Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN wird von FAPESP (Fördernummern: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 und 2013/08216-2) und CNPq (313662/2017-7) finanziert.
Besonders dankbar sind wir für folgende Stipendien für Fellows: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) und RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

Die in diesem Protokoll verwendeten Proben wurden von den Ethikkommissionen sowohl der Abteilung für Mikrobiologie des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von São Paulo als auch der Bundesuniversität von Sergipe genehmigt (Protokolle: 54937216.5.0000.5467 bzw. 54835916.2.0000.5546).
1. Docker Desktop-Installation
HINWEIS: Die Schritte zum Vorbereiten der Docker-Umgebung unterscheiden sich zwischen den Betriebssystemen (Be...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Die Aufbereitung der Sequenzierbibliotheken ist ein entscheidender Schritt, um biologische Fragestellungen bestmöglich zu beantworten. Die Art der Transkripte, die für die Studie von Interesse sind, wird bestimmen, welche Art von Sequenzierungsbibliothek ausgewählt wird, und bioinformatische Analysen vorantreiben. Zum Beispiel ist es aus der Sequenzierung einer Pathogen- und Wirtsinteraktion je nach Art der Sequenzierung möglich, Sequenzen aus beiden oder nur aus den Wirtstranskripten zu identifizieren.
<p class=...

Arboviren wie Dengue, Gelbfieber, Chikungunya und Zika wurden weithin mit mehreren endemischen Ausbrüchen in Verbindung gebracht und haben sich in den letzten Jahrzehnten als einer der Hauptpathogene für die Infektion des Menschen herausgestellt1,2. Personen, die mit dem Chikungunya-Virus (CHIKV) infiziert sind, haben oft Fieber, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Polyarthralgie und Arthritis3,4,5. Viren können die Genexpression der Zelle untergraben und verschiedene Wirtssignalwege beeinflussen. Kürzlich verwendeten Bluttranskriptomstudien RNA-seq, um die differentiell exprimierten Gene (DEGs) zu identifizieren, die mit einer akuten CHIKV-Infektion im Vergleich zur Rekonvaleszenz6 oder gesunden Kontrollen assoziiert sind7. CHIKV-infizierte Kinder hatten hochregulierte Gene, die an der angeborenen Immunität beteiligt sind, wie diejenigen, die mit zellulären Sensoren für virale RNA, JAK / STAT-Signalgebung und Toll-like-Rezeptor-Signalwege zusammenhängen6. Erwachsene, die akut mit CHIKV infiziert waren, zeigten auch eine Induktion von Genen, die mit der angeborenen Immunität zusammenhängen, wie z.B. solche, die mit Monozyten und der Aktivierung dendritischer Zellen sowie mit antiviralen Reaktionen zusammenhängen7. Zu den Signalwegen, die mit herunterregulierten Genen angereichert waren, gehörten diejenigen, die sich auf die adaptive Immunität bezogen, wie die Aktivierung und Differenzierung und Anreicherung von T-Zellen in T- und B-Zellen7.
Mehrere Methoden können verwendet werden, um Transkriptomdaten von Wirts- und Pathogengenen zu analysieren. Oft beginnt die Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek mit der Anreicherung reifer Poly-A-Transkripte. Dieser Schritt entfernt den größten Teil der ribosomalen RNA (rRNA) und in einigen Fällen virale/bakterielle RNAs. Wenn die biologische Frage jedoch den Nachweis des Pathogentranskripts beinhaltet und RNA unabhängig von der vorherigen Selektion sequenziert wird, könnten viele andere verschiedene Transkripte durch Sequenzierung nachgewiesen werden. Beispielsweise haben sich subgenomische mRNAs als wichtiger Faktor erwiesen, um die Schwere der Erkrankungen zu überprüfen8. Darüber hinaus erzeugen für bestimmte Viren wie CHIKV und SARS-CoV-2 sogar poly-A-angereicherte Bibliotheken virale Lesevorgänge, die in nachgelagerten Analysen verwendet werden können9,10. Wenn sie sich auf die Analyse des Wirtstranskriptoms konzentrieren, können die Forscher die biologische Störung über Proben hinweg untersuchen, differentiell exprimierte Gene und angereicherte Signalwege identifizieren und Koexpressionsmodule erzeugen7,11,12. Dieses Protokoll hebt Transkriptomanalysen von CHIKV-infizierten Patienten und gesunden Personen unter Verwendung verschiedener bioinformatischer Ansätze hervor (Abbildung 1A). Daten aus einer zuvor veröffentlichten Studie7, bestehend aus 20 gesunden und 39 CHIKV akut infizierten Personen, wurden verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse zu generieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Krankheitserreger können eine Vielzahl von Infektionskrankheiten verursachen. Die biologischen Prozesse, die vom Wirt als Reaktion auf eine Infektion induziert werden, bestimmen die Schwere der Erkrankung. Um solche Prozesse zu untersuchen, können Forscher Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (RNA-seq) verwenden, die die dynamischen Veränderungen des Wirtstranskriptoms in verschiedenen Stadien der Infektion, klinischen Ergebnissen oder Krankheitsschwere messen. Diese Untersuchung kann zu einem besseren Verständnis der Krankheiten sowie zur Aufdeckung potenzieller Wirkstoffziele und Behandlungen führen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten vom Rohlesen bis zur Funktionsanalyse. Die Pipeline ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Qualitätskontrolle der Daten; (2) Kartierung und Annotation von Genen; (3) statistische Analyse zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene und koexprimierter Gene; (4) Bestimmung des molekularen Grades der Störung von Proben; und (5) Funktionalanalyse. Schritt 1 entfernt technische Artefakte, die sich auf die Qualität nachgelagerter Analysen auswirken können. In Schritt 2 werden Gene nach Standardbibliotheksprotokollen kartiert und annotiert. Die statistische Analyse in Schritt 3 identifiziert Gene, die in infizierten Proben im Vergleich zu nicht infizierten Proben differentiell exprimiert oder koexprimiert werden. Die Probenvariabilität und das Vorhandensein potenzieller biologischer Ausreißer werden mit dem Ansatz des molekularen Störungsgrades in Schritt 4 überprüft. Schließlich zeigt die Funktionelle Analyse in Schritt 5 die mit dem Krankheitsphänotyp assoziierten Signalwege auf. Die vorgestellte Pipeline zielt darauf ab, Forscher durch die RNA-seq-Datenanalyse aus Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien zu unterstützen und zukünftige In-vitro- oder In-vivo-Experimente voranzutreiben, die für das Verständnis des molekularen Mechanismus von Infektionen unerlässlich sind.

Die Rechenumgebung für Transkriptomanalysen wurde auf der Docker-Plattform erstellt und konfiguriert. Dieser Ansatz ermöglicht es Linux-Anfängern, Linux-Terminalsysteme ohne a priori Managementkenntnisse zu verwenden. Die Docker-Plattform verwendet die Ressourcen des Hostbetriebssystems, um einen Dienstcontainer zu erstellen, der die Tools bestimmter Benutzer enthält (Abbildung 1B). Ein Container basierend auf der Linux OS Ubuntu 20.04 Distribution wurde erstellt und vollständig für tr...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine komplette Pipeline zur Analyse von RNA-Sequenzierungs-Transkriptomdaten von Rohlesungen bis hin zur Funktionsanalyse, einschließlich Qualitätskontroll- und Vorverarbeitungsschritten bis hin zu fortschrittlichen statistischen Analyseansätzen.

Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Willkommen beim Protokoll der Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Dieses Protokoll ist in die folgenden Schritte unterteilt. Qualitätskontrolle, um minderwertige Lesevorgänge zu filtern und auch Um Adaptersequenzen zu entfernen Sequenzierung und Annotationen, wo sie die Lesevorgänge in ein Referenzgenom abbilden und die Lesevorgänge in die Gene annotieren müssen.Statistische und Co-Expressionsanalyse, die die differentiell exprimierten Gene definiert und auch die Co-Expressionsmodule findet. Molekulare Interferenzgradanalyse, um potenzielle Ausreißerproben zu finden. Und schließlich die Funktionsanalyse zur Bestimmung der biologischen Funktionen differentiell exprimierter Gene.Alle Tools, die diese Pipelines verwenden, wurden in einem Linux-System vorinstalliert und in einem Docker-Container gekapselt. Die Proben, die diese Protokolle verwenden, stammen aus einem von unserer Gruppe in PLOS Pathogen veröffentlichten Artikel. Die Proben umfassen 20 gesunde Menschen und 39 Patienten, die mit dem Chikungunya-Virus infiziert sind.Die Blutproben wurden gesammelt und die RNA-Sequenzierung durchgeführt. Um Docker im Windows-System zu installieren, müssen Sie diese Schritte befolgen. Gehen Sie zur offiziellen Webseite von Docker und klicken Sie auf Erste Schritte.Suchen Sie das Installationsprogramm für Docker Desktop für Windows. Laden Sie die Datei herunter. Installieren Sie lokal auf Ihrem Computer.Stellen Sie sicher, dass diese beiden Optionen markiert sind. Nach der Installation des Programms lädt das Docker-Image für dieses Protokoll herunter. Gehen Sie zum Windows-Terminal.Führen Sie die Befehle aus, um das Bild herunterzuladen. Nachdem Sie das Image heruntergeladen haben, können Sie die Datei auf dem Docker-Desktop sehen, und von diesem Image aus können wir den Container initiieren. Nachdem Sie in die runde Schaltfläche geklickt haben, müssen Sie die ursprünglichen Parameter und Optionen erweitern, um den Namen des Containers zu definieren und einen Ordner auf Ihrem lokalen Computer mit dem Ordner in Docker zu verknüpfen.Danach klicken Sie auf Ausführen, um den Container zu initiieren. Sie können dann auf das Terminal zugreifen, das sich im Linux-System im Docker befindet. Geben Sie die bash-Befehle ein, und sie können dann alle Befehle dieses Protokolls ausführen.Zuerst müssen wir die Quelle ausführen, um alle Werkzeuge dieses Protokolls zur Verfügung zu stellen. Sie sollten auf die Verzeichnisskripts zugreifen. Um eine transkriptomische Analyse durchzuführen, müssen Sie zuerst das Referenzgenom herunterladen.Dazu müssen Sie die folgenden Befehle ausführen. Nachdem das Genom heruntergeladen wurde, müssen Sie die Annotation der Gene herunterladen. Dazu müssen Sie die folgenden Befehle eingeben.Als nächstes müssen Sie den fastq-dump konfigurieren. Auf diese Weise können Sie die Sequenzierungsdateien der Beispiele herunterladen. Nachdem Sie die folgenden Befehle eingegeben haben, müssen Sie die Tabulatorschaltfläche verwenden, um zur Option Extras zu wechseln und das Verzeichnis options currents zu markieren.Verwenden Sie die Tabulatorschaltflächen zum Speichern, und dann OK. Beenden Sie dann das Tool fastq-dump. Jetzt können wir die Downloads der Lesevorgänge initiieren, indem wir die folgenden Befehle eingeben.Die Qualitätskontrolle besteht und bewertet grafisch die Fehlerwahrscheinlichkeit in den Sequenzierungslesevorgängen. In diesem Schritt müssen Sie auch die technischen Sequenzen wie Adapter entfernen. Um die Qualitätskontrollgraphen zu generieren, müssen Sie das FastQC-Programm ausführen.Um die Adaptersequenzen und die Sequenzen von geringer Qualität zu entfernen, müssen Sie die folgenden Befehle eingeben. Mit den guten Lesevorgängen müssen wir nun die Lesevorgänge in das Referenzgenom abbilden. Nach der Kartierung müssen wir die Gene entsprechend den menschlichen Genen kommentieren und dann die Anzahl der Lesevorgänge zählen, die mit jedem menschlichen Gen übereinstimmen.Der erste Schritt besteht darin, das Referenzgenom zu indizieren, indem Sie den folgenden Befehl eingeben. Und dann geben wir diese Befehle ein, um die Lesevorgänge in das menschliche Genom abzubilden. Als Nächstes sollten Sie die Skripts ausführen, die die Lesevorgänge mit Anmerkungen versehen.Nach der Kartierung und Annotation können Sie die Differentialexpressionsanalyse durchführen, die darin besteht, die Gene zu finden, deren Expression in einer Gruppe höher oder niedriger ist als in einer anderen. Um die differentiell exprimierten Gene oder DEGs zu identifizieren, müssen Sie die folgenden Befehle ausführen. Danach können Sie die Datenergebnisse aus dem Docker auf Ihren lokalen Computer übertragen.Gehen Sie dazu zum Terminal und geben Sie die folgenden Befehle ein, um alle Ergebnisse in einem lokalen Ordner zu speichern. Um die verbleibende Analyse durchzuführen, müssen Sie auch alle Dateien der Verzeichnisdaten in ein Verzeichnis auf Ihrem lokalen Computer kopieren. Auf Ihrem lokalen Computer können Sie die Verzeichnisse sehen, in denen Sie die Daten aus Docker gespeichert haben.Wie Sie sehen können, können Sie auf alle Bibliotheken zugreifen. Sie können auch die HTML-Datei öffnen, die die Qualitätskontrollberichte enthält. Sie können auch auf ein Verzeichnis zugreifen, das die differentiell exprimierten Gene enthält.Und in diesem Verzeichnis finden Sie die Vulkandiagramme, in denen Sie die Gene sehen können, die in der einen Gruppe gegenüber einer anderen hoch- oder herunterreguliert sind, in diesem Fall Patienten, die mit dem Chikungunya-Virus infiziert sind, im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Alle verbleibenden Schritte dieses Protokolls werden in Web-Tools mit Ihrem Browser ausgeführt. Beginnen wir zunächst mit CEMiTool.Gehen Sie zum Browser und geben Sie die folgende Adresse ein. CEMiTool identifiziert Co-Expression-Module aus Expression-Datensätzen, die von den Benutzern bereitgestellt werden. Auf der Hauptseite können Sie in das Menü gehen und in den Button Ausführen klicken.Dadurch wird eine neue Seite geöffnet, auf der Sie die Ausdrucksdatei hochladen können. Diese Datei befindet sich in den Verzeichnisdaten Ihres lokalen Computers. Sie werden sehen, dass es drei Ausdrucksdateien gibt, und diejenige, die wir für das CEMiTool verwenden werden, ist ein Normalisierungsaufruf tmm.Dann müssen Sie die Phänodatendatei auswählen, dasselbe gilt für die Datei, die die Protein-Protein-Interaktionen enthält, und schließlich die Datei hochladen, die die Gensätze oder Signalwege enthält. Die Gensatzdatei ermöglicht es CEMiTool, eine Anreicherungsanalyse für jedes einzelne des Co-Expressionsmoduls durchzuführen. Als Nächstes sollten Sie den Parameterabschnitt erweitern und auf VST anwenden klicken.Danach können Sie einfach auf CEMiTool ausführen klicken. Nachdem Sie CEMiTool ausgeführt haben, werden Sie sehen, dass 12 Co-Expression-Module identifiziert wurden. Wenn Sie hier klicken, können Sie alle Ergebnisse dieser Analyse herunterladen.Ein weiteres Werkzeug, das wir in diesem Protokoll verwenden werden, ist MDP oder Molecular Degree of Perturbation. Geben Sie einfach Ihren Browser mdp.sysbio.tools ein. MDP berechnet den molekularen Abstand jeder Probe im Vergleich zu einer Referenzgruppe von Proben, in diesem Fall den gesunden Kontrollen, um nicht nur potenzielle Ausreißer zu finden, sondern auch, wie gestört jede Probe im Vergleich zu dieser Gruppe ist.Auf der Seite Ausführen können Sie die Ausdrucksdatei einfach hochladen, indem Sie auf die Schaltfläche klicken und die Datei auswählen. Dann müssen Sie die phenodata-Datei hochladen. Dann müssen Sie definieren, welche Spalte die Informationen über die Gruppe oder die Klasse enthält und dann welche Klasse oder Gruppe der Kontrollgruppe entspricht.Danach können Sie einfach MDP ausführen. Das Balkendiagramm zeigt für jede der Proben als Balken die Punktzahl des molekularen Störungsgrades an, und die Farben stellen die verschiedenen Gruppen dar. Und das Box-Plot ist eine weitere Möglichkeit, die gleichen Ergebnisse zu visualisieren, bei denen Sie auf jedem Punkt sehen, dass es sich um verschiedene Stichproben handelt, die durch zwei Gruppen getrennt sind.Um die Funktionalanalyse durchzuführen, verwenden wir das Enrichr-Tool. Dazu müssen Sie die Liste der Gene auswählen, die differentiell exprimiert wurden, entweder hoch- oder herunterreguliert, und sie als Input-Genliste im Enrichr-Tool verwenden. Sie werden sehen, dass es verschiedene Registerkarten gibt.Alle Ergebnisse können auch auf Ihren lokalen Computer heruntergeladen werden. Die Computerumgebung für die Transkriptomanalyse wurde auf der Docker-Plattform platziert. Dieser Ansatz ermöglicht es Benutzern ohne vorherige Erfahrung mit dem Linux-System, ein Terminal zu verwenden.In diesem Container gibt es eine vordefinierte Ordnerstruktur für Datensätze und Skripte, die für die gesamte Analyse notwendig sind. In der Pipeline werden die Nutzer Bluttranskriptomdaten von 20 gesunden Personen und 39 Patienten verwenden, die akut mit dem Chikungunya-Virus infiziert sind. Die Sequenzierungsplattform liefert einen Satz von FASTQ-Dateien, die die DNA-Sequenz enthalten, d.h.die Lesevorgänge und die zugehörige Qualität für jede Nukleotidbase. Die Phred-Qualitätsskala gibt die Wahrscheinlichkeit eines falschen Messwerts für jede Basis an. Tools identifizieren und entfernen Lesevorgänge von geringer Qualität aus Stichproben und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Zuordnung von Lesevorgängen.In diesem Schritt wird das Mapping-Modul, die wiederhergestellten hochwertigen Lesevorgänge, als Eingaben verwendet, um sie mit dem menschlichen Referenzgenom abzugleichen. CEMiTool identifiziert und analysiert Co-Expression-Module. Gene innerhalb desselben Moduls werden koexprimiert, was bedeutet, dass sie ähnliche Expressionsmuster in den Proben der Datensätze aufweisen.Die Netzwerkanalyse liefert Informationen über die am stärksten vernetzten Gene, also die Hubs. Die Namen dieser Gene werden im Netzwerk angezeigt.Die Größe der Knoten ist proportional zu ihrem Konnektivitätsgrad. Die Ergebnisse der DEG-Analyse wurden in den Vulkanparzellen zusammengefasst. Die Analyse des molekularen Störungsgrades ermöglicht die Identifizierung gestörter Proben von gesunden und infizierten Personen.MDP schlägt vor, welche Proben potenzielle biologische Ausreißer sind. Das Entfernen dieser Proben wirkt sich auf die nachgelagerten Ergebnisse aus. Eine funktionelle Anreicherungsanalyse mit AURA kann mit dem Enrichr-Tool durchgeführt werden.Diese Schritte helfen, die Ergebnisse zu interpretieren, indem sie gemeinsame funktionelle Rollen mehrerer Gene aufdecken, die unterschiedlich exprimiert wurden. Der biologische Prozess, der in den Balkendiagrammen dargestellt ist, sind die Top 10 angereicherten Gensätze basierend auf ihrem p-Wert-Ranking. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Protokolle alle Schritte der RNA-Seq-Analyse abdecken.Die Pipeline wurde entwickelt und in das nicht-kommerzielle System Namens Docker gekapselt. Auf einem Bild und für die wissenschaftliche Gemeinschaft zur Verfügung gestellt. Aufgrund des Containersystems befinden sich alle Skripte und Tools in der gleichen spezifischen Version, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.Darüber hinaus wurden Teile der bioinformatischen Analyse über kostenlose benutzerfreundliche Web-Tools durchgeführt.

Research

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Forschung

Immunologie und Infektion

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