fra hele lungehomogenat, noe som ga en god mengde isolert heparinsulfat, med de minste fragmentene som tilsvarer omtrent 10 disakkaridunderenheter i masse.Det er veldig viktig å bruke nylagde reagenser, og å filtrere alle reagenser som brukes i denne protokollen. Det er viktig å bruke reagenser av høyeste renhet og kvalitet for å kunne utføre denne teknikken.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Helle og kjøre en Protein Gel ved å gjenbruke Kommersielle Kassetter

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gelelektroforese for separasjon av DNA-fragmenter

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Påvisning av Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler ved PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Fremstilling av DNA-kryssbundet polyakrylamid Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...