Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN wordt gefinancierd door FAPESP (subsidienummers: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 en 2013/08216-2) en CNPq (313662/2017-7).
We zijn met name dankbaar voor de volgende subsidies voor fellows: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) en RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

De monsters die in dit protocol werden gebruikt, werden goedgekeurd door de ethische commissies van zowel de afdeling Microbiologie van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen van de Universiteit van São Paulo als de Federale Universiteit van Sergipe (Protocollen: respectievelijk 54937216.5.0000.5467 en 54835916.2.0000.5546).
1. Docker desktop installatie
OPMERKING: De stappen om de Docker-omgeving voor te bereiden verschillen tussen de besturin...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

De voorbereiding van de sequencingbibliotheken is een cruciale stap om biologische vragen op de best mogelijke manier te beantwoorden. Het type transcripties van belang van de studie zal bepalen welk type sequencingbibliotheek zal worden gekozen en bio-informaticaanalyses aansturen. Bijvoorbeeld, van de sequencing van een pathogeen en gastheer interactie, afhankelijk van het type sequencing, is het mogelijk om sequenties van beide of alleen van de gastheer transcripties te identificeren.
Next-...

Arbovirussen, zoals dengue, gele koorts, chikungunya en zika, zijn op grote schaal geassocieerd met verschillende endemische uitbraken en zijn naar voren gekomen als een van de belangrijkste pathogenen die verantwoordelijk zijn voor het infecteren van mensen in de afgelopen decennia1,2. Personen die besmet zijn met het chikungunya-virus (CHIKV) hebben vaak koorts, hoofdpijn, huiduitslag, polyartriagie en artritis3,4,5. Virussen kunnen de genexpressie van de cel ondermijnen en verschillende signaalroutes van de gastheer beïnvloeden. Onlangs gebruikten bloedtranscriptoomstudies RNA-seq om de differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) geassocieerd met acute CHIKV-infectie te identificeren in vergelijking met herstel6 of gezonde controles7. CHIKV-geïnfecteerde kinderen hadden up-gereguleerde genen die betrokken zijn bij aangeboren immuniteit, zoals die met betrekking tot cellulaire sensoren voor viraal RNA, JAK / STAT-signalering en toll-like receptorsignaleringsroutes6. Volwassenen die acuut geïnfecteerd waren met CHIKV vertoonden ook inductie van genen die verband houden met aangeboren immuniteit, zoals die gerelateerd zijn aan monocyten en dendritische celactivatie, en aan antivirale responsen7. De signaalroutes verrijkt met down-gereguleerde genen omvatten die met betrekking tot adaptieve immuniteit, zoals T-celactivatie en differentiatie en verrijking in T- en B-cellen7.
Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om transcriptoomgegevens van gastheer- en pathogene genen te analyseren. Vaak begint de voorbereiding van de RNA-seq-bibliotheek met de verrijking van volwassen poly-A-transcripten. Deze stap verwijdert het grootste deel van het ribosomale RNA (rRNA) en in sommige gevallen virale / bacteriële RNA's. Wanneer de biologische vraag echter betrekking heeft op de pathogene transcriptdetectie en RNA onafhankelijk van de vorige selectie wordt gesequenced, kunnen veel andere verschillende transcripten worden gedetecteerd door sequencing. Van subgenomische mRNA's is bijvoorbeeld aangetoond dat ze een belangrijke factor zijn om de ernst van de ziekten te verifiëren8. Bovendien genereren voor bepaalde virussen zoals CHIKV en SARS-CoV-2 zelfs poly-A verrijkte bibliotheken virale reads die kunnen worden gebruikt in downstream-analyses9,10. Wanneer gericht op de analyse van het gastheertranscriptoom, kunnen onderzoekers de biologische verstoring over monsters onderzoeken, differentieel tot expressie gebrachte genen en verrijkte pathways identificeren en co-expressiemodules genereren7,11,12. Dit protocol belicht transcriptoomanalyses van CHIKV-geïnfecteerde patiënten en gezonde personen met behulp van verschillende bioinformatische benaderingen (figuur 1A). Gegevens van een eerder gepubliceerde studie7 bestaande uit 20 gezonde en 39 CHIKV acuut geïnfecteerde personen werden gebruikt om de representatieve resultaten te genereren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Pathogenen kunnen een breed scala aan infectieziekten veroorzaken. De biologische processen die door de gastheer worden geïnduceerd als reactie op infectie bepalen de ernst van de ziekte. Om dergelijke processen te bestuderen, kunnen onderzoekers high-throughput sequencing-technieken (RNA-seq) gebruiken die de dynamische veranderingen van het gastheertranscriptoom meten in verschillende stadia van infectie, klinische uitkomsten of ernst van de ziekte. Dit onderzoek kan leiden tot een beter begrip van de ziekten, evenals het blootleggen van potentiële medicijndoelen en behandelingen. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencinggegevens van onbewerkte reads tot functionele analyse te analyseren. De pijplijn is verdeeld in vijf stappen: (1) kwaliteitscontrole van de gegevens; (2) in kaart brengen en annoteren van genen; (3) statistische analyse om differentieel tot expressie gebrachte genen en mede-tot expressie gebrachte genen te identificeren; (4) bepaling van de moleculaire mate van verstoring van monsters; en (5) functionele analyse. Stap 1 verwijdert technische artefacten die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van downstream-analyses. In stap 2 worden genen in kaart gebracht en geannoteerd volgens standaard bibliotheekprotocollen. De statistische analyse in stap 3 identificeert genen die differentieel tot expressie komen of co-tot expressie komen in geïnfecteerde monsters, in vergelijking met niet-geïnfecteerde monsters. Monstervariabiliteit en de aanwezigheid van potentiële biologische uitschieters worden geverifieerd met behulp van de moleculaire mate van verstoringsbenadering in stap 4. Ten slotte onthult de functionele analyse in stap 5 de routes die verband houden met het fenotype van de ziekte. De gepresenteerde pijplijn is bedoeld om onderzoekers te ondersteunen door middel van de RNA-seq data-analyse van gastheer-pathogeeninteractiestudies en toekomstige in vitro of in vivo experimenten te stimuleren, die essentieel zijn om het moleculaire mechanisme van infecties te begrijpen.

De computeromgeving voor transcriptoomanalyses is gemaakt en geconfigureerd op het Docker-platform. Deze aanpak stelt beginnende Linux-gebruikers in staat om Linux-terminalsystemen te gebruiken zonder a priori managementkennis. Het Docker-platform gebruikt de bronnen van het hostbesturingssysteem om een servicecontainer te maken die specifieke hulpprogramma's van gebruikers bevat (afbeelding 1B). Een container op basis van de Linux OS Ubuntu 20.04-distributie werd gemaakt en deze was volledi...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencing transcriptoomgegevens te analyseren, van ruwe reads tot functionele analyse, inclusief kwaliteitscontrole en voorbewerkingsstappen tot geavanceerde statistische analytische benaderingen.

Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Welkom bij het protocol van high-throughput transcriptoomanalyse voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties. Dit protocol is onderverdeeld in de volgende stappen. Kwaliteitscontrole om leesbewerkingen van lage kwaliteit te filteren en ook om adaptersequenties sequencing en annotaties te verwijderen, waar moet je de reads in kaart brengen in een referentiegenomen en de reads in de genen annoteren.Statistische en co-expressie analyse, die de differentieel tot expressie gebrachte genen definieert en ook de co-expressiemodules vindt. Moleculaire mate van perturbatieanalyse om potentiële uitschieters te vinden. En ten slotte de functionele analyse om de biologische functies van differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen.Alle tools die deze pijplijnen gebruikten, waren vooraf geïnstalleerd in een Linux-systeem en ingekapseld in een Docker-container. De monsters die deze protocollen gebruiken, zijn afgeleid van een paper gepubliceerd door onze groep in PLOS Pathogen. De monsters omvatten 20 gezonde mensen en 39 patiënten besmet met het Chikungunya-virus.De bloedmonsters werden verzameld en RNA-sequencing werd uitgevoerd. Om Docker in Windows-systeem te installeren, moet u deze stappen volgen. Ga naar de officiële webpagina van Docker en klik op Aan de slag.Zoek het installatieprogramma voor Docker Desktop voor Windows. Download het bestand. Installeer lokaal in uw computer.Zorg ervoor dat deze twee opties zijn gemarkeerd. Nadat u het programma hebt geïnstalleerd, downloadt u de Docker-installatiekopie voor dit protocol. Ga naar de Windows-terminal.Voer de opdrachten uit om de afbeelding te downloaden. Na het downloaden van de afbeelding kunt u het bestand op het Docker-bureaublad zien en vanuit deze afbeelding kunnen we de container starten. Nadat u op de ronde knop hebt geklikt, moet u de oorspronkelijke parameters en opties uitvouwen om de naam van de container te definiëren en een map op uw lokale computer te koppelen aan de map in Docker.Hierna klikt u op Uitvoeren om de container te starten. U hebt dan toegang tot de terminal, die zich in het Linux-systeem in de Docker bevindt. Typ de bash-opdrachten en vervolgens kunt u alle opdrachten van dit protocol uitvoeren.Eerst moeten we de bron uitvoeren om alle tools van dit protocol beschikbaar te maken. U moet toegang krijgen tot de directoryscripts. Om een transcriptomische analyse uit te voeren, moet u eerst het referentiegenoom downloaden.Hiervoor moet u de volgende opdrachten uitvoeren. Nadat het genoom is gedownload, moet je de annotatie van de genen downloaden. Om dit te doen, moet u de volgende opdrachten typen.Vervolgens moet u de fastq-dump configureren. Hiermee kunt u de sequencingbestanden van de voorbeelden downloaden. Nadat u de volgende opdrachten hebt getypt, moet u de Tab-knop gebruiken om naar de optie Extra te gaan en de map met optiesstromen te markeren.Gebruik de Tab-knoppen om op te slaan en vervolgens ok. En verlaat vervolgens de tool fastq-dump. Nu kunnen we de downloads van de reads starten door de volgende opdrachten te typen.De kwaliteitscontrole bestaat uit en evalueert grafisch de kans op fouten in de sequencing reads. In deze stap moet u ook de technische sequenties zoals adapters verwijderen. Om de kwaliteitscontrolegrafieken te genereren, moet u het FastQC-programma uitvoeren.Als u de adapterreeksen en de reeksen van lage kwaliteit wilt verwijderen, moet u de volgende opdrachten typen. Met de goede kwaliteit metingen moeten we nu de metingen in het referentiegenoom in kaart brengen. Na het in kaart brengen moeten we de genen annoteren volgens de menselijke genen en vervolgens het aantal metingen tellen dat overeenkomt met elk menselijk gen.De eerste stap is het indexeren van het referentiegenoom door het volgende commando te typen. En dan typen we deze commando's om de metingen in het menselijk genoom in kaart te brengen. Vervolgens moet u de scripts uitvoeren die de reads annoteren.Na het in kaart brengen en annoteren, kunt u de differentiële expressieanalyse uitvoeren die bestaat uit het vinden van de genen waarvan de expressie hoger of lager is in de ene groep in vergelijking met de andere. Om de differentieel tot expressie gebrachte genen of DEG's te identificeren, moet u de volgende opdrachten uitvoeren. Hierna kunt u de gegevensresultaten van de Docker naar uw lokale computer overbrengen.Ga hiervoor naar de terminal en typ de volgende opdrachten om alle resultaten op te slaan in een lokale map. Om de resterende analyse uit te voeren, moet u ook alle bestanden van de mapgegevens naar een map op uw lokale computer kopiëren. Op uw lokale computer kunt u de mappen zien waarin u de gegevens van Docker hebt opgeslagen.Zoals u kunt zien, hebt u toegang tot alle bibliotheken. U kunt ook het HTML-bestand openen dat de kwaliteitscontrolerapporten bevat. U kunt ook toegang krijgen tot een map met de differentieel tot expressie gebrachte genen.En in deze directory vindt u de vulkaanplots waar u de genen kunt zien die omhoog of omlaag zijngerreguleerd in de ene groep versus de andere, in dit geval patiënten die zijn geïnfecteerd met het Chikungunya-virus versus gezonde controles. Alle resterende stappen van dit protocol worden uitgevoerd in webtools met behulp van uw browser. Laten we eerst beginnen met CEMiTool.Ga naar de browser en typ het volgende adres. CEMiTool identificeert co-expressiemodules uit expressiegegevenssets die door de gebruikers worden geleverd. Op de hoofdpagina kunt u naar het menu gaan en op de knop Uitvoeren klikken.Hiermee wordt een nieuwe pagina geopend waar u het expressiebestand kunt uploaden. Dit bestand bevindt zich in de mapgegevens van uw lokale computer. U zult zien dat er drie expressiebestanden zijn, en degene die we gaan gebruiken voor de CEMiTool is een normalisatie-oproep tmm.Vervolgens moet je het fenodata-bestand selecteren, hetzelfde voor het bestand met de eiwit-eiwitinteracties, en ten slotte het bestand uploaden dat de genensets of paden bevat. Het genensetbestand stelt CEMiTool in staat om verrijkingsanalyses uit te voeren voor elk van de co-expressiemodules. Vervolgens moet u het parametergedeelte uitvouwen en op VST toepassen klikken.Daarna kunt u gewoon klikken CEMiTool uitvoeren. Nadat u CEMiTool hebt uitgevoerd, ziet u dat 12 co-expressiemodules zijn geïdentificeerd. Door hier te klikken, kunt u alle resultaten van deze analyse downloaden.Een ander hulpmiddel dat we in dit protocol gaan gebruiken, is MDP, of moleculaire mate van verstoring. Typ gewoon in uw browser mdp.sysbio.tools. MDP berekent de moleculaire afstand van elk monster in vergelijking met een referentiegroep van monsters, in dit geval de gezonde controles, om niet alleen potentiële uitschieters te vinden, maar ook hoe verstoord elk monster is in vergelijking met deze groep.Op de pagina Uitvoeren kunt u het expressiebestand uploaden door op de knop te klikken en het bestand te selecteren. Vervolgens moet u het fenodata-bestand uploaden. Vervolgens moet u definiëren welke kolom de informatie over de groep of de klasse bevat en vervolgens welke klasse of groep overeenkomt met de controlegroep.Hierna kunt u gewoon MDP uitvoeren. Het staafdiagram toont voor elk van de monsters als een staaf de score van de moleculaire mate van verstoring en de kleuren vertegenwoordigen de verschillende groepen. En de box plot is een andere manier om dezelfde resultaten te visualiseren waar je op elke stip ziet dat er een ander voorbeeld is, gescheiden door twee groepen.Om de functionele analyse uit te voeren, gaan we de Enrichr-tool gebruiken. Hiervoor moet je de lijst met genen selecteren die differentieel tot expressie zijn gebracht, omhoog of omlaag, en deze gebruiken als een invoergenlijst in Enrichr-tool. U zult zien dat er verschillende tabbladen zijn.Alle resultaten kunnen ook worden gedownload naar uw lokale computer. De computeromgeving voor transcriptoomanalyse is op het Docker-platform geplaatst. Met deze aanpak kunnen gebruikers zonder eerdere ervaring met linux-systeem een terminal gebruiken.In deze container is er een vooraf gedefinieerde mappenstructuur voor gegevensset en scripts die nodig zijn voor alle analyses. In de pijplijn zullen gebruikers bloedtranscriptoomgegevens gebruiken van 20 gezonde personen en 39 patiënten die acuut zijn geïnfecteerd met het Chikungunya-virus. Het sequencingplatform retourneert een set FASTQ-bestanden die de DNA-sequentie bevatten, d.w.z.de aflezingen en de bijbehorende kwaliteit voor elke nucleotidebasis. De Phred-kwaliteitsschaal geeft de waarschijnlijkheid van een onjuiste meting voor elke basis aan. Hulpprogramma's identificeren en verwijderen leesbewerkingen van lage kwaliteit uit monsters en verhogen de kans op toewijzingsleesbewerkingen.In deze stap, de mapping module, worden de hoogwaardige reads hersteld gebruikt als input om ze uit te lijnen met het menselijke referentiegenoom. CEMiTool identificeert en analyseert co-expressie modules. Genen binnen dezelfde module worden mede tot expressie gebracht, wat betekent dat ze vergelijkbare expressiepatronen vertonen in de monsters van de datasets.De netwerkanalyse geeft informatie over de meest verbonden genen, d.w.z. de hubs. De namen van die genen worden getoond in het netwerk.De grootte van de knooppunten is evenredig met de mate van connectiviteit. De resultaten van de DEG-analyse werden samengevat in de vulkaanplots. De analyse van de moleculaire mate van verstoring maakt de identificatie van verstoorde monsters van gezonde en geïnfecteerde personen mogelijk.MDP suggereert welke monsters potentiële biologische uitschieters zijn. Het verwijderen van die monsters heeft invloed op de stroomafwaartse resultaten. Een functionele verrijkingsanalyse met behulp van AURA kan worden uitgevoerd met de Enrichr-tool.Deze stappen helpen om de resultaten te interpreteren door gemeenschappelijke functionele rollen van verschillende genen te onthullen die differentieel tot expressie kwamen. Het biologische proces dat in de staafdiagrammen wordt getoond, is de top 10 verrijkte genensets op basis van hun p-waarderangschikking. Kortom, deze protocollen omvatten alle stappen van RNA-Seq-analyse.De pijplijn werd ontwikkeld en ingekapseld in het niet-commerciële systeem docker. Op een afbeelding en beschikbaar gesteld voor de wetenschappelijke gemeenschap. Door het containersysteem vallen alle scripts en tools onder dezelfde specifieke versie om reproduceerbaarheid te garanderen.Verder werd een deel van de bioinformatica-analyse uitgevoerd via gratis gebruiksvriendelijke webtools.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...