Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN由FAPESP（资助编号：#2017/50137-3，2012/19278-6，2018/14933-2，2018/21934-5和2013/08216-2）和CNPq（313662/2017-7）资助。
我们特别感谢为研究员提供的以下赠款：ANAG（FAPESP Process 2019/13880-5），VEM（FAPESP Process 2019/16418-0），IMSC（FAPESP Process 2020/05284-0），APV（FAPESP Process 2019/27146-1）和RLTO（CNPq Process 134204/2019-0）。

该协议中使用的样品由圣保罗大学生物医学科学研究所微生物学系和塞尔希培联邦大学伦理委员会批准（协议分别为54937216.5.0000.5467和54835916.2.0000.5546）。
1. Docker 桌面安装
注意：准备 Docker 环境的步骤因操作系统 （OS） 而异。因此，Mac 用户必须遵循列为 1.1 的步骤，Linux 用户必须遵循列为 1.2 的步骤，Windows 用户必须遵循列为 1.3 的步骤。
<o...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

测序文库的制备是以最佳方式回答生物学问题的关键一步。该研究感兴趣的转录本类型将指导选择哪种类型的测序文库并推动生物信息学分析。例如，根据测序的类型，从病原体和宿主相互作用的测序中，可以识别来自两者的序列或仅来自宿主转录本的序列。
下一代测序设备，例如Illumina平台，测量测序质量评分，这代表了碱基被错误调用的概率。下游分析对低质量序列非常...

登革热、黄热病、基孔肯雅热和寨卡等虫媒病毒与几次地方性疫情广泛相关，并已成为过去几十年中导致人类感染的主要病原体之一1，2。感染基孔肯雅病毒（CHIKV）的个体经常出现发热、头痛、皮疹、多关节痛和关节炎3，4，5。病毒可以破坏细胞的基因表达并影响各种宿主信号通路。最近，血液转录组研究利用RNA-seq鉴定与急性CHIKV感染相关的差异表达基因（DEGs）与康复6 或健康对照组7进行比较。CHIKV感染的儿童具有上调的基因，这些基因参与先天免疫，例如与病毒RNA，JAK / STAT信号传导和Toll样受体信号通路的细胞传感器相关的基因6。急性感染CHIKV的成人还显示出与先天免疫相关的基因的诱导，例如与单核细胞和树突状细胞活化相关的基因，以及与抗病毒反应相关的基因7。富含下调基因的信号通路包括与适应性免疫相关的信号通路，例如T细胞活化以及T细胞和B细胞的分化和富集7。
可以使用几种方法来分析宿主和病原体基因的转录组数据。通常，RNA-seq文库的制备从成熟poly-A转录本的富集开始。该步骤去除大部分核糖体RNA（rRNA），在某些情况下去除病毒/细菌RNA。然而，当生物学问题涉及病原体转录本检测并且RNA独立于先前的选择进行测序时，可以通过测序检测许多其他不同的转录本。例如，亚基因组mRNA已被证明是验证疾病严重程度的重要因素8。此外，对于某些病毒，如CHIKV和SARS-CoV-2，即使是富含poly-A的文库也会生成病毒读数，可用于下游分析9，10。当专注于宿主转录组的分析时，研究人员可以研究样品之间的生物扰动，鉴定差异表达的基因和富集的途径，并生成共表达模块7，11，12。该协议突出了使用不同生物信息学方法对CHIKV感染患者和健康个体的转录组分析（图1A）。来自先前发表的一项研究7 的数据包括20名健康和39名CHIKV急性感染个体，用于产生具有代表性的结果。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

病原体可引起多种传染病。宿主对感染的反应诱导的生物过程决定了疾病的严重程度。为了研究这些过程，研究人员可以使用高通量测序技术（RNA-seq），以测量宿主转录组在感染的不同阶段，临床结果或疾病严重程度的动态变化。这项调查可以更好地了解疾病，并发现潜在的药物靶点和治疗方法。这里介绍的方案描述了一个完整的管道，用于分析从原始读取到功能分析的RNA测序数据。管道分为五个步骤：（1）数据的质量控制;（2）基因的作图和注释;（3）统计分析，鉴定差异表达基因和共表达基因;（4）测定样品扰动的分子程度;（5）功能分析。步骤 1 删除了可能影响下游分析质量的技术工件。在第2步中，根据标准文库协议绘制基因图谱并进行注释。步骤3中的统计分析可识别感染样本中差异表达或共表达的基因，与未感染的基因进行比较。在步骤4中使用分子扰动度方法验证样品变异性和潜在生物异常值的存在。最后，步骤5中的功能分析揭示了与疾病表型相关的途径。所提出的管道旨在通过来自宿主 - 病原体相互作用研究的RNA-seq数据分析来支持研究人员，并推动未来的体外 或 体内 实验，这对于了解感染的分子机制至关重要。

转录组分析的计算环境是在 Docker 平台上创建和配置的。这种方法允许初学者Linux用户在没有先验管理知识的情况下使用Linux终端系统。Docker 平台使用主机操作系统的资源来创建包含特定用户工具的服务容器（图 1B）。创建了一个基于Linux OS Ubuntu 20.04发行版的容器，并完全配置为转录组分析， 可通过 命令行终端访问。在此容器中，有一个用于数据集和脚本的预定义文?...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

这里介绍的方案描述了一个完整的管道，用于分析从原始读数到功能分析的RNA测序转录组数据，包括质量控制和预处理步骤到高级统计分析方法。

用于研究宿主-病原体相互作用的高通量转录组分析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

欢迎使用用于研究宿主-病原体相互作用的高通量转录组分析方案。此协议分为以下步骤。质量控制以过滤低质量的读数，并删除适配器序列测序和注释，您必须将读数映射到参考基因组中并将读数注释到基因中。统计和共表达分析，定义差异表达基因并找到共表达模块。分子扰动度分析，以查找潜在的异常值样本。最后，进行功能分析，以确定差异表达基因的生物学功能。利用这些管道的所有工具都预安装在 Linux 系统中，并封装到 Docker 容器中。利用这些方案的样本来自我们小组在PLOS Pathogen上发表的一篇论文。样本包括20名健康人和39名感染基孔肯雅病毒的患者。收集血液样本，并进行RNA测序。要在Windows系统中安装Docker，您必须执行以下步骤。转到 Docker 的官方网页，然后单击"开始使用"。查找 Docker Desktop for Windows 的安装程序。下载文件。在计算机上本地安装。确保标记了这两个选项。安装程序后， 下载此协议的 Docker 映像。转到 Windows 终端。执行命令以下载映像。下载映像后，可以在 Docker 桌面中看到该文件，并且从此映像中，我们可以启动容器。单击倒圆角按钮后，必须展开原始参数和选项以定义容器的名称，并将本地计算机中的文件夹与 Docker 中的文件夹相关联。在此之后，单击"运行"以启动容器。然后，您可以访问终端，该终端位于 Docker 内部的 Linux 系统中。键入 bash 命令，然后可以执行此协议的所有命令。首先，我们必须执行源代码以使此协议的所有工具都可用。您应该访问目录脚本。要进行转录组学分析，您必须首先下载参考基因组。为此，您必须执行以下命令。下载基因组后，您必须下载基因的注释。为此，您必须键入以下命令。接下来，您必须配置 fastq-dump。这允许您下载示例的排序文件。键入以下命令后，必须使用"选项卡"按钮转到"工具"选项并标记选项"当前目录"。使用 Tab 按钮进行保存，然后确定。然后退出工具 fastq-dump。现在，我们可以通过键入以下命令来启动读取的下载。质量控制包括并以图形方式评估测序读数中出错的概率。在此步骤中，您还必须删除适配器等技术序列。要生成质量控制图，您必须运行 FastQC 程序。若要删除适配器序列和低质量序列，必须键入以下命令。有了高质量的读数，我们现在必须将读数映射到参考基因组中。在绘制图谱之后，我们将不得不根据人类基因注释基因，然后计算与每个人类基因匹配的读取次数。第一步是通过键入以下命令来索引参考基因组。然后我们输入这个命令，将读数映射到人类基因组中。接下来，您应该运行注释读取的脚本。在绘制和注释之后，您可以执行差异表达分析，其中包括找到与另一组相比，一组中表达更高或更低的基因。要识别差异表达的基因或DEGs，您必须运行以下命令。在此之后，您可以将数据结果从 Docker 传输到本地计算机。为此，请转到终端并键入以下命令以将所有结果保存到本地文件夹。若要执行其余分析，还必须将目录数据的所有文件复制到本地计算机中的某个目录。在本地计算机中，您将能够看到从 Docker 保存数据的目录。如您所见，您可以访问所有库。您还可以打开包含质量控制报告的 HTML 文件。您还可以访问包含差异表达基因的目录。在这个目录中，你会发现火山图，在那里你可以看到一组与另一组的上调或下调的基因，在这种情况下，感染基孔肯雅病毒的患者与健康对照组。此协议的所有剩余步骤都将使用您的浏览器在 Web 工具中执行。让我们首先从CEMiTool开始。转到浏览器并键入以下地址。CEMiTool从用户提供的表达数据集中识别共表达模块。在主页中，您可以转到菜单，然后单击"运行"按钮。这将打开一个新页面，您可以在其中上传表达式文件。此文件位于本地计算机的目录数据中。您将看到有三个表达式文件，我们将用于 CEMiTool 的文件是规范化调用 tmm。然后，您必须选择现象数据文件，与包含蛋白质 - 蛋白质相互作用的文件相同，最后上传包含基因集或途径的文件。基因集文件使CEMiTool能够对每个共表达模块进行富集分析。接下来，您应该展开参数部分，然后单击"应用 VST"。之后，您只需单击"运行CEMiTool"即可。运行 CEMiTool 后，您将看到已识别出 12 个共表达模块。通过单击此处，您可以下载这些分析的所有结果。我们将在该协议中使用的另一个工具是MDP，即分子扰动度。只需输入您的浏览器 mdp.sysbio.tools。MDP计算每个样品与参考样品组（在本例中为健康对照组）相比的分子距离，以便不仅找到潜在的异常值，还发现每个样品与该组相比的扰动程度。在"运行"页面中，只需单击按钮并选择文件即可上传表达式文件。然后，您必须上传现象数据文件。然后，您必须定义哪个列包含有关组或类的信息，然后定义哪个类或组对应于对照组。在此之后，您可以运行MDP。条形图以条形显示每个样本的分子扰动程度的分数，颜色代表不同的组。箱形图是可视化相同结果的另一种方法，您可以在每个点上看到由两组分隔的不同样本。为了执行泛函分析，我们将使用 Enrichr 工具。为此，您必须选择差异表达的基因列表，无论是上调还是下调，并将其用作富集器工具中的输入基因列表。您将看到有不同的选项卡。所有结果也可以下载到本地计算机。用于转录组分析的计算机环境已放置在 Docker 平台上。这种方法允许没有Linux系统经验的用户使用终端。在此容器中，存在用于数据集和脚本的预定义文件夹结构，这些结构是所有分析所必需的。在管道中，用户将利用来自20名健康个体和39名急性感染基孔肯雅病毒的患者的血液转录组数据。测序平台返回一组包含DNA序列的FASTQ文件，即读数，以及每个核苷酸碱基的相关质量。Phred 质量等级指示每个碱基读数不正确的概率。工具可识别并删除样本中的低质量读数，并增加映射读取的概率。在此步骤中，映射模块中，将回收的高质量读数用作输入，以使其与人类参考基因组对齐。CEMiTool识别和分析共表达模块。同一模块中的基因是共表达的，这意味着它们在数据集的样本中表现出相似的表达模式。网络分析提供了有关连接最紧密的基因（即中心）的信息。这些基因的名称显示在网络中。节点的大小与其连接程度成正比。从DEG分析中获得的结果总结在火山图中。对分子扰动程度的分析允许从健康和受感染的个体中鉴定出扰动样本。MDP建议哪些样本是潜在的生物学异常值。删除这些样本将影响下游结果。使用AURA的功能扩充分析可以使用扩充器工具执行。这些步骤有助于通过揭示差异表达的几个基因的共同功能作用来解释结果。条形图中显示的生物过程是根据其p值排名排名的前10个富集基因集。总之，这些方案涵盖了RNA-Seq分析的所有步骤。该管道被开发并封装到名为Docker的非商业系统中。在图像上，并提供给科学界。由于容器系统，所有脚本和工具都处于相同的特定版本下，以保证可重现性。此外，部分生物信息学分析是通过免费的用户友好型网络工具进行的。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

免疫与感染

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使用的EpiAirway模型，用于描述长期宿主 - 病原体相互作用

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

流感病毒的高通量检测方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

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比较方法来表征景观的宿主 - 病原体蛋白 - 蛋白相互作用

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

高通量基因定位在<em&gt;布氏锥虫</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

一种用于丝状真菌菌落细菌生物膜的定性多尺度分析的新方法利用共聚焦和电子显微镜

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

宿主病原学反应及疫苗效果评价

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...