Name: preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block
Uploaded: 2021-04-08T14:00:00
Duration: 6 min 10 s
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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros da Seção de Biologia Estrutural & Sintética do Imperial College London que ajudaram a testar essas técnicas, bem como Harry Barnett no Imperial College Advanced Hackspace, e Paul Simpson no Centro de Biologia Estrutural. A CHSA é apoiada por uma Bolsa Sir Henry Dale financiada conjuntamente pela Wellcome Trust e pela Royal Society (206212/Z/17/Z).

1. Preparação geral da transferência de pré-suporte das grades TEM
<ol><li>Utilizando um par de pinças limpas e finas, levante e submerse as grades TEM sequencialmente em água duplamente destilada (ddH2O) ou água ultrapura para 10-15 s, seguida por acetato de etila, para 10-15 s. NOTA: Aqui, foram utilizadas pinças de ação negativa, oblíquas.</li>
	<li>Coloque a pinça, com grade ainda em aderência, de um lado para secar ao ar por ~5 min.</li>
	<li>Limpe as grades para remover a superfície de quaisquer contaminantes acumulados através das etapas de lavagem ou lavagem. NOTA: Aqui, a limpeza de plasma foi feita para 10-15 s no ar com um poder de radiofrequência de 25 W.</li>
</ol>2. Preparação geral de soluções de reagente
<ol><li>Solução de acetato deuranyl (UAc) (2% c/v)<ol>
<li>Enrole um tubo de 50 mL em papel alumínio, encha com 50 mL de água ultrauso e adicione 1 g de pó UAc. NOTA: O UAc é sensível à luz e precipita-se ao longo do tempo quando exposto. Como a UAc é radioativa e tóxica, mantenha um alto nível de limpeza. Com o risco mais grave decorrente da inalação ou ingestão, deve-se tomar cuidado extra para evitar qualquer possibilidade de inalação de partículas finas. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear ou pesar os sais de urânio. Máscaras e óculos altamente recomendados. Os sais de urânio devem ser eliminados de acordo com os requisitos legais estabelecidos para os riscos radioativos no estado.</li>
		<li>Deixe a solução mexendo por 1h para permitir que todo o UAc se dissolva. Armazene a 4°C.</li>
		<li>Antes de usar, filtrar 1 mL da solução de manchas em um pequeno frasco usando filtro de 0,22 μm para remover quaisquer cristais de acetato restantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspensão de óxido de grafeno (GrOx)<ol>
<li>Pipeta 2,5 μL de GrOx em um tubo de 1,5 mL (concentração final de 1%). Pipeta 2,5 μL de 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) detergente no GrOx, e misturar suavemente (0,1% (w/v) concentração final). </li>
		<li>Adicione 245 μL de água ultrauso à mistura GrOx-DDM e imediatamente o vórtice vigorosamente por 5 min. Use a suspensão GrOx dentro de 1h de preparação, vórtice vigorosamente por pelo menos 1 minuto antes do uso imediato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de cloreto de ferro (III) (FeCl3) (10% c/v)<ol>
<li>Pesar cuidadosamente 5 g de FeCl3 em um barco de pesagem. Transfira para um cilindro de medição de 100 mL contendo 35 mL de ddH2O e uma barra de agitação magnética.</li>
		<li>Coloque em uma placa de agitação magnética, e dissolva o FeCl3, adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Filtre a solução FeCl3 através de um filtro de seringa de 0,8 μm em uma garrafa limpa para armazenamento. NOTA: FeCl3 é corrosivo e irritante; lavar as mãos e outras áreas expostas com sabão e água suaves antes de comer, beber ou fumar e quando sair do trabalho. Fornecer boa ventilação na área de processo para evitar a formação de vapor. Não respire névoa, vapores, spray. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear ou pesar o sal. Máscaras e óculos altamente recomendados sempre que estiver em uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Troca tampão por filmes de suporte a carbono em mica para preparar amostras manchadas negativamente usando o bloco de flutuação de suporte
<ol><li>Lavar e limpar plasma as grades TEM. NOTA: Aqui, 300 redes de cobre de carbono furado de malha foram usadas conforme descrito acima na seção 1.</li>
	<li>Pipeta 10-12 μL de amostra no poço de troca de buffer (com os pequenos canais) do bloco de flutuação e 10-12 μL de solução UAc de 2% (ver seção 2.1) para coloração negativa no poço de troca não tampão adjacente. NOTA: O poço tem um volume de 10 μL; no entanto, ajuste o volume da amostra para que um menisco convexo seja formado na superfície do líquido para permitir flutuação adequada do filme. Um baixo volume de amostra pode causar quebra de filme.</li>
	<li>Corte cuidadosamente dois pequenos pedaços de mica com filme de carbono pré-colocado no topo. Certifique-se de que os fragmentos de mica são largos o suficiente para caber no poço (largura de 3,4 mm) e mais longos que o comprimento do poço (3,45 mm), de tal forma que o fragmento se sentará no poço enquanto o carbono estiver flutuando, e haja espaço suficiente para manusear o fragmento com a pinça. NOTA: Para manusear o carbono, use pinças de ponta longa de ação negativa plana. Ao cortar os fragmentos de mica, corte usando movimentos únicos para manter a integridade do filme de carbono.</li>
	<li>Mergulhe o mica no poço com um ângulo aproximado de 45° até que o mica se sente na rampa do poço e uma camada de carbono seja observada na superfície da amostra líquida.</li>
	<li>Após a incubação inicial da amostra (tipicamente de 20 a 20 minutos, dependendo da adesão da amostra; otimizar esse período com base em necessidades experimentais), retire a folha de mica muito lentamente para recuperar o filme de carbono e minimizar a retenção residual da amostra viscosa.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente o mica tocando a superfície inferior (lado não carbono) com papel filtro para remover o excesso de líquido e, posteriormente, troque o carbono que leva a amostra para a mancha negativa por aplicação ao poço oposto (ou seja, mergulhe o mica como na etapa 3.4) contendo a solução UAc de 2%. NOTA: Uma camada de carbono deve ser observada flutuando em cima da solução de manchas neste momento.</li>
	<li>Recupere a camada de carbono flutuante com o lado furado coberto de carbono de uma rede EM lavada e limpa por plasma. Deixe as grades secas até que a imagem esteja em um TEM. O ideal é cobrir as grades durante o processo de secagem para evitar contaminação no ar.</li>
</ol>4. Aplicação do bloco de flutuação de suporte para preparar grades TEM revestidas de óxido de grafeno
<ol><li>Lavar e limpar as grades TEM limpas com plasma usando 300 redes de cobre de carbono furado de malha, conforme descrito acima (seção 1).</li>
	<li>Pipeta 10-12 μL de suspensão GrOx (ver seção 2.2) nos 4 poços de troca não tampão ao longo do bloco de flutuação. Pipeta 10-12 μL ddH2O ou água ultrauso nos 4 poços de troca de buffer restantes do bloco. NOTA: Este volume de água deve ser suficiente para formar um leve menisco convexo acima da altura do bloco.</li>
	<li>Solte 4 grades suavemente na suspensão grOx de cada poço por 1 minuto, garantindo que o lado furado coberto de carbono faça contato com a solução. Após 1 min, recupere cada grade cuidadosamente deslizando as pinças para o sulco da pinça de cada poço de troca não tampão.</li>
	<li>Toque suavemente e brevemente o lado de cobre, não coberto de carbono de cada grade para o ddH2O no poço adjacente. Em seguida, segure cuidadosamente e suavemente a grade, lado da gota d'água para baixo, contra um pedaço de papel filtro. NOTA: A mancha da água atrairá a suspensão grox através da grade por ação capilar. É crucial evitar submergir a grade no ddH2O, por isso o contato deve ser muito breve. Quando a rede é levantada, uma gota de água deve segurar na parte inferior da grade. Tome cuidado para não mover a grade no papel do filtro, pois isso pode perturbar a resolução dos flocos grOx.</li>
	<li>Deixe as grades nas pinças secas ao ar até a preparação com a amostra. O ideal é cobrir as grades durante o processo de secagem para evitar contaminação no ar.</li>
</ol>5. Aplicação do bloco de flutuação de suporte para a preparação de amostras em filmes de monocamadas-grafeno
<ol><li>Lave as grades TEM conforme descrito acima (seção 1), mas omitindo a limpeza plasmática. NOTA: Aqui, 300 redes de ouro de carbono furado de malha foram usadas, mas outras redes não-cobre ou redes de liga de cobre também são viáveis.</li>
	<li>Para depositar grades com grafeno, transfira diretamente do grafeno cultivado em substratos de cobre (Cu-grafeno) para grades crio-EM, como descrito anteriormente25.<ol>
<li>Coloque quatro grades lavadas em cima de uma folha de Cu-grafeno (10 mm × 10 mm) depositadas em um slide de vidro e cubra cada grade com uma gota de isopropanol (5-10 μL) para permitir contato íntimo entre o grafeno da monocamada e a grade. NOTA: Certifique-se de colocar o lado furado coberto de carbono das grades em contato com a folha de grafeno.</li>
		<li>Quando o isopropanol estiver completamente evaporado (tipicamente 2h), flutue a folha de Cu-grafeno com grades em 10% (w/v) solução FeCl3 (ver seção 2.3) em uma placa de vidro Petri, e deixe gravar à temperatura ambiente durante a noite. Cubra o prato para evitar contaminação pelo ar. NOTA: Após a gravação estar completa, apenas a monocameira de grafeno permanecerá flutuando na solução FeCl3 - isso deve ser visível aos olhos com iluminação adequada.</li>
		<li>Use um laço com diâmetro maior que o tamanho da grade TEM para pescar as grades flutuando na monocamadora de grafeno, e transfira cuidadosamente para uma placa de vidro Petri contendo ddH2O para lavar. NOTA: Seja extremamente cauteloso ao pescar as grades para evitar bater nas paredes da placa de Petri, o que pode causar quebra ou dobra de filme de grafeno.</li>
		<li>Lave mais duas vezes na água por redes de pesca e transfira para uma placa de Petri limpa contendo ddH2O para remover todo o FeCl3 residual. Finalmente, transfira as grades para uma placa de Petri contendo tampão de amostra até a preparação da amostra e o congelamento do mergulho. NOTA: O lado coberto de grafeno das grades deve ser sempre molhado para evitar sua exposição a contaminantes no ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipeta a amostra (10-12 μL) em um poço de troca não tampão do bloco de flutuação. Quando a amostra estiver pronta no bloco, escolha uma grade revestida de grafeno da solução tampão usando um par de pinças limpas e coloque na superfície do poço contendo amostras.</li>
	<li>Após um período de incubação adequado (1-5 min dependendo da amostra; otimizar de acordo com as necessidades experimentais), escolha a grade com um par de pinças de congelamento limpo, e proceda com manchas e vitrificação.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não estão cientes de quaisquer conflitos de interesse em relação a este trabalho.

Este artigo apresenta protocolos para manuseio de ambos os filmes amorfos de carbono e grafeno para preparação de amostras crio-EM usando um bloco de flutuação de amostra27. Um arquivo STL para o bloco de suporte está livremente disponível no repositório thingiverse público [www.thingiverse.com/thing:3440684], e pode ser impresso em 3D com qualquer impressora estereotipada adequada a partir de uma resina adequada. O uso de filmes de carbono cobrindo uma grade TEM geralmente envolve a flutuação de carbono na amostra28. Essa abordagem para o preparo de redes de manchas negativas minimiza a exposição ao ar durante o manuseio do suporte, reduzindo assim a contaminação e a desnaturação de proteínas. A preparação de grades usando carbono flutuante em pequenos poços é vantajosa para flutuar uma área de superfície maior, ou seja, em um banho de água ou placa de Petri, nesse caso a tesoura mecânica do carbono ocorre muito mais facilmente.
A UAc pode ser difícil de comprar devido às normas de saúde e segurança vigentes no momento da publicação. Muitos outros reagentes de coloração comumente usados, não radioativos e negativos estão disponíveis, e protocolos para sua preparação foram descritos anteriormente29. Embora as manchas alternativas não tenham sido utilizadas com este bloco de flutuação de suporte, não é provável que haja diferenças nesses protocolos além da otimização do tempo de incubação com a amostra (etapa 3.5), que já é inerentemente dependente da amostra. O passo chave neste protocolo de preparação de suporte grOx é o passo 4.4, destacado pela nota para evitar que a solução de água e GrOx entre em contato ao redor da borda da grade. A mistura inadequada da água e das soluções grOx impede a fixação unidirecional dos flocos de GrOx por ação capilar. Ter flocos de GrOx em ambos os lados da folha de carbono resulta em camadas grossas, negando assim as vantagens de usar GrOx como suporte de camada quase única, bem como prender água entre os flocos, o que causa contaminação de áreas utilizáveis com camadas adicionais de gelo. A preparação de suporte ao óxido de grafeno é relativamente fácil de conseguir usando gotículas de solução em filme de poliolefina flexível. No entanto, quando realizado dessa forma, é mais fácil contaminar acidentalmente o lado de cobre da rede por erros de manuseio indevido; o uso do bloco de flutuação reduz a probabilidade dessa eventualidade.
Finalmente, este artigo apresenta um protocolo para preparar redes cobertas de grafeno que evite qualquer tipo de pré-tratamento de grafeno para torná-lo hidrofílico, reduzindo assim seu custo e aumentando sua acessibilidade. Manter um filme molhado durante toda a preparação do espécime e aplicar a amostra in situ no bloco pouco antes do congelamento é suficiente para permitir a geração de camadas de gelo adequadas para crio-EM com uma distribuição de amostra homogênea. No geral, os protocolos aqui apresentados minimizam o contato amostral com a interface ar-água, reduzindo assim a desnaturação amostral e a contaminação por suporte. Para os três filmes de suporte utilizados nessas abordagens, distribuições de amostras homogêneas poderiam ser alcançadas em todas as redes, juntamente com imagens de partículas únicas intactas e bem preservadas.

Na última década, avanços, principalmente na tecnologia de detectores, mas também em outras áreas técnicas, facilitaram uma sucessão de aumentos substanciais na resolução em que sistemas biologicamente relevantes podem ser imagens por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)1,2. Apesar de o crio-EM já permitir a resolução de estruturas de alta resolução de apenas 50 μg de proteína através da análise de partículas únicas (SPA), a amostra crio-EM e a preparação da grade continuam sendo grandes gargalos3,4,5. As amostras de SPA consistem em macromoléculas distribuídas aproximadamente aleatoriamente dentro de uma camada de gelo vítreo. O gelo deve ser o mais fino possível para maximizar a diferença de contraste entre as partículas e o solvente. Macromoléculas biológicas são mais estáveis (ou seja, menos propensas a perder sua estrutura nativa) em gelo mais espesso, porque permanecem melhor solvated. Além disso, as partículas são frequentemente encontradas como muito melhor distribuídas sobre o campo de visão no gelo muito mais espessa do que o tamanho de partículas6 e frequentemente podem não ser encontradas dentro de buracos nos filmes de carbono em tudo.
Além disso, camadas mais espessas de gelo diminuem a probabilidade de moléculas estarem próximas da interface ar-água devido à alta relação superfície-volume, e estima-se que o uso de métodos padrão de congelamento de mergulho para estudos crio-EM resulta na adsorção de ~90% das partículas para a interface ar-água7. O gelo mais espesso resulta em fundo indesejávelmente alto devido ao aumento dos eventos de dispersão dentro do solvente e atenuação concomitante do sinal6,7. É, portanto, necessário alcançar uma camada de gelo vítreo possível; idealmente, a camada seria apenas um pouco mais espessa que a partícula. O desafio para o pesquisador, que deve ser superado para cada amostra diferente aplicada a uma grade, é preparar espécimes finos o suficiente para imagens de alto contraste, mantendo a integridade estrutural das partículas dentro de sua amostra. A adsorção de proteínas à interface ar-água é acompanhada por vários efeitos, geralmente deletérios.
Em primeiro lugar, a ligação de proteínas a esta interface hidrofóbica muitas vezes induz a desnaturação da proteína, que prossegue rapidamente e é tipicamente irreversível8,9. Um estudo realizado com a synthase de ácido graxo de levedura mostrou que até 90% das partículas adsorvidas são desnaturadas10. Em segundo lugar, evidências de um estudo comparando a distribuição de orientação de conjuntos de dados ribossomos 80S coletados tanto em carbono amorfo11 ou sem suporte12 mostraram que a interface ar-água pode causar orientação preferencial severa comprometendo a reconstrução 3D do volume13. Os métodos para reduzir a interação partícula com a interface ar-água incluem a suplementação do tampão de congelamento com surfactantes (como detergentes), o uso de filmes de suporte, captura de afinidade ou andaimes de substratos e tempos acelerados de mergulho. O uso de surfactantes está associado a seus próprios problemas, pois algumas amostras de proteínas podem se comportar não idealmente em sua presença, enquanto substratos de captura de afinidade e andaimes geralmente requerem superfícies de grade sob medida de engenharia e estratégias de captura. Finalmente, embora existam muitas pesquisas sobre o desenvolvimento de dispositivos de mergulho rápido14,15,16, estes requerem aparelhos que geralmente não estão amplamente disponíveis.
Embora a grade tem padrão para crio-EM biológico já apresenta uma folha de carbono amorfo perfurada17, há uma série de protocolos disponíveis para a geração de filmes de suporte adicionais e sua transferência para grades TEM. O uso desses filmes é um método há muito estabelecido para estabilização amostral18. Suportes amorfos de carbono são gerados por evaporação e deposição em folhas de mica cristalina19, das quais as camadas podem ser flutuadas em grades, com a utilidade de suportes de flutuação como ferramentas úteis estabelecidas em relatórios anteriores20. Os flocos de óxido de grafeno, tipicamente preparados usando uma versão modificada do método Hummers21, têm sido usados como uma estrutura de suporte preferível ao carbono amorfo para sua diminuição do sinal de fundo, bem como a capacidade de imobilizar e estabilizar macromoléculas22. Mais recentemente, houve um ressurgente interesse no uso do grafeno como filme de suporte TEM devido à sua estabilidade mecânica, alta condutividade, contribuição extremamente baixa para o ruído de fundo23, bem como o surgimento de métodos reprodutíveis para gerar áreas macroscopicamente grandes de grafeno monocamada24 e transferi-lo para grades TEM25 . Quando comparado ao carbono amorfo, que sofre movimentos induzidos por feixes semelhantes, ou pior, do que o gelo sem um filme de suporte11,12,17, o grafeno mostrou uma redução significativa no movimento induzido pelo feixe de imagens crio-EM12.
No entanto, enquanto o grafeno hidrofilizado protegia a synthase de ácidos graxos da desnaturação interfacial da água do ar, os autores deste estudo observaram que o grafeno foi contaminado durante a preparação da amostra, provavelmente devido a uma combinação de contaminação de hidrocarbonetos atmosféricos e do reagente usado para hidrofilizar as redes10. De fato, apesar de muitas das qualidades superiores do grafeno, seu uso generalizado ainda é dificultado pela derivatização necessária para diminuir sua hidroofobidade12, que em última análise é quimicamente difícil e requer equipamentos especializados. Este artigo relata protocolos para a preparação de suportes de amostras de carbono amorfo, grafeno e grafeno usando um bloco de flutuação de amostra impressa tridimensional (3D)27 para transferir diretamente filmes de suporte dos substratos nos quais foram gerados para grades TEM (Figura 1). Uma das principais vantagens do uso desse dispositivo é a transferência molhada de filmes, minimizando a contaminação hidrofóbica dos suportes e, consequentemente, a necessidade de tratamento adicional e reduzindo o número de etapas de manuseio manual potencialmente prejudiciais. Essas abordagens são baratas de implementar e, portanto, amplamente acessíveis e aplicáveis para estudos crio-EM onde os suportes amostrais são necessários.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner (230 V)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers N5A INOX.</td>
			<td>Dumont Swissmade</td>
			<td>0302-N5A-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers NGG INOX.</td>
			<td>Dumont Swissmade</td>
			<td>0102-NGG-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ehtylacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270989-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fishing Loops 10 &#956;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-9353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene Oxide 2 mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>763705-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31232-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Sheets 75 mm x 25 mm x 0.15 mm</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG250-1</td>
			<td>We usually coat mica with a target carbon film thickness of 2 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolayer Graphene on Cu</td>
			<td>Graphenea</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 mm x 10 mm, pack of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl &#946;-D-maltoside (DDM)</td>
			<td>GLYCON Biochemicals GmbH</td>
			<td>D97002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>JBS-X-101-Cu300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>JBS-X-102-Cu300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q350AR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>TAAB Laboratories Equipment</td>
			<td>U001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>FEI</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper 55 mm</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1441-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper 70 mm</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>1441-070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block

A determinação da estrutura pela microscopia crio-elétron (crio-EM) cresceu rapidamente na última década; no entanto, a preparação da amostra continua sendo um gargalo significativo. As amostras macromoleculares são idealmente imagens diretamente de orientações aleatórias em uma fina camada de gelo vítreo. No entanto, muitas amostras são refrattárias a isso, e a desnaturação de proteínas na interface ar-água é um problema comum. Para superar tais questões, apoiar filmes- incluindo carbono amorfo, grafeno e óxido de grafeno - pode ser aplicado à rede para fornecer uma superfície que as amostras podem povoar, reduzindo a probabilidade de partículas experimentando os efeitos deletérios da interface ar-água. A aplicação desses suportes delicados às grades, no entanto, requer um manuseio cuidadoso para evitar quebras, contaminação aérea ou extensas etapas de lavagem e limpeza. Um relatório recente descreve o desenvolvimento de um bloco de flutuação fácil de usar que facilita a transferência molhada de filmes de suporte diretamente para a amostra. O uso do bloco minimiza o número de etapas de manuseio manual necessárias, preservando a integridade física do filme de suporte e o tempo ao longo do qual a contaminação hidrofóbica pode se acumular, garantindo que uma fina película de gelo ainda possa ser gerada. Este artigo fornece protocolos passo a passo para a preparação de suportes de carbono, grafeno e óxido de grafeno para estudos em EM.

As grades TEM preparadas com suportes de carbono amorfo são tipicamente cobertas por toda a superfície da rede. Embora a quebra do filme de carbono ocorra em alguns casos, juntamente com alguns babados (Figura 2A), um grande número de quadrados de grade são imaculados e, portanto, amplamente aplicáveis para fins de coloração negativa. O principal fator que afeta a integridade do suporte é a espessura do carbono, que é determinada durante a evaporação do carbono. Da mesma forma, com este protocolo GrOx, uma boa cobertura é rotineiramente alcançada em toda a grade (Figura 2B). Uma única aplicação de suspensão GrOx por 1 min é suficiente para garantir poucas áreas com múltiplas camadas, que são fáceis de ver devido às bordas do floco. As grades grOx podem ser preparadas rapidamente a partir de matérias-primas e são altamente protetoras da amostra. No entanto, bordas de flocos, cobertura incompleta e babados são mais frequentemente visíveis com grades GrOx do que para as outras técnicas devido à natureza dos flocos grOx.
Embora a integridade do filme de suporte ao grafeno, como o carbono amorfo, dependa do processo de deposição, áreas que são bem cobertas exibem o padrão característico de difração do grafeno de camada única. É importante ressaltar que, mantendo as películas de suporte ao grafeno molhadas, as amostras podem ser recuperadas do bloco de flutuação após um período de incubação e dados coletados de forma favorável à análise de partículas únicas. Este método não requer qualquer outro tratamento do grafeno para molhar, removendo assim a exigência de equipamentos caros para tornar o hidrofílico de grafeno, e é melhor preparar filmes de suporte pouco antes da preparação da amostra e congelamento da grade (Figura 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig01.jpg"> Figura 1: Design do bloco de flutuação da amostra e aplicação durante a preparação do filme de suporte. (A) Esquemático de vista superior, bem, e visão lateral do bloco de flutuação, incluindo medidas da forma, profundidade e inclinação. O sulco para as pontas da pinça descansar, bem como os canais para inserir agulhas, são indicados. (B) Camadas de carbono amorfa podem ser facilmente flutuadas sobre a superfície do tampão contida dentro dos poços do bloco de flutuação usando a rampa, ou seja, durante a preparação de grades TEM manchadas negativamente. (C) A largura dos poços é adequada para acomodar uma grade TEM, enquanto as ranhuras da pinça reduzem a necessidade de liberar e pegar grades desnecessariamente durante as etapas de preparação, mas oferecem um caminho definido para recuperar grades sem risco de dobra se as grades forem liberadas. As imagens em B são modificadas a partir de 27. Abreviação: TEM = microscopia eletrônica de transmissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig02.jpg"> Figura 2: Exemplos típicos de filmes de suporte amostral preparados usando o bloco de flutuação. As visualizações quadradas (esquerda) e de imagem (direita) são mostradas para (A) carbono amorfo, (B) óxido de grafeno e (C) filmes de suporte ao grafeno preparados usando o bloco de flutuação. O suporte de carbono amorfo foi utilizado na preparação de ribossomos 70S para coloração negativa, enquanto os suportes de óxido de grafeno e grafeno foram usados na preparação de ribossomos 70S para crio-EM. As imagens em A e C são modificadas a partir de 27. Barra de escala para um quadrado de grade = 10 μm; barras de escala para quadrados de grade B e C = 5 μm; barras de escala para visualizações de imagem A-C = 50 nm. Abreviação: crio-EM = microscopia crio-elétron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

A preparação da amostra para microscopia crio-elétron (crio-EM) é um gargalo significativo no fluxo de trabalho de determinação da estrutura deste método. Aqui, fornecemos métodos detalhados para o uso de um bloco impresso tridimensional e fácil de usar para a preparação de filmes de suporte para estabilizar amostras para estudos em transmissão.

Preparação de filmes de suporte à amostra em microscopia eletrônica de transmissão usando um bloco de flutuação de suporte

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Aqui apresentamos protocolos aprimorados para preparar amostras crio-EM com filmes de suporte usando um novo bloco de flutuação que facilita o manuseio de filmes tão delicados. A principal vantagem deste método é que a amostra é protegida da interface da água do ar onde podem ocorrer efeitos nocivos como a desnaturação. Um dos protocolos aqui apresentados evita qualquer tipo de tratamento caro para tornar o gráfico hidrofílico, aumentando assim sua acessibilidade a toda a comunidade EM.Pequenos dispositivos de flutuação ainda não são amplamente utilizados pela microscopia eletro para uma boa preparação. Assim, essas demonstrações visuais podem fornecer uma referência para seu uso. Para começar, lave as grades TEM com água destilada dupla e acetato de enguia seguido de limpeza de plasma.Em seguida, adicione 10 a 12 microliters da amostra no poço de troca de buffer, o bloco de flutuação e 10 a 12 microliters de solução de acetato 2% urinário na troca não tampão adjacente bem para coloração negativa. É essencial tomar as precauções de segurança adequadas ao trabalhar com a mancha. Corte cuidadosamente dois pequenos pedaços de mica com filme de carbono pré-colocado no topo.Certifique-se de que os fragmentos de mica são largos o suficiente para caber no poço e mais longo do que o comprimento do poço, de tal forma que o fragmento pode sentar-se sobre o poço enquanto o carbono está flutuando e há espaço suficiente para lidar com o fragmento com a pinça. Mergulhe o mica no poço com um ângulo aproximado de 45 graus até que o mica se sente na rampa do poço e a camada de carbono seja observada na superfície da amostra líquida. Depois de incubar o carbono com a amostra, retire a folha de mica muito lentamente para recuperar o filme de carbono e minimizar a retenção residual da amostra de vísco.Limpe cuidadosamente o mica tocando a superfície inferior não-carbono com um papel filtro para remover o excesso de líquido e imergir o fragmento de mica no poço oposto contendo solução de acetato 2% urinária para trocar a camada de carbono com a mancha negativa. Recupere a camada de carbono flutuante com o lado sagrado coberto de carbono da rede EM lavada e limpa de plasma. Em seguida, deixe as grades secarem até que a imagem esteja no TEM, de preferência cobrindo-as para evitar contaminação no ar.Depois de limpar as grades TEM como demonstrado anteriormente, prepare a suspensão do óxido de grafeno pouco antes do uso e o vórtice completamente. Em seguida, adicione 10 a 12 microliters de suspensão de óxido de grafeno nos quatro poços de troca de buffer. ao longo do bloco de flutuação.Adicione 10 a 12 microliters de água dupla destilada ou água ultra pura nos quatro poços de troca de buffer restantes do bloco. Solte quatro grades suavemente sobre a suspensão de óxido de grafeno de cada poço e incubar por um minuto para garantir que o lado sagrado coberto de carbono esteja em contato com a solução. Após um minuto, recupere cada grade cuidadosamente deslizando as pinças para o sulco da pinça de cada poço de troca de não tampão.Empurre suavemente e brevemente o lado coberto de cobre não-carbono de cada rede com a água dupla destilada no poço adjacente até que a gota de água seja visível na rede. Em seguida, segure cuidadosamente a gota d'água da rede de cabeça para baixo contra um pedaço de papel filtro. Cubra as grades e deixe-as na pinça para secar o ar.Coloque quatro grades de lavagem em cima de uma folha de grafia de cobre depositada em um slide de vidro, e cubra cada grade com uma gota de isopropanol para permitir contato íntimo entre o grafeno monocamado e a grade. Após a evaporação completa do isopropanol, flutue a folha de grafeno de cobre com grades sobre a solução de cloreto férrico na placa de petri de vidro. Em seguida, cubra o prato para evitar contaminação no ar e deixe-o gravado à temperatura ambiente durante a noite.Use um laço com o diâmetro maior que o tamanho da grade TEM para pescar as grades flutuando na monocamada de grafeno e transfira-as cuidadosamente para uma placa de vidro petri contendo água dupla destilada para lavagem. Lave as grades duas vezes na água e transfira as grades para uma placa de Petri contendo tampão de amostra até a preparação da amostra e o congelamento do mergulho. Adicione 10 a 12 microliters da amostra em um poço do bloco de flutuação.Quando a amostra estiver pronta no bloco, escolha a grade revestida de grafeno da solução tampão usando um par de pinças limpas e coloque-a sobre a superfície da amostra que contém bem. Após um período de incubação apropriado, pegue a grade com um par de pinças limpas de congelamento e proceda com manchas e vitrificação. Grades manchadas negativamente preparadas com o bloco de flutuação de suporte são tipicamente cobertas com carbono amorfo em toda a superfície da rede.Embora a quebra da película de carbono ocorra em alguns casos, um grande número de quadrados de grade são imaculados e, portanto, aplicáveis para fins de coloração negativa. Da mesma forma, uma boa cobertura cinematográfica é rotineiramente alcançada em toda a grade usando o protocolo de óxido de grafeno. As redes de óxido de grafeno podem ser preparadas rapidamente a partir de matérias-primas e são altamente protetoras da amostra.Manter o grafeno molhado e a aplicação da amostra in situ pouco antes de congelar é suficiente para gerar camadas de gelo adequadas para crio-EM. Este protocolo não requer equipamentos para tornar o hidrofílico de grafeno e fornece uma vantagem para a recuperação da amostra. O bloco de flutuação de suporte tem duas portas de agulha no local de cada poço que permitem estender o buffer em C2, o que é muito útil para amostras derivadas de gradientes de glicerol.O bloco de flutuação permitiu a exploração de métodos de purificação de afinidade na grade utilizando o fluxo de buffer controlável de pequenos volumes, bem como filmes de suporte funcionalizados.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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