Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN est financé par faPESP (numéros de subvention: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 et 2013/08216-2) et CNPq (313662/2017-7).
Nous sommes particulièrement reconnaissants aux subventions suivantes pour les boursiers : ANAG (Processus FAPESP 2019/13880-5), VEM (Processus FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Processus FAPESP 2020/05284-0), APV (Processus FAPESP 2019/27146-1) et RLTO (Processus CNPq 134204/2019-0).

Les échantillons utilisés dans ce protocole ont été approuvés par les comités d’éthique du Département de microbiologie de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo et de l’Université fédérale de Sergipe (Protocoles: 54937216.5.0000.5467 et 54835916.2.0000.5546, respectivement).
1. Installation du bureau Docker
REMARQUE : Les étapes de préparation de l’environnement Docker sont différentes selon les s...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

La préparation des bibliothèques de séquençage est une étape cruciale pour répondre aux questions biologiques de la meilleure façon possible. Le type de transcriptions d’intérêt de l’étude guidera quel type de bibliothèque de séquençage sera choisi et conduira à des analyses bioinformatiques. Par exemple, à partir du séquençage d’un agent pathogène et de l’interaction hôte, selon le type de séquençage, il est possible d’identifier des séquences à partir des deux ou simplement à partir de...

Les arbovirus, tels que la dengue, la fièvre jaune, le chikungunya et le zika, ont été largement associés à plusieurs épidémies endémiques et sont devenus l’un des principaux agents pathogènes responsables de l’infection des humains au cours des dernières décennies1,2. Les personnes infectées par le virus chikungunya (CHIKV) ont souvent de la fièvre, des maux de tête, des éruptions cutanées, une polyarthralgie et de l’arthrite3,4,5. Les virus peuvent subvertir l’expression génique de la cellule et influencer diverses voies de signalisation de l’hôte. Récemment, des études sur le transcriptome sanguin ont utilisé l’ARN-seq pour identifier les gènes exprimés différentiellement (DEG) associés à l’infection aiguë par le CHIKV par rapport à la convalescence6 ou aux témoins sains7. Les enfants infectés par le CHIKV avaient des gènes régulés à la hausse qui sont impliqués dans l’immunité innée, tels que ceux liés aux capteurs cellulaires pour l’ARN viral, à la signalisation JAK / STAT et aux voies de signalisation des récepteurs de type toll6. Les adultes gravement infectés par le CHIKV ont également montré l’induction de gènes liés à l’immunité innée, tels que ceux liés aux monocytes et à l’activation des cellules dendritiques, et aux réponses antivirales7. Les voies de signalisation enrichies en gènes régulés à la baisse comprenaient celles liées à l’immunité adaptative, telles que l’activation, la différenciation et l’enrichissement des lymphocytes T et B7.
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour analyser les données du transcriptome des gènes hôtes et pathogènes. Souvent, la préparation de la bibliothèque RNA-seq commence par l’enrichissement des transcriptions poly-A matures. Cette étape élimine la plupart de l’ARN ribosomique (ARNr) et, dans certains cas, des ARN viraux/bactériens. Cependant, lorsque la question biologique implique la détection du transcrit pathogène et que l’ARN est séquencé indépendamment de la sélection précédente, de nombreux autres transcrits différents pourraient être détectés par séquençage. Par exemple, les ARNm sous-économiques se sont révélés être un facteur important pour vérifier la gravité des maladies8. De plus, pour certains virus tels que le CHIKV et le SARS-CoV-2, même les bibliothèques enrichies en poly-A génèrent des lectures virales qui peuvent être utilisées dans les analyses en aval9,10. Lorsqu’ils se concentrent sur l’analyse du transcriptome de l’hôte, les chercheurs peuvent étudier la perturbation biologique à travers les échantillons, identifier les gènes exprimés différemment et les voies enrichies, et générer des modules de co-expression7,11,12. Ce protocole met en évidence les analyses de transcriptome de patients infectés par le CHIKV et de personnes en bonne santé utilisant différentes approches bioinformatiques (Figure 1A). Les données d’une étude publiée précédemment7 portant sur 20 personnes en bonne santé et 39 personnes gravement infectées par le CHIKV ont été utilisées pour générer les résultats représentatifs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Les agents pathogènes peuvent causer une grande variété de maladies infectieuses. Les processus biologiques induits par l’hôte en réponse à l’infection déterminent la gravité de la maladie. Pour étudier de tels processus, les chercheurs peuvent utiliser des techniques de séquençage à haut débit (séquençage de l’ARN) qui mesurent les changements dynamiques du transcriptome de l’hôte à différents stades de l’infection, des résultats cliniques ou de la gravité de la maladie. Cette enquête peut mener à une meilleure compréhension des maladies, ainsi qu’à la découverte de cibles médicamenteuses et de traitements potentiels. Le protocole présenté ici décrit un pipeline complet pour analyser les données de séquençage de l’ARN, des lectures brutes à l’analyse fonctionnelle. Le pipeline est divisé en cinq étapes : (1) contrôle de la qualité des données; 2° la cartographie et l’annotation des gènes; 3° l’analyse statistique pour identifier les gènes exprimés différemment et les gènes co-exprimés; 4° la détermination du degré moléculaire de la perturbation des échantillons; et (5) l’analyse fonctionnelle. L’étape 1 élimine les artefacts techniques qui peuvent avoir une incidence sur la qualité des analyses en aval. À l’étape 2, les gènes sont cartographiés et annotés selon les protocoles standard de la bibliothèque. L’analyse statistique de l’étape 3 identifie les gènes qui sont exprimés différemment ou co-exprimés dans les échantillons infectés, par rapport aux échantillons non infectés. La variabilité de l’échantillon et la présence de valeurs aberrantes biologiques potentielles sont vérifiées à l’aide de l’approche du degré moléculaire de perturbation à l’étape 4. Enfin, l’analyse fonctionnelle de l’étape 5 révèle les voies associées au phénotype de la maladie. Le pipeline présenté vise à soutenir les chercheurs à travers l’analyse des données ARN-seq à partir d’études d’interaction hôte-pathogène et à conduire de futures expériences in vitro ou in vivo , qui sont essentielles pour comprendre le mécanisme moléculaire des infections.

L’environnement informatique pour les analyses de transcriptome a été créé et configuré sur la plate-forme Docker. Cette approche permet aux utilisateurs Linux débutants d’utiliser des systèmes de terminaux Linux sans connaissances a priori en gestion. La plate-forme Docker utilise les ressources du système d’exploitation hôte pour créer un conteneur de services qui inclut des outils d’utilisateurs spécifiques (Figure 1B). Un conteneur basé sur la distribution Linux OS Ub...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Le protocole présenté ici décrit un pipeline complet pour analyser les données de transcriptome de séquençage de l’ARN, des lectures brutes à l’analyse fonctionnelle, y compris le contrôle de la qualité et les étapes de prétraitement aux approches analytiques statistiques avancées.

Analyse du transcriptome à haut débit pour l’étude des interactions hôte-pathogène

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Bienvenue dans le protocole d’analyse du transcriptome à haut débit pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Ce protocole est divisé en plusieurs étapes. Contrôle de la qualité pour filtrer les lectures de mauvaise qualité et également pour supprimer les séquences d’adaptateur Séquençage et annotations, où êtes-vous pour mapper les lectures dans un génome de référence et annoter les lectures dans les gènes.Analyse statistique et de co-expression, qui définit les gènes exprimés différentiellement et trouve également les modules de co-expression. Analyse du degré moléculaire de perturbation pour trouver des échantillons potentiels aberrants. Et enfin, l’analyse fonctionnelle pour déterminer les fonctions biologiques des gènes exprimés différentiellement.Tous les outils utilisant ces pipelines ont été préinstallés dans un système Linux et encapsulés dans un conteneur Docker. Les échantillons utilisant ces protocoles proviennent d’un article publié par notre groupe dans PLOS Pathogen. Les échantillons comprennent 20 personnes en bonne santé et 39 patients infectés par le virus Chikungunya.Les échantillons de sang ont été prélevés et le séquençage de l’ARN a été effectué. Pour installer Docker dans le système Windows, vous devez suivre ces étapes. Accédez à la page Web officielle de Docker et cliquez sur Démarrer.Recherchez le programme d’installation de Docker Desktop pour Windows. Téléchargez le fichier. Installez localement sur votre machine.Assurez-vous que ces deux options sont marquées. Après avoir installé le programme, télécharge l’image Docker pour ce protocole. Accédez au terminal Windows.Exécutez les commandes pour télécharger l’image. Après avoir téléchargé l’image, vous pouvez voir le fichier dans le bureau Docker, et à partir de cette image, nous pouvons lancer le conteneur. Après avoir cliqué sur le bouton rond, vous devez développer les paramètres et options d’origine pour définir le nom du conteneur et associer un dossier de votre ordinateur local au dossier dans Docker.Après cela, vous cliquez sur Exécuter pour lancer le conteneur. Vous pouvez ensuite accéder au terminal, qui se trouve dans le système Linux à l’intérieur du Docker. Tapez les commandes bash, puis vous pouvez exécuter toutes les commandes de ce protocole.Tout d’abord, nous devons exécuter la source pour rendre tous les outils de ce protocole disponibles. Vous devez accéder aux scripts d’annuaire. Pour effectuer une analyse transcriptomique, vous devez d’abord télécharger le génome de référence.Pour cela, vous devez exécuter les commandes suivantes. Une fois le génome téléchargé, vous devez télécharger l’annotation des gènes. Pour ce faire, vous devez taper les commandes suivantes.Ensuite, vous devez configurer le fastq-dump. Cela vous permet de télécharger les fichiers de séquençage des exemples. Après avoir tapé les commandes suivantes, vous devez utiliser le bouton Tab pour accéder à l’option Outils et marquer le répertoire des options actuelles.Utilisez les boutons Tab pour enregistrer, puis OK. Et puis quittez l’outil fastq-dump. Maintenant, nous pouvons lancer les téléchargements des lectures en tapant les commandes suivantes.Le contrôle qualité consiste et évalue graphiquement la probabilité d’erreurs dans les lectures de séquençage. Dans cette étape, vous devez également supprimer les séquences techniques telles que les adaptateurs. Pour générer les graphiques de contrôle de la qualité, vous devez exécuter le programme FastQC.Pour supprimer les séquences d’adaptateur et les séquences de mauvaise qualité, vous devez taper les commandes suivantes. Avec les lectures de bonne qualité, nous devons maintenant cartographier les lectures dans le génome de référence. Après la cartographie, nous allons devoir annoter les gènes en fonction des gènes humains, puis compter le nombre de lectures qui correspondent à chaque gène humain.La première étape consiste à indexer le génome de référence en tapant la commande suivante. Et puis nous tapons ces commandes pour mapper les lectures dans le génome humain. Ensuite, vous devez exécuter les scripts qui annotent les lectures.Après le mappage et l’annotation, vous pouvez effectuer l’analyse d’expression différentielle qui consiste à trouver les gènes dont l’expression est supérieure ou inférieure dans un groupe par rapport à un autre. Pour identifier les gènes exprimés différentiellement, ou DEG, vous devez exécuter les commandes suivantes. Après cela, vous pouvez transférer les résultats des données du Docker vers votre ordinateur local.Pour cela, accédez au terminal et tapez les commandes suivantes pour enregistrer tous les résultats dans un dossier local. Pour effectuer l’analyse restante, vous devez également copier tous les fichiers des données du répertoire dans un répertoire de votre ordinateur local. Sur votre ordinateur local, vous pourrez voir les répertoires dans lesquels vous avez enregistré les données de Docker.Comme vous pouvez le voir, vous pouvez accéder à toutes les bibliothèques. Vous pouvez également ouvrir le fichier HTML contenant les rapports de contrôle qualité. Vous pouvez également accéder à un répertoire contenant les gènes exprimés différentiellement.Et à l’intérieur de ce répertoire, vous trouverez les diagrammes de volcan où vous pouvez voir les gènes qui sont régulés à la hausse ou à la baisse dans un groupe par rapport à un autre, dans ce cas, les patients infectés par le virus Chikungunya par rapport aux témoins sains. Toutes les étapes restantes de ce protocole vont être exécutées dans des outils Web à l’aide de votre navigateur. Commençons d’abord par CEMiTool.Accédez au navigateur et tapez l’adresse suivante. CEMiTool identifie les modules de co-expression à partir d’ensembles de données d’expression fournis par les utilisateurs. Dans la page principale, vous pouvez aller dans le menu et cliquer sur le bouton Exécuter.Cela ouvrira une nouvelle page où vous pourrez télécharger le fichier d’expression. Ce fichier se trouve dans les données du répertoire de votre ordinateur local. Vous verrez qu’il y a trois fichiers d’expression, et celui que nous allons utiliser pour le CEMiTool est un appel de normalisation tmm.Ensuite, vous devez sélectionner le fichier phénodata, la même chose pour le fichier contenant les interactions protéine-protéine, et enfin, télécharger le fichier contenant les ensembles de gènes ou les voies. Le fichier d’ensembles de gènes permet à CEMiTool d’effectuer une analyse d’enrichissement pour chacun des modules de co-expression. Ensuite, vous devez développer la section des paramètres et cliquer sur Appliquer VST.Après cela, vous pouvez simplement cliquer sur Exécuter CEMiTool. Après avoir exécuté CEMiTool, vous verrez que 12 modules de co-expression ont été identifiés. En cliquant ici, vous pouvez télécharger tous les résultats de ces analyses.Un autre outil que nous allons utiliser dans ce protocole est MDP, ou degré moléculaire de perturbation. Il suffit de taper dans votre navigateur mdp.sysbio.tools. MDP calcule la distance moléculaire de chaque échantillon par rapport à un groupe de référence d’échantillons, dans ce cas, les témoins sains, afin de trouver non seulement les valeurs aberrantes potentielles, mais aussi à quel point chaque échantillon est perturbé par rapport à ce groupe.Dans la page Exécuter, vous pouvez simplement télécharger le fichier d’expression en cliquant sur le bouton et en sélectionnant le fichier. Ensuite, vous devez télécharger le fichier phenodata. Ensuite, vous devez définir quelle colonne contient les informations sur le groupe ou la classe, puis quelle classe ou quel groupe correspond au groupe de contrôle.Après cela, vous pouvez simplement exécuter MDP. Le graphique à barres montre pour chacun des échantillons sous forme de barre le score du degré moléculaire de perturbation, et les couleurs représentent les différents groupes. Et le diagramme de boîte est une autre façon de visualiser les mêmes résultats où vous voyez sur chaque point un échantillon différent séparé par deux groupes.Pour effectuer l’analyse fonctionnelle, nous allons utiliser l’outil Enrichr. Pour cela, vous devez sélectionner la liste des gènes qui ont été exprimés différemment, régulés à la hausse ou à la baisse, et l’utiliser comme liste de gènes d’entrée dans l’outil Enrichr. Vous verrez qu’il existe différents onglets.Tous les résultats peuvent également être téléchargés sur votre ordinateur local. L’environnement informatique pour l’analyse du transcriptome a été placé sur la plate-forme Docker. Cette approche permet aux utilisateurs sans expérience préalable avec le système Linux d’utiliser un terminal.Dans ce conteneur, il existe une structure de dossiers prédéfinie pour le jeu de données et les scripts qui sont nécessaires pour toute l’analyse. Dans le pipeline, les utilisateurs utiliseront les données du transcriptome sanguin de 20 personnes en bonne santé et de 39 patients gravement infectés par le virus Chikungunya. La plateforme de séquençage renvoie un ensemble de fichiers FASTQ contenant la séquence d’ADN, c’est-à-direles lectures et la qualité associée pour chaque base nucléotidique. L’échelle de qualité Phred indique la probabilité d’une lecture incorrecte pour chaque base. Les outils identifient et suppriment les lectures de mauvaise qualité des échantillons et augmentent la probabilité de mappage des lectures.Dans cette étape, le module de cartographie, les lectures de haute qualité récupérées sont utilisées comme entrées pour les aligner sur le génome de référence humain. CEMiTool identifie et analyse les modules de co-expression. Les gènes d’un même module sont co-exprimés, ce qui signifie qu’ils présentent des modèles d’expression similaires dans les échantillons des ensembles de données.L’analyse du réseau fournit des informations sur les gènes les plus connectés, c’est-à-dire les hubs. Les noms de ces gènes sont affichés dans le réseau.La taille des nœuds est proportionnelle à son degré de connectivité. Les résultats obtenus à partir de l’analyse DEG ont été résumés dans les diagrammes des volcans. L’analyse du degré moléculaire de perturbation permet d’identifier des échantillons perturbés provenant d’individus sains et infectés.MDP suggère quels échantillons sont des valeurs aberrantes biologiques potentielles. Le retrait de ces échantillons aura un impact sur les résultats en aval. Une analyse d’enrichissement fonctionnel à l’aide d’AURA peut être effectuée avec l’outil Enrichr.Ces étapes aident à interpréter les résultats en révélant les rôles fonctionnels communs de plusieurs gènes qui ont été exprimés différemment. Le processus biologique montré dans les graphiques à barres sont les 10 premiers ensembles de gènes enrichis en fonction de leur classement de la valeur p. En conclusion, ces protocoles couvrent toutes les étapes de l’analyse ARN-Seq.Le pipeline a été développé et encapsulé dans le système non commercial nommé Docker. Sur une image et mise à la disposition de la communauté scientifique. Grâce au système de conteneurs, tous les scripts et outils sont sous la même version spécifique pour garantir la reproductibilité.En outre, une partie de l’analyse bioinformatique a été effectuée via des outils Web gratuits et conviviaux.

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