Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detta arbete finansierades av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL och EPS)

Alla biologiska prover som analyserades i detta protokoll erhölls från möss, enligt protokoll som godkänts av University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfat isolering
<ol><li>Delipidation av vävnadsprover OBS: Delipidation är ett valfritt steg för fettrika vävnader.<ol>
<li>Gör en 1:1 blandning av metanol och diklormetan. Bered cirka 500 μL per prov; större vävnadsbitar kan kräva upp till 1 ml.</li>
		<li>Placera varje v...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

God redovisningssed spelar en central roll i många olika biologiska processer. En av de viktigaste funktionerna hos sulferade GAGs (som HS och CS) är att interagera med och binda till ligands, vilket kan ändra nedströms signalfunktioner. En viktig determinant för GAG-bindande affinitet till konjak ligands är längden på GAG-polymerkedjan 8,9,14. Därför är det viktigt att forskare med rimlig precision kan definiera stor...

Glykosaminoglykaner (GAGs) är en mångfaldig familj linjära polysackarider som är ett allestädes närvarande element i levande organismer och bidrar till många grundläggande fysiologiska processer1. GAGs såsom heparan sulfat (HS) och kondroitin sulfat (CS) kan sulferas i distinkta positioner längs polysackaridkedjan, vilket ger geografiska domäner av negativ laddning. Dessa GAGs, när de är bundna till cell-ytproteiner som kallas proteoglykaner, projicerar i det extracellulära utrymmet och binder till konjak ligands, vilket möjliggör reglering av både cis- (ligand fäst vid samma cell) och trans- (ligand fäst vid angränsande cell) signaleringsprocesser2. Vidare utför GAGs också kritiska roller som strukturella element i vävnader som glomerulärtkällarmembran 3, vaskulär endotel glycocalyx4 och pulmonell epitelial glykocalyx5, och i bindväv sådan brosk6.
Längden på GAG-polysackaridkedjor varierar avsevärt beroende på dess biologiska sammanhang och kan dynamiskt förlängas, klyvas och modifieras av ett mycket komplext enzymatiskt regleringssystem7. Viktigt är att längden på GAG-polymerkedjor bidrar väsentligt till deras bindande affinitet för ligands och därefter till deras biologiska funktion8,9. Av denna anledning kräver bestämning av funktionen hos en endogen GAG uppskattning av dess storlek. Till skillnad från proteiner och nukleinsyror finns det tyvärr mycket få lättillgängliga tekniker för att upptäcka och mäta god redovisningssed, vilket historiskt sett har resulterat i en relativt begränsad undersökning av de biologiska rollerna för denna mångskiftande polysackaridfamilj.
Denna artikel beskriver hur man isolerar och renar GAGs från de flesta biologiska vävnader, och beskriver också hur man använder polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) för att utvärdera längden på de isolerade polymererna med en rimlig grad av specificitet. I motsats till andra, mycket komplexa (och ofta masspektrometribaserade) glykemiska metoder kan denna metod användas med hjälp av standard laboratorieutrustning och tekniker. Detta praktiska tillvägagångssätt kan därför utöka utredarnas förmåga att bestämma den biologiska rollen för inhemska god redovisningssed och deras interaktion med kontextuellt viktiga ligands.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) såsom heparansulfat (HS) och kondroitinsulfat (CS) är allestädes närvarande i levande organismer och spelar en avgörande roll i en mängd grundläggande biologiska strukturer och processer. Som polymerer finns GAGs som en polydisperseblandning som innehåller polysackaridkedjor som kan variera från 4000 Da till väl över 40 000 Da. Inom dessa kedjor finns domäner av sulfation, vilket ger ett mönster av negativ laddning som underlättar interaktion med positivt laddade rester av konjakprotein ligands. Sulferade områden av gags måste vara tillräckligt långa för att möjliggöra dessa elektrostatiska interaktioner. För att förstå gags funktion i biologiska vävnader måste prövaren kunna isolera, rena och mäta storleken på GAGs. Denna rapport beskriver en praktisk och mångsidig polyakrylamid gel elektrofores-baserade teknik som kan utnyttjas för att lösa relativt små skillnader i storlek mellan GAGs isolerade från en mängd olika biologiska vävnadstyper.

Alcian blå används för att färga sulferade GAGs 10; denna signal förstärks med hjälp av en efterföljande silverfläck 11. Figur 1 ger en visuell demonstration av silverfärgningsprocessen. Som visats förstärks den alciensblå signalen som representerar GAGs åtskilda av elektrofores när utvecklingsmedlet tränger in i polyakrylamidgelen. Vanligtvis kommer utvecklingsprocessen att minska silver och alciansk blåfärgade GAGs på ett d...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Denna rapport beskriver tekniker för att isolera och rena sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) från biologiska prover och en polyakrylamid gel elektrofores strategi för att approximera deras storlek. GAGs bidrar till vävnadsstruktur och påverkar signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer längd bidrar till deras bindande affinitet för konjak ligands.

Detektion av glykosaminoglykaner av polyakrylamidgelelektrofores och silverfärgning

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Detta protokoll beskriver en enkel teknik som kan användas för att upptäcka närvaron och mäta längden på glykosaminoglykaner, som är molekyler av alltmer erkänd betydelse för många biologiska processer. Denna teknik är lätt anpassningsbar till de flesta life science-laboratorier. Jämförbara glykemiska tekniker kräver ofta utrustning och expertis som endast finns i glykonemistry forskningslaboratorier.Denna teknik kan vara särskilt användbar för forskare som är intresserade av att studera glykokalyx, en polysackaridbeläggning som linjerar den mänskliga kroppens endotel- och epitelytor. Börja med att placera en tom kassett i PAGE-tanken. Gjut en lösningsgel genom att blanda 10 milliliter lösningsgellösning med 60 mikroliter nyberedd vid 10% ammoniumpersulfat i ett 15 milliliter rör.Lägg sedan till 10 mikroliter TEMED. Vänd försiktigt röret två till tre gånger. Tillsätt snabbt 10 milliliter av den aktiverade polyakrylamidgellösningen i kassetten med en pipett.Överlägg med två milliliter av avjoniserat filtrerat vatten och låt den lösande gelén polymeriseras i 30 minuter. När lösningsgelen har polymeriserats helt, kassera det överlagda vattnet. Gjut staplingsgelen genom att blanda tre milliliter staplingsgellösning med 90 mikroliter nyberedd 10% ammoniumpersulfat i ett 15 milliliter rör.Tillsätt sedan tre mikroliter TEMED och vänd försiktigt röret två till tre gånger. Använd en pipett för att snabbt lägga till staplingsgellösningen över den stelnade lösningsgelen tills kassetten är fylld till brädden. Sätt helt in kammen som medföljer den tomma polyakrylamidgelkassetten och låt staplingsgelen polymerisera i 30 minuter.När gelén har polymeriserats tar du bort tejpremsan från kassettens botten och placerar kassetten tillbaka i PAGE-tankens sammansättning. Fyll de övre och nedre kamrarna med respektive buffertlösningar. Lös upp torkade glykosaminoglykanprover i den minsta nödvändiga volymen av avjoniserat filtrerat vatten och blanda med provbelastningsbuffert i ett en-till-ett-förhållande.Ladda proverna och HS oligosackaridstegarna i gelén. Kör gelén i fem minuter vid 100 volt och kör den sedan på 200 volt i 20 till 100 minuter, beroende på akrylamidprocenten för den lösande gellösningen. När körningen är klar demonterar du kassetten och extraherar försiktigt gelén i en stor ren behållare fylld med avjoniserat filtrerat vatten.Kassera sedan vattnet och färga gelén i alciansk blå färgningslösning i fem minuter. Kassera den alciska blå fläcken och tvätta snabbt två till tre gånger med avjoniserat filtrerat vatten tills det mesta av den alcianska blå färgningslösningen har tagits bort. Färga gelén i silvernitratfärgningslösning i en färsk ren behållare i 30 minuter.Tvätta sedan två till tre gånger i 30 minuter vardera i avjoniserat filtrerat vatten för att helt ta bort silverfärgningslösningen. Kassera vattnet och tillsätt utvecklingslösning. Observera försiktigt gelén för utseendet på band.Beroende på fläckens kvalitet och massan på det laddade provet kan utvecklingen ta allt från några sekunder till flera minuter. Så snart de önskade banden är synliga, kassera omedelbart utvecklingslösningen och tvätta gelén kort med STOP-lösning. Isolerade och rena glykosaminoglykaner visualiserades med alcian blå och silver färgning teknik efter densitet beroende upplösning av en polyakrylamid gel elektrofores.Som ses i denna siffra var heparan sulfat oligosaccharides av olika polymer längder lätt detekterbara med hjälp av denna SIDA baserade tillvägagångssätt. Detektionsgränsen för denna metod, så låg som 0,5 mikrogram, visar att tekniken är mycket känslig för att upptäcka glykosaminoglykaner som isolerats och renats från biologiska prover. Av de fyra olika heparin sulfat oligosaccharides visualiserades med denna metod, var unfractionated heparin minst lätt detekterbar.På grund av polydispersiteten hos ofraktionerad heparin är densiteten hos varje enskilt band från detta prov lägre än de band som produceras av en lika stor massa renade heparin oligosackarider. Effektiviteten av glykosaminoglykan rening från flytande biologiska prover bedömdes med hjälp av bronchoalveolar lavage prover samlas in från möss, som ursprungligen innehöll relativt låga koncentrationer av glykosaminoglykaner. Dessutom visades framgången för denna teknik med heparin sulfat isolerad från hela lung homogenate, som gav en stor mängd isolerade heparin sulfat, med de minsta fragmenten som motsvarar cirka 10 disackarid underenheter i massa.Det är mycket viktigt att använda nyberedda reagenser och att filtrera varje reagens som används i detta protokoll. Det är viktigt att använda reagenser av högsta renhet och kvalitet för att framgångsrikt utföra denna teknik.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturering Gradient gelelektrofores (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Screening för Amyloid aggregation av Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Snabb och känslig Kolloidal Coomassie G-250 Färgning för proteiner i polyakrylamidgeler

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturering Urea polyakrylamidgelelektrofores (urea SIDA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blå Native polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) för analys av Multiproteinkomplex från Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Upptäckt av Funktionell metalloproteinaser av Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Hälla och köra ett protein Gel genom att återanvända Commercial Kassetter

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosgelelektroföres för separation av DNA-fragment

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Upptäckt av Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 celler genom PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...