Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Эта работа финансировалась F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL и EPS)

Все биологические образцы, проанализированные в этом протоколе, были получены от мышей в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо.
1. Выделение сульфата гепарана
<ol><li>Делипидация образцов ткане?...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

ГАГ играют центральную роль во многих разнообразных биологических процессах. Одной из основных функций сульфатированных GAG (таких как HS и CS) является взаимодействие с лигандами и связывание с них, которые могут изменять последующие сигнальные функции. Важным фактором, определяющим сро...

Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой разнообразное семейство линейных полисахаридов, которые являются повсеместным элементом в живых организмах и способствуют многим основным физиологическим процессам1. ГАГ, такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), могут быть сульфатированы в различных положениях вдоль полисахаридной цепи, придав географическим доменам отрицательный заряд. Эти GAG, будучи привязанными к белкам клеточной поверхности, известным как протеогликаны, проецируются во внеклеточное пространство и связываются с родственными лигандами, что позволяет регуляцию как цис- (лиганд, прикрепленный к одной и той же клетке), так и транс- (лиганд, прикрепленный к соседней клетке) сигнальных процессов2. Кроме того, ГАГ также выполняют решающую роль в качестве структурных элементов в тканях, таких как клубочковая базальная мембрана3,сосудистый эндотелиальный гликокаликс4 и легочный эпителиальный гликокаликс5,а также в соединительных тканях, таких как хрящ6.
Длина полисахаридных цепей GAG существенно варьируется в зависимости от ее биологического контекста и может динамически удлигаться, расщепляться и модифицироваться очень сложной ферментативной регуляторной системой7. Важно отметить, что длина полимерных цепей GAG существенно способствует их сродству связывания к лигандам и, впоследствии, их биологической функции8,9. По этой причине определение функции эндогенной ГАГ требует оценки ее размера. К сожалению, в отличие от белков и нуклеиновых кислот, существует очень мало легкодоступных методов обнаружения и измерения ГАГ, что исторически привело к относительно ограниченному исследованию биологических ролей этого разнообразного семейства полисахаридов.
В этой статье описывается, как изолировать и очищать ГАГ из большинства биологических тканей, а также описывается, как использовать электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) для оценки длины выделенных полимеров с достаточной степенью специфичности. В отличие от других, очень сложных (и часто основанных на масс-спектрометрии) гликомических подходов, этот метод может быть использован с использованием стандартного лабораторного оборудования и методов. Таким образом, этот практический подход может расширить возможности исследователей по определению биологической роли нативных ГАГ и их взаимодействия с контекстуально важными лигандами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Сульфатированные гликозаминогликаны (GAGs), такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), повсеместно распространены в живых организмах и играют решающую роль в различных основных биологических структурах и процессах. В качестве полимеров GAG существуют в виде полидисперсной смеси, содержащей полисахаридные цепи, которые могут варьироваться от 4000 Да до более 40 000 Да. Внутри этих цепей существуют домены сульфатации, приделяющие паттерн отрицательного заряда, который облегчает взаимодействие с положительно заряженными остатками родственных белковых лигандов. Сульфатированные домены ГАГ должны быть достаточной длины, чтобы обеспечить эти электростатические взаимодействия. Чтобы понять функцию ГАГ в биологических тканях, исследователь должен быть в состоянии изолировать, очистить и измерить размер ГАГ. В этом отчете описывается практический и универсальный метод электрофореза на основе полиакриламидного геля, который может быть использован для устранения относительно небольших различий в размерах между GAG, выделенными из различных типов биологических тканей.

Альциановый синий используется для окрашивания сульфатированных GAGs 10; этот сигнал усиливается с помощью последующего серебряного пятна 11. На рисунке 1 представлена наглядная демонстрация процесса развития окрашивания серебром. Как было пока?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

В этом отчете описываются методы выделения и очистки сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) из биологических образцов и подход электрофореза полиакриламидного геля для приближения их размера. ГАГ способствуют структуре тканей и влияют на сигнальные процессы посредством электростатического взаимодействия с белками. Длина полимера GAG способствует их сродству связыванию с родственными лигандами.

Обнаружение гликозаминогликанов методом электрофореза полиакриламидного геля и окрашивания серебра

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Этот протокол описывает простую технику, которая может быть использована для обнаружения присутствия и измерения длины гликозаминогликанов, которые являются молекулами, все более признанными для многих биологических процессов. Этот метод легко адаптируется к большинству лабораторий наук о жизни. Сопоставимые гликомические методы часто требуют оборудования и опыта, которые можно найти только в исследовательских лабораториях гликохимии.Этот метод может быть особенно полезен для исследователей, которые заинтересованы в изучении гликокаликса, полисахаридной оболочки, которая выстилает эндотелиальные и эпителиальные поверхности человеческого тела. Начните с помещения пустой кассеты в бак PAGE. Отлить рассасывающий гель, смешав 10 миллилитров раствора рассасывающего геля с 60 микролитрами свежеприготовленного 10% персульфата аммония в 15-миллилитровой пробирке.Затем добавьте 10 микролитров TEMED. Осторожно переверяют трубку два-три раза. Быстро добавьте 10 миллилитров активированного раствора полиакриламидного геля в кассету с помощью пипетки.Наложить два миллилитра деионизированной фильтрованной воды и дать рассасывающейся гелю полимеризоваться в течение 30 минут. После того, как рассасывающий гель полностью полимеризуется, отбросьте наложенную воду. Отлить укладочный гель, смешав три миллилитра раствора укладывающего геля с 90 микролитрами свежеприготовленного 10%-го персульфата аммония в 15-миллилитровой трубке.Затем добавьте три микролитра TEMED и аккуратно переверглите трубку два-три раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить раствор геля для укладки поверх затвердевания разрешающего геля до тех пор, пока кассета не будет заполнена до краев. Полностью вставьте гребень, входящий в комплект пустой кассеты с полиакриламидным гелем, и дайте укладываемый гель полимеризоваться в течение 30 минут.После полимеризации геля снимите ленточную полоску со дна кассеты и поместите кассету обратно в сборку резервуара PAGE. Заполните верхнюю и нижнюю камеры соответствующими буферными растворами. Растворяют высушенные образцы гликозаминогликана в минимально необходимом объеме деионизированной фильтрованной воды и смешивают с буфером загрузки проб в соотношении один к одному.Загрузите образцы и олигосахаридные лестницы HS в гель. Предварительно запустите гель в течение пяти минут при 100 вольтах, затем запустите его при 200 вольтах в течение 20-100 минут, в зависимости от процента акриламида в растворяющейся гелевой растворе. Как только запуск будет завершен, разберите кассету и аккуратно извлеките гель в большой чистый контейнер, наполненный деионизированной фильтрованной водой.Затем отбросьте воду и окрасьте гель в альциановом синем окрашивательном растворе в течение пяти минут. Отбросьте синее пятно Alcian и быстро промойте два-три раза деионизированной фильтрованной водой, пока большая часть раствора для окрашивания Alcian blue не будет удалена. Окрасите гель раствором для окрашивания нитратом серебра в свежую чистую емкость на 30 минут.Затем промыть два-три раза в течение 30 минут каждый в деионизированной фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра. Выбрасываем воду и добавляем развивающий раствор. Внимательно следите за гелем для появления полос.В зависимости от качества пятна и массы загруженного образца, разработка может занять от нескольких секунд до нескольких минут. Как только будут видны нужные полосы, немедленно отбросьте развивающийся раствор и ненадолго промойте гель раствором СТОП. Изолированные и очищенные гликозаминогликаны визуализировали с использованием техники окрашивания алциановым синим и серебристым цветом после плотнозависимого разрешения электрофорезом полиакриламидного геля.Как видно на этом рисунке, олигосахариды гепарана сульфата различной длины полимера были легко обнаружены с использованием этого подхода, основанного на PAGE. Предел обнаружения этого метода, всего 0,5 микрограмма, показывает, что метод очень чувствителен при обнаружении гликозаминогликанов, выделенных и очищенных из биологических образцов. Из четырех различных олигосахаридов гепарина сульфата, визуализированных с использованием этого метода, нефракционированный гепарин был наименее легко обнаруживаем.Из-за полидисперсности нефракционированного гепарина плотность каждой отдельной полосы из этого образца ниже, чем полос, образующихся равной массой очищенных олигосахаридов гепарина. Эффективность очистки гликозаминогликанами из жидких биологических образцов оценивали с использованием образцов бронхоальвеолярного лаважа, собранных у мышей, которые первоначально содержали относительно низкие концентрации гликозаминогликанов. Кроме того, успех этого метода был продемонстрирован с использованием гепарина сульфата, выделенного из цельного гомогената легких, который дал достаточное количество изолированного гепарина сульфата, причем мельчайшие фрагменты равны примерно 10 субъединицам дисахарида по массе.Очень важно использовать свежеприготовленные реагенты и фильтровать каждый реагент, используемый в этом протоколе. Для успешного выполнения этой методики очень важно использовать реагенты высочайшей чистоты и качества.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Денатурирующих Электрофорез Градиент гель (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Быстро и чувствительной Коллоидное Кумасси G-250 для окрашивания белков в полиакриламидном геле

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Денатурирующих Мочевина полиакриламидном геле (мочевина PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Выявление функциональных матриксных металлопротеиназ по Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Заливка и запуск Белки гель за счет повторного использования коммерческих Кассеты

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Обнаружение эфир<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; O157: H7 Клетки по PMA-кПЦР

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Подготовка ДНК-сшитый полиакриламидных гидрогелей

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...