Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN er finansieret af FAPESP (tilskudsnumre: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 og 2013/08216-2) og CNPq (313662/2017-7).
Vi er særligt taknemmelige for følgende tilskud til stipendiater: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) og RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

Prøverne i denne protokol blev godkendt af de etiske komitéer fra både Institut for Mikrobiologi ved Institut for Biomedicinsk Videnskab ved universitetet i São Paulo og Federal University of Sergipe (Protokoller: 54937216.5.0000.5467 og 54835916.2.0000.5546).
1. Docker-installation på computeren
BEMÆRK: Trin til forberedelse af Docker-miljøet er forskellige blandt operativsystemer (OS'er). Derfor skal Mac-brugere følge trin, der er angivet so...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Forberedelsen af sekventeringsbibliotekerne er et afgørende skridt i retning af at besvare biologiske spørgsmål på den bedst mulige måde. Typen af udskrifter af interesse for undersøgelsen vil guide, hvilken type sekventering bibliotek vil blive valgt og drive bioinformatiske analyser. For eksempel fra sekventering af et patogen og værtsinteraktion, afhængigt af typen af sekventering, er det muligt at identificere sekvenser fra begge eller bare fra værtsudskrifterne.
Næste generation...

Arbovirus, såsom denguefeber, gul feber, chikungunya og zika, har været meget forbundet med flere endemiske udbrud og har vist sig som et af de vigtigste patogener, der er ansvarlige for at inficere mennesker i de sidste årtier1,2. Personer inficeret med chikungunya virus (CHIKV) har ofte feber, hovedpine, udslæt, polyarthralgi, og arthritis3,4,5. Vira kan undergrave cellens genekspression og påvirke forskellige værtssignaleringsveje. For nylig, blod transcriptome undersøgelser udnyttet RNA-seq at identificere de differentieret udtrykte gener (DEGs) forbundet med akut CHIKV infektion i forhold til rekonvalescens6 eller sunde kontroller7. CHIKV-inficerede børn havde up-regulerede gener, der er involveret i medfødt immunitet, såsom dem, der er relateret til cellulære sensorer til viral RNA, JAK / STAT signalering, og toll-lignende receptor signalering veje6. Voksne akut inficeret med CHIKV viste også induktion af gener relateret til medfødt immunitet, såsom dem, der er relateret til monocytter og dendritisk celleaktivering, og til antivirale reaktioner7. Signalvejene beriget med nedregulerede gener omfattede dem, der var relateret til adaptiv immunitet, såsom T-celleaktivering og differentiering og berigelse i T- og B-celler7.
Flere metoder kan bruges til at analysere transcriptome data af vært og patogen gener. Ofte starter RNA-seq biblioteksforberedelse med berigelse af modne poly-A udskrifter. Dette trin fjerner de fleste af de ribosomale RNA (rRNA) og i nogle af tilfældene virale / bakterielle RNA'er. Men når det biologiske spørgsmål involverer patogenudskriftsdetektering, og RNA er sekventeret uafhængigt af den tidligere udvælgelse, kan mange andre forskellige udskrifter påvises ved sekventering. For eksempel har subgenomic mRNAs vist sig at være en vigtig faktor for at kontrollere sværhedsgraden af sygdommene8. Hertil kommer, for visse vira såsom CHIKV og SARS-CoV-2, selv poly-A beriget biblioteker generere virale læser, der kan udnyttes i downstream analyser9,10. Når forskerne fokuserer på analysen af værtstransskriptionen, kan de undersøge den biologiske forstyrrelse på tværs af prøver, identificere differentierede gener og berigede veje og generere co-expression moduler7,11,12. Denne protokol fremhæver transcriptomanalyser af CHIKV-inficerede patienter og raske personer, der anvender forskellige bioinformatiske tilgange (figur 1A). Data fra en tidligere offentliggjort undersøgelse7 bestående af 20 raske og 39 CHIKV akut inficerede personer blev brugt til at generere de repræsentative resultater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Patogener kan forårsage en bred vifte af smitsomme sygdomme. De biologiske processer induceret af værten som reaktion på infektion bestemme sværhedsgraden af sygdommen. For at studere sådanne processer, forskere kan bruge high-throughput sekventering teknikker (RNA-seq), der måler de dynamiske ændringer af værten transcriptome på forskellige stadier af infektion, kliniske resultater, eller sygdom sværhedsgrad. Denne undersøgelse kan føre til en bedre forståelse af sygdommene, samt afdække potentielle lægemiddelmål og behandlinger. Protokollen, der præsenteres her, beskriver en komplet pipeline til at analysere RNA-sekventeringsdata fra rå læser til funktionel analyse. Rørledningen er opdelt i fem trin: 1) kvalitetskontrol af dataene; 2) kortlægning og anmærkning af gener 3) statistisk analyse med det formål at identificere forskelligt udtrykte gener og samtil udtrykte gener 4) bestemmelse af den molekylære grad af forstyrrelse af prøver og (5) funktionel analyse. Trin 1 fjerner tekniske artefakter, der kan påvirke kvaliteten af downstream-analyser. I trin 2 kortlægges og kommenteres gener i henhold til standardbiblioteksprotokoller. Den statistiske analyse i trin 3 identificerer gener, der er differentieret udtrykt eller co-udtrykt i inficerede prøver, i forhold til ikke-inficerede. Prøvevariation og tilstedeværelsen af potentielle biologiske outliers verificeres ved hjælp af den molekylære grad af forstyrrelsesmetode i trin 4. Endelig afslører den funktionelle analyse i trin 5 de veje, der er forbundet med sygdommens fænotype. Den præsenterede pipeline har til formål at støtte forskere gennem RNA-seq dataanalyse fra værtspatogeninteraktionsundersøgelser og drive fremtidige in vitro - eller in vivo-eksperimenter , der er afgørende for at forstå den molekylære mekanisme af infektioner.

Computermiljøet for transcriptome-analyser blev oprettet og konfigureret på Docker-platformen. Denne tilgang giver nybegynder Linux-brugere mulighed for at bruge Linux terminalsystemer uden en priori management viden. Docker-platformen bruger værtsoperativsystemets ressourcer til at oprette en servicebeholder, der indeholder specifikke brugerværktøjer (Figur 1B). En container baseret på Linux OS Ubuntu 20.04 distribution blev oprettet, og det var fuldt konfigureret til transskriptomisk...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Den protokol, der præsenteres her, beskriver en komplet pipeline til at analysere RNA-sekventering af transskriptionomdata fra rå læser til funktionel analyse, herunder kvalitetskontrol og forbehandlingstrin til avancerede statistiske analytiske tilgange.

High-Throughput Transcriptome Analyse til undersøgelse af Host-Patogen Interaktioner

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Velkommen til protokollen med high-throughput transcriptome analyse til undersøgelse af værtspatogeninteraktioner. Denne protokol er opdelt i følgende trin. Kvalitetskontrol til at filtrere aflæsninger af lav kvalitet og også for at fjerne adaptersekvenser Sekventering og anmærkninger, hvor skal du kortlægge læserne til et referencegenomer og kommentere læserne i generne.Statistisk og co-expression analyse, som definerer de differentierede udtrykte gener og finder også co-expression moduler. Molekylær grad af forstyrrelse analyse for at finde potentielle outlier prøver. Og endelig den funktionelle analyse til at bestemme de biologiske funktioner af differentierede udtrykte gener.Alle de værktøjer, der udnytter disse rørledninger, blev forudinstalleret i et Linux-system og indkapslet i en Docker-beholder. Prøverne udnytte disse protokoller stammer fra et papir offentliggjort af vores gruppe i PLOS Patogen. Prøverne omfatter 20 raske mennesker og 39 patienter smittet med Chikungunya virus.Blodprøverne blev indsamlet, og RNA sekventering blev udført. Hvis du vil installere Docker i Windows-systemet, skal du følge disse trin. Gå til dockerens officielle webside, og klik på Introduktion.Find installationsprogrammet til Docker Desktop til windows. Hent filen. Installer lokalt i din maskine.Sørg for, at disse to indstillinger er markeret. Når du har installeret programmet, hentes Docker-afbildningen til denne protokol. Gå til Windows-terminalen.Udfør kommandoerne for at hente afbildningen. Når du har downloadet billedet, kan du se filen på Docker-skrivebordet, og fra dette billede kan vi starte beholderen. Når du har klikket på den runde knap, skal du udvide de oprindelige parametre og indstillinger for at definere navnet på objektbeholderen og knytte en mappe på den lokale computer til mappen i Docker.Derefter klikker du på Kør for at starte objektbeholderen. Du kan derefter få adgang til terminalen, som er i Linux-systemet inde i Docker. Skriv bash-kommandoerne, og derefter kan du udføre alle kommandoerne i denne protokol.Først skal vi udføre kilden for at gøre alle værktøjerne i denne protokol tilgængelige. Du bør få adgang til mappescripts. For at udføre en transskriptom analyse skal du først downloade referencegenomet.Til dette skal du udføre følgende kommandoer. Når genomet er downloadet, skal du downloade anmærkningen af generne. Det kan du gøre ved at skrive følgende kommandoer.Dernæst skal du konfigurere fastq-dump. Dette giver dig mulighed for at downloade rækkefølgen filer af eksemplerne. Når du har skrevet følgende kommandoer, skal du bruge knappen Tabulator til at gå til indstillingen Funktioner og markere mappen med indstillinger for currents.Brug tabulatorknapperne til at gemme, og derefter ok. Og så forlade værktøjet fastq-dump. Nu kan vi starte downloads af læserne ved at skrive følgende kommandoer.Kvalitetskontrol består og evaluerer grafisk sandsynligheden for fejl i rækkefølgen læser. I dette trin skal du også fjerne de tekniske sekvenser, f.eks. Hvis du vil generere kvalitetskontrolgraferne, skal du køre FastQC-programmet.Hvis du vil fjerne adaptersekvenserne og sekvenserne af lav kvalitet, skal du skrive følgende kommandoer. Med den gode kvalitet læser, er vi nu nødt til at kortlægge læserne i reference genomet. Efter kortlægningen bliver vi nødt til at anmærke generne i henhold til de menneskelige gener og derefter tælle antallet af læser, der matcher hvert menneskeligt gen.Det første trin er at indeksere referencegenomet ved at skrive følgende kommando. Og så skriver vi disse kommandoer for at kortlægge aflæsningerne i det menneskelige genom. Derefter skal du køre de scripts, der kommenterer læserne.Efter kortlægning og anmærkning kan du udføre differentialudtryksanalysen, som den består i at finde de gener, hvis udtryk er højere eller lavere i en gruppe sammenlignet med en anden. For at identificere de forskelligt udtrykte gener, eller DEG'er, skal du køre følgende kommandoer. Derefter kan du overføre dataresultaterne fra Docker til den lokale computer.Til dette formål skal du gå til terminalen og skrive følgende kommandoer for at gemme alle resultaterne i en lokal mappe. Hvis du vil udføre den resterende analyse, skal du også kopiere alle filerne i mappedataene til en mappe på den lokale computer. På din lokale computer kan du se de mapper, hvor du gemte dataene fra Docker.Som du kan se, kan du få adgang til alle bibliotekerne. Du kan også åbne den HTML-fil, der indeholder kvalitetskontrolrapporterne. Du kan også få adgang til en mappe, der indeholder de forskelligt udtrykte gener.Og inde i denne mappe, vil du finde vulkanen plots, hvor du kan se de gener, der er op-eller nedreguleret i den ene gruppe versus en anden, i dette tilfælde, patienter inficeret med Chikungunya virus versus sunde kontroller. Alle de resterende trin i denne protokol vil blive udført i webværktøjer ved hjælp af din browser. Lad os starte med CEMiTool.Gå til browseren, og skriv følgende adresse. CEMiTool identificerer samudtryksmoduler fra udtryksdatasæt, der leveres af brugerne. På hovedsiden kan du gå til menuen og klikke på knappen Kør.Dette åbner en ny side, hvor du kan overføre udtryksfilen. Denne fil findes i mappedataene på den lokale computer. Du vil se, at der tre udtryk filer, og den ene, som vi skal bruge til CEMiTool er en normalisering opkald tmm.Så er du nødt til at vælge phenodata fil, det samme for den fil, der indeholder protein-protein interaktioner, og endelig uploade den fil, der indeholder genet sæt eller veje. Gensætfilen gør det muligt for CEMiTool at udføre berigelsesanalyse for hvert af co-expression-modulet. Derefter skal du udvide parameterafsnittet og klikke på Anvend VST.Derefter kan du bare klikke på Kør CEMiTool. Når du har kørt CEMiTool, vil du se, at der blev identificeret 12 co-expression moduler. Ved at klikke her kan du downloade alle resultaterne af denne analyse.Et andet værktøj, som vi vil bruge i denne protokol er MDP, eller Molekylær grad af forstyrrelse. Du skal blot skrive i browseren mdp.sysbio.tools. MDP beregner den molekylære afstand for hver prøve i forhold til en referencegruppe af prøver, i dette tilfælde, de sunde kontroller, for at finde ikke kun potentielle outliers, men også hvor forstyrret er hver prøver i forhold til denne gruppe.På siden Kør kan du bare overføre udtryksfilen ved at klikke på knappen og vælge filen. Så er du nødt til at uploade phenodata-filen. Derefter skal du definere, hvilken kolonne der indeholder oplysningerne om gruppen eller klassen, og derefter hvilken klasse eller gruppe der svarer til kontrolgruppen.Derefter kan du bare køre MDP. Søjlediagrammet viser for hver enkelt af prøverne som en bjælke scoren af molekylær grad af forstyrrelse, og farverne repræsenterer de forskellige grupper. Og boksen plot er en anden måde at visualisere de samme resultater, hvor du ser på hver prikker er en anden prøver adskilt af to grupper.For at udføre den funktionelle analyse skal vi bruge Enrichr-værktøjet. Til dette skal du vælge listen over gener, der blev udtrykt forskelligt, enten op- eller nedreguleret, og bruge det som en inputgenliste i Enrichr-værktøj. Du vil se, at der er forskellige faner.Alle resultater kan også downloades til din lokale computer. Computermiljøet til transcriptome-analyse er placeret på Docker-platformen. Denne tilgang giver brugere uden forudgående erfaring med Linux-system til at udnytte en terminal.I denne objektbeholder er der en foruddefineret mappestruktur til datasæt og scripts, som er nødvendige for al analysen. I støbeskeen, brugere vil udnytte blod transcriptome data fra 20 raske personer og 39 patienter akut inficeret med Chikungunya virus. Sekventeringsplatformen returnerer et sæt FASTQ-filer, der indeholder DNA-sekvensen, dvs.aflæsningerne og den tilhørende kvalitet for hver nukleotidbase. Phred-kvalitetsskalaen angiver sandsynligheden for en forkert aflæsning for hver base. Værktøjer identificerer og fjerner aflæsninger af lav kvalitet fra prøver og øger sandsynligheden for kortlægning af læser.I dette trin, kortlægning modul, den høje kvalitet aflæsninger genvundet bruges som input til at tilpasse dem mod den menneskelige reference genom. CEMiTool identificerer og analyserer samudtryksmoduler. Gener inden for samme modul udtrykkes i samarbejde, hvilket betyder, at de udviser lignende udtryksmønstre på tværs af prøverne af datasæt.Netværksanalysen giver oplysninger om de mest forbundne gener, dvs. knudepunkterne. Navnene på disse gener er vist i netværket.Størrelsen af noderne er proportional med dens grad af tilslutningsmuligheder. Resultaterne fra DEG-analysen blev sammenfattet i vulkanplottet. Analysen af den molekylære grad af forstyrrelser gør det muligt at identificere forstyrrede prøver fra raske og inficerede personer.MDP foreslår, hvilke prøver der er potentielle biologiske outliers. Fjernelse af disse prøver vil påvirke downstream-resultaterne. En funktionel berigelsesanalyse ved hjælp af AURA kan udføres med Enrichr-værktøj.Disse trin hjælper med at fortolke resultaterne ved at afsløre fælles funktionelle roller af flere gener, der blev udtrykt forskelligt. Den biologiske proces vist i søjle grafer er top 10 beriget gen sæt baseret på deres p-værdi ranking. Afslutningsvis dækker disse protokoller alle trin i RNA-Seq-analysen.Rørledningen blev udviklet og indkapslet i det ikke-kommercielle system ved navn Docker. På et billede og stilles til rådighed for det videnskabelige samfund. På grund af containersystemet er alle scripts og værktøjer under den samme specifikke version for at sikre reproducerbarhed.Desuden blev dele af bioinformatikanalysen udført via gratis brugervenlige webværktøjer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metode til Kvalitativ Multi-skala Analyse af Bakteriel biofilm på Filamentøs Kolonier Brug Konfokal og Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...