Name: detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Bu çalışma F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ve EPS) tarafından finanse edildi.

Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik örnekler, Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında farelerden elde edildi.
1. Heparan sülfat izolasyonu
<ol><li>Doku örneklerinin delipidasyonu NOT: Delipidasyon yağ bakımından zengin dokular için isteğe bağlı bir adımdır.<ol>
<li>Metanol ve dikloromethane karışımı 1:1 yapın. Numune başına yaklaşık 500 μL hazırlayın; daha büyük doku...

<ol>
	<li>LaRivi&#232;re, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS:+A+critical+role+for+heparan+sulfate.">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li><li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+the+developing,+healthy,+and+injured+lung.">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li><li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane.">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li><li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis.">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).</li><li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury.">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li><li>Mankin, H. J., Lippiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycosaminoglycans+of+normal+and+arthritic+cartilage.">The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage.</a> Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).</li><li>Annaval, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+biosynthesis+and+post+synthesis+mechanisms+combine+few+enzymes+and+few+core+proteins+to+generate+extensive+structural+and+functional+diversity.">Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity.</a> Molecules. 25 (18), (2020).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+interactions+of+different+growth+factors+and+glycosaminoglycans.">Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans.</a> Molecules. 24 (18), (2019).</li><li>Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structural+selectivity+of+synthetic+heparin+binding+to+Stabilin+protein+receptors.">Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).</li><li>Cowman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide-gel+electrophoresis+and+Alcian+Blue+staining+of+sulphated+glycosaminoglycan+oligosaccharides.">Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).</li><li>M&#248;ller, H. J., Poulsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+silver+staining+of+glycoproteins+in+thin+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels.">Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels.</a> Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).</li><li>Min, H., Cowman, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+alcian+blue+and+silver+staining+of+glycosaminoglycans+in+polyacrylamide+gels:+Application+to+electrophoretic+analysis+of+molecular+weight+distribution.">Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution.</a> Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).</li><li>Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+extensively+glycosylated+proteins+on+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels:+Enhancement+by+carbohydrate-binding+dyes.">Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes.</a> Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).</li><li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+prostaglandin+E1+(TLC+C-53)+in+acute+respiratory+distress+syndrome:+a+controlled,+randomized,+double-blind,+multicenter+clinical+trial.+TLC+C-53+ARDS+Study+Group.">Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group.</a> Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).</li><li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity.">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li><li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography.">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li><li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis:+A+review.">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).</li><li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes.">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein.">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li></ol>

GAG'ler birçok farklı biyolojik proseste merkezi bir rol oynar. Sülfatlı GAG'lerin (HS ve CS gibi) temel işlevlerinden biri, aşağı akış sinyal fonksiyonlarını değiştirebilen ligandlarla etkileşime girmek ve ligandlara bağlanmaktır. Gag bağlama benzeşiminin konyak ligandlarına önemli bir belirleyicisi GAG polimer zincirinin uzunluğu 8,9,14. Bu nedenle, araştırmacıların biyolojik ilgi örneklerinden izole...

Glikozaminogllikanlar (GAG'lar), canlı organizmalarda her yerde bulunan ve birçok temel fizyolojik işleme katkıda bulunan doğrusal polisakkaritlerin çeşitli bir ailesidir1. Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi GAG'ler polisakkarit zinciri boyunca farklı konumlarda sülfatlanabilir ve negatif yük coğrafi etki alanları verebilir. Bu GAG'ler, proteoglikanlar olarak bilinen hücre yüzeyi proteinlerine bağlandığında, hücre dışı alana yansıtır ve konyak ligandlarına bağlanır, hem cis- (aynı hücreye bağlı ligand) hem de trans- (komşu hücreye bağlı ligand) sinyal işlemlerinin düzenlenmesine izin verir2. Ayrıca, GAG'ler ayrıca glomerüler bodrum membranı3, vasküler endotel glikokaleks 4 ve pulmoner epitel glikokaleks5 ve kıkırdak6gibi bağdokularında yapısal elemanlar olarak kritik roller üstlenir.
GAG polisakkarit zincirlerinin uzunluğu biyolojik bağlamlarına göre önemli ölçüde değişir ve son derece karmaşık bir enzymatic düzenleyici sistem tarafından dinamik olarak uzatılabilir, bölünebilir ve değiştirilebilir7. Daha da önemlisi, GAG polimer zincirlerinin uzunluğu, ligandlar için bağlayıcı yakınlıklarına ve daha sonra biyolojik işlevlerine önemli ölçüde katkıda bulunur8,9. Bu nedenle, endojen bir GAG işlevinin belirlenmesi, boyutunun takdirini gerektirir. Ne yazık ki, proteinlerin ve nükleik asitlerin aksine, tarihsel olarak bu çeşitli polisakkarit ailesinin biyolojik rolleri hakkında nispeten sınırlı bir araştırma ile sonuçlanan GAG'leri tespit etmek ve ölçmek için çok az sayıda hazır teknik mevcuttur.
Bu makalede, GAG'lerin çoğu biyolojik dokudan nasıl izole ve saflaştırılacağı ve ayrıca izole polimerlerin uzunluğunu adil bir özgüllük derecesiyle değerlendirmek için poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE) nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Diğer, son derece karmaşık (ve genellikle kütle spektrometrisi bazlı) glikonik yaklaşımların aksine, bu yöntem standart laboratuvar ekipmanları ve teknikleri kullanılarak kullanılabilir. Bu nedenle, bu pratik yaklaşım, araştırmacıların yerel GAG'lerin biyolojik rolünü ve bağlamsal olarak önemli ligandlarla etkileşimlerini belirleme yeteneklerini genişletebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td>Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP170-100</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinase E</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Protease mix from S. griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC400460100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A639-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A669S-500</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure Pro Water Purification System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10-451-217PKG</td>
			<td>Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>B392-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>18-609-432</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC349610250</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3459901</td>
			<td>Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1656019</td>
			<td>any comparable vertical gel PAGE system will work)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>AC610931000</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>G48-500</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparanase I/III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3917</td>
			<td>From Flavobacterium heparinum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived decasaccharide (dp10)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived hexasaccharde (dp6)</td>
			<td>Galen scientific</td>
			<td>HO06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin derived oligosaccharide (dp20)</td>
			<td>galen scientific</td>
			<td>HO20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A466-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7752020</td>
			<td>Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (liquid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Gel Doc XR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8170</td>
			<td>Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP171-25</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>P74-10</td>
			<td>Free acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Mini H Ion Exchange Column</td>
			<td>Vivapure</td>
			<td>VS-IX01QH24</td>
			<td>Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S181-25</td>
			<td>certified ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>S392-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylenediamine)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>Electrophoresis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (solid)</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC500324</td>
			<td>Larger volume filter units may be used, depending on sample size.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (solid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume</td>
			<td>thermoFisher Scientific</td>
			<td>569-0020</td>
			<td>Alternative volumes and filter materials acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of glycosaminoglycans by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining

Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi sülfatlı glikozaminojenler (GAG' ler) canlı organizmalarda her yerde bulunur ve çeşitli temel biyolojik yapılarda ve süreçlerde kritik bir rol oynar. Polimerler olarak, GAG'ler 4000 Da ile 40.000 Da arasında değişebilen polisakkarit zincirleri içeren bir polidisperz karışımı olarak bulunur. Bu zincirlerde, kognate protein ligandlarının pozitif yüklü kalıntılarıyla etkileşimi kolaylaştıran bir negatif yük deseni veren sülfatlama alanları vardır. GAG'lerin sülfatlı etki alanları, bu elektrostatik etkileşimlere izin vermek için yeterli uzunlukta olmalıdır. GAG'lerin biyolojik dokulardaki işlevini anlamak için, araştırmacı GAG'lerin boyutunu izole edebilmeli, arındırabilmeli ve ölçebilmelidir. Bu rapor, çeşitli biyolojik doku tiplerinden izole edilen GAG'ler arasındaki nispeten küçük boyut farklılıklarını çözmek için yararlanılabilen pratik ve çok yönlü poliakrilamid jel elektroforez bazlı bir tekniği açıklar.

Alcian mavisi sülfatlı GAG 10'ulekelemede kullanılır; bu sinyal, sonraki gümüş leke 11kullanılarak yükseltilir. Şekil 1, gümüş boyama geliştirme sürecinin görsel bir gösterimini sağlar. Gösterildiği gibi, elektroforez ile ayrılmış GAG'leri temsil eden Alcian mavi sinyali, gelişen ajan poliakrilamid jeline nüfuz ettikçe yükseltilir. Tipik olarak, gelişen süreç gümüş ve Alcian mavi lekeli GAG'leri yoğunluğa bağ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining at JoVE.com

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Bu protokol, birçok biyolojik süreç için giderek daha fazla tanınan öneme sahip moleküller olan glikozaminojlikanların varlığını tespit etmek ve uzunluğunu ölçmek için kullanılabilecek basit bir tekniği açıklar. Bu teknik çoğu yaşam bilimleri laboratuvarına kolayca uyarlanabilir. Karşılaştırılabilir glikomik teknikler genellikle sadece glikokimya araştırma laboratuvarlarında bulunan ekipman ve uzmanlık gerektirir.Bu teknik, insan vücudunun endotel ve epitel yüzeylerini kaplayan bir polisakkarit kat olan glikokaloksisi incelemek isteyen araştırmacılar için özellikle yararlı olabilir. PAGE tankına boş bir kaset yerleştirerek başlayın. 15 mililitrelik bir tüpte%10 amonyum perülfatta taze hazırlanmış 60 mikrolitre ile 10 mililitre çözülen jel çözeltisini karıştırarak bir çözen jel atın.Daha sonra 10 mikrolitre TEMED ekleyin. Tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Bir pipet kullanarak kasete 10 mililitre aktif poliakrilamid jel çözeltisi ekleyin.İki mililitre deiyonize filtrelenmiş su ile kaplama yapın ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın. 15 mililitrelik bir tüpte üç mililitre istifleme jeli çözeltisini 90 mikrolitre taze hazırlanmış% 10 amonyum persülfat ile karıştırarak istifleme jelini dökin.Daha sonra üç mikrolitre TEMED ekleyin ve tüpü iki ila üç kez hafifçe ters çevirin. Kaset ağzına kadar doldurulana kadar istifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın. Boş poliakrilamid jel kaseti ile birlikte verilen tarağı tamamen yerleştirin ve istifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını bekleyin.Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridini kasetin altından çıkarın ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin. Üst ve alt odaları ilgili tampon çözeltileriyle doldurun. Kurutulmuş glikozaminoglisecan numunelerini gerekli minimum deiyonize filtrelenmiş su hacminde çözün ve numune yükleme tamponu ile bire bir oranında karıştırın.Numuneleri ve HS oligosaccharide merdivenlerini jel içine yükleyin. Jeli 100 voltta beş dakika önceden çalıştırın, ardından çözücü jel çözeltisinin akrilamid yüzdesine bağlı olarak 20 ila 100 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve jeli deiyonize filtrelenmiş su ile dolu büyük ve temiz bir kaba dikkatlice çıkarın.Daha sonra suyu atın ve jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde beş dakika lekeleyin. Alcian mavisi lekeyi atın ve Alcian mavisi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar deiyonize filtrelenmiş suyla iki ila üç kez hızlı bir şekilde yıkayın. Jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde taze temiz bir kapta 30 dakika lekeleyin.Daha sonra gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için her biri deiyonize filtrelenmiş suda 30 dakika boyunca iki ila üç kez yıkayın. Suyu atın ve gelişen çözeltiyi ekleyin. Bantların görünümü için jeli dikkatlice gözlemleyin.Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir. İstenilen bantlar görünür olmaz, hemen gelişen çözeltiyi atın ve jeli STOP çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanlar, poliakrilamid jel elektroforezi ile yoğunluğa bağımlı çözünürlükten sonra Alcian mavisi ve gümüş boyama tekniği kullanılarak görselleştirildi.Bu şekilde görüldüğü gibi, farklı polimer uzunluklarındaki heparan sülfat oligosakkaritleri bu PAGE tabanlı yaklaşım kullanılarak kolayca tespit edilebilen bir yapıya sahip. Bu yöntemin tespit sınırı, 0,5 mikrogram kadar düşük, tekniğin biyolojik örneklerden izole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminojlikanların tespitinde oldukça hassas olduğunu göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak görselleştirilen dört farklı heparin sülfat oligosakkaritten, kırılmamış heparin en az kolayca tespit edilebilirdi.Kırılmamış heparinin polidispersitesi nedeniyle, bu örnekten her bir bandın yoğunluğu, eşit saflaştırılmış heparin oligosakkarit kütlesi tarafından üretilen bantlardan daha düşüktür. Sıvı biyolojik örneklerden glikozaminojlikan saflaştırmanın verimliliği, başlangıçta nispeten düşük glikozamininogllikan konsantrasyonları içeren farelerden toplanan bronkoalveoler lavaj örnekleri kullanılarak değerlendirildi. Ek olarak, bu tekniğin başarısı, kütle olarak yaklaşık 10 disakkarit alt birimine eşit olan en küçük parçalarla, geniş miktarda izole heparin sülfat veren tüm akciğer homojenatından izole edilmiş heparin sülfat kullanılarak gösterilmiştir.Yeni hazırlanmış reaktiflerin kullanılması ve bu protokolde kullanılan her reaktifin filtrelenerek filtrelenerek kullanılması çok önemlidir. Bu tekniği başarıyla gerçekleştirmek için en yüksek saflıkta ve kalitede reaktifler kullanmak çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denatüre Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

DNA çapraz bağlı poliakrilamid hidrojellerinin hazırlanışı

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...