Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN ממומן על ידי FAPESP (מספרי מענקים: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5, ו-2013/08216-2) ו-CNPq (313662/2017-7).
אנו מודים במיוחד על המענקים הבאים לעמיתים: ANAG (תהליך FAPESP 2019/13880-5), VEM (תהליך FAPESP 2019/16418-0), IMSC (תהליך FAPESP 2020/05284-0), APV (תהליך FAPESP 2019/27146-1) ו- RLTO (תהליך CNPq 134204/2019-0).

הדגימות המשמשות בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדות האתיקה הן מהמחלקה למיקרוביולוגיה של המכון למדעי הביו-רפואה באוניברסיטת סאו פאולו והן מהאוניברסיטה הפדרלית של סרג'יפה (פרוטוקולים: 54937216.5.0000.5467 ו- 54835916.2.0000.5546, בהתאמה).
1. התקנת שולחן עבודה של Docker
הערה: השלב...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

הכנת ספריות הרצף היא צעד מכריע לקראת מענה על שאלות ביולוגיות בצורה הטובה ביותר. סוג התמלילים שמעניינים את המחקר ינחה איזה סוג של ספריית רצף ייבחר ויניע ניתוחים ביואינפורמטיים. לדוגמה, מתוך רצף של פתוגן ואינטראקציה מארח, על פי סוג הרצף, ניתן לזהות רצפים משניהם או רק מן התמלילים המארח.
<p clas...

Arboviruses, כגון דנגי, קדחת צהובה, chikungunya, וזיקה, היו קשורים באופן נרחב עם מספר התפרצויות אנדמיות התגלו כאחד הפתוגנים העיקריים האחראים להדביק בני אדם בעשורים האחרונים1,2. אנשים נגועים בנגיף chikungunya (CHIKV) לעתים קרובות יש חום, כאב ראש, פריחה, polyarthralgia, דלקת פרקים3,4,5. וירוסים יכולים לחתור תחת ביטוי הגנים של התא ולהשפיע על מסלולי איתות מארח שונים. לאחרונה, מחקרי תמלול דם השתמשו RNA-seq כדי לזהות את הגנים המובעים דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים זיהום CHIKV חריף בהשוואה הבראה6 או פקדים בריאים7. לילדים נגועים CHIKV היו גנים מוסדרים המעורבים בחסינות מולדת, כגון אלה הקשורים לחיישנים סלולריים עבור RNA ויראלי, איתות JAK / STAT, ומסלולי איתות קולטן דמוי אגרה6. מבוגרים שנדבקו באופן חריף ב- CHIKV הראו גם אינדוקציה של גנים הקשורים לחסינות מולדת, כגון אלה הקשורים למונוציטים והפעלת תאים דנדריטיים, ולתגובות אנטי ויראליות7. מסלולי האיתות המועשרים בגנים מווסתים כלפי מטה כללו את אלה הקשורים לחסינות אדפטיבית, כגון הפעלת תאי T ובידול והעשרה בתאי T ו- B7.
ניתן להשתמש במספר שיטות לניתוח נתוני שעתוק של גנים מארחים ופתוגנים. לעתים קרובות, הכנת ספריית RNA-seq מתחילה בהעשרה של תמלילי פולי-A בוגרים. שלב זה מסיר את רוב הרנ"א ריבוזומלי (rRNA) ובחלק מהמקרים RNAs ויראלי/חיידקי. עם זאת, כאשר השאלה הביולוגית כוללת את זיהוי תעתיק הפתוגן ו- RNA רצפים ללא תלות בבחירה הקודמת, ניתן היה לזהות תמלילים רבים ושונים אחרים על ידי רצף. לדוגמה, mRNAs תת-גנומי הוכחו כגורם חשוב כדי לאמת את חומרת המחלות8. בנוסף, עבור וירוסים מסוימים כגון CHIKV ו SARS-CoV-2, אפילו ספריות מועשרות poly-A ליצור קריאות ויראליות שניתן להשתמש בהם ניתוחים במורד הזרם9,10. כאשר מתמקדים בניתוח התמלול המארח, חוקרים יכולים לחקור את ההסתבות הביולוגית על פני דגימות, לזהות גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי ומסלולים מועשרים, וליצור מודולי ביטוי משותף7,11,12. פרוטוקול זה מדגיש ניתוחי תמלול של חולים נגועים ב-CHIKV ואנשים בריאים המשתמשים בגישות ביו-אינפורמטיות שונות (איור 1A). נתונים ממחקר שפורסם בעבר7 המורכב מ -20 אנשים בריאים ו -39 נדבקים בחריפות שימשו כדי להפיק את התוצאות הייצוגיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

פתוגנים יכולים לגרום למגוון רחב של מחלות זיהומיות. התהליכים הביולוגיים הנגרמים על ידי המארח בתגובה לזיהום קובעים את חומרת המחלה. כדי לחקור תהליכים כאלה, חוקרים יכולים להשתמש בטכניקות ריצוף תפוקה גבוהה (RNA-seq) המודדות את השינויים הדינמיים של התמלול המארח בשלבים שונים של זיהום, תוצאות קליניות או חומרת המחלה. חקירה זו יכולה להוביל להבנה טובה יותר של המחלות, כמו גם לחשוף מטרות וטיפולים תרופתיים פוטנציאליים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי. הצינור מחולק לחמישה שלבים: (1) בקרת איכות של הנתונים; (2) מיפוי וביאור של גנים; (3) ניתוח סטטיסטי לזיהוי גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי וגנים משותפים; (4) קביעת המידה המולקולרית של ההסתבכויות של דגימות; וניתוח פונקציונלי (5). שלב 1 מסיר ממצאים טכניים שעשויים להשפיע על איכות הניתוחים במורד הזרם. בשלב 2, גנים ממופים ומביאים ביאורים בהתאם לפרוטוקולי הספרייה הסטנדרטיים. הניתוח הסטטיסטי בשלב 3 מזהה גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי או באים לידי ביטוי בדגימות נגועות, בהשוואה לגנים שאינם נגועים. שונות מדגם ונוכחות של חריגים ביולוגיים פוטנציאליים מאומתים באמצעות מידת הגישה המולקולרית של perturbation בשלב 4. לבסוף, הניתוח התפקודי בשלב 5 חושף את המסלולים הקשורים פנוטיפ המחלה. הצינור המוצג נועד לתמוך לחוקרים באמצעות ניתוח נתוני RNA-seq ממחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן ולהניע ניסויים עתידיים במבחנה או ב- vivo , החיוניים להבנת המנגנון המולקולרי של זיהומים.

סביבת המחשוב עבור ניתוחי תמלול נוצרה ומוגדרת בפלטפורמת Docker. גישה זו מאפשרת למשתמשי לינוקס מתחילים להשתמש במערכות מסופים של לינוקס ללא ידע ניהולי קודם. פלטפורמת Docker משתמשת במשאבים של מערכת ההפעלה המארחת כדי ליצור גורם מכיל של שירות הכולל כלים של משתמשים ספציפיים (איור 1B). מ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני תמלול ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי, כולל בקרת איכות וצעדי עיבוד מראש לגישות אנליטיות סטטיסטיות מתקדמות.

ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

ברוכים הבאים לפרוטוקול של ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן. פרוטוקול זה מחולק בשלבים הבאים. בקרת איכות לסינון קריאות באיכות נמוכה וגם להסרת רצפי מתאם רצף וביאורים, היכן עליך למפות את הקריאות לגנומי ייחוס ולהכניס את הקריאות לגנים.ניתוח סטטיסטי וביטוי משותף, המגדיר את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי ומוצא גם את מודולי הביטוי המשותף. דרגה מולקולרית של ניתוח שיבוש כדי למצוא דגימות חריגות פוטנציאליות. ולבסוף, הניתוח התפקודי כדי לקבוע את הפונקציות הביולוגיות של גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי.כל הכלים המשתמשים בצנרתות אלה הותקנו מראש במערכת לינוקס ונאספו לתוך מיכל Docker. הדגימות המשתמשות בפרוטוקולים אלה נגזרות ממאמר שפורסם על ידי הקבוצה שלנו בפתוגן PLOS. הדגימות כוללות 20 אנשים בריאים ו -39 חולים נגועים בנגיף Chikungunya.דגימות הדם נאספו, ורצף RNA בוצע. כדי להתקין את Docker במערכת Windows, עליך לבצע שלבים אלה. עבור אל דף האינטרנט הרשמי של Docker ולחץ על התחל בעבודה.מצא את המתקין עבור שולחן העבודה של Docker עבור חלונות. הורד את הקובץ. התקן באופן מקומי במחשב שלך.ודא ששתי אפשרויות אלה מסומנות. לאחר התקנת התוכנית, מוריד את התמונה Docker עבור פרוטוקול זה. עבור אל מסוף Windows.בצע את הפקודות כדי להוריד את התמונה. לאחר הורדת התמונה, אתה יכול לראות את הקובץ בשולחן העבודה Docker, ומתמונת זו, אנו יכולים ליזום את הגורם המכיל. לאחר שתלחץ על הלחצן העגול, עליך להרחיב את הפרמטרים והאפשרויות המקוריים כדי להגדיר את שם הגורם המכיל ולשייך תיקיה במחשב המקומי שלך לתיקיה בתוך Docker.לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי לאתחל את הגורם המכיל. לאחר מכן תוכל לגשת למסוף, שנמצא במערכת לינוקס בתוך Docker. הקלד את פקודות bash ולאחר מכן באפשרותך לבצע את כל הפקודות של פרוטוקול זה.ראשית, אנחנו צריכים לבצע את המקור כדי להפוך את כל הכלים של פרוטוקול זה זמין. עליך לגשת לקבצי ה- Script של הספריות. כדי לבצע ניתוח תמלול, עליך להוריד תחילה את גנום הייחוס.כדי לבצע את הפקודות הבאות. לאחר הורדת הגנום, עליך להוריד את הביאורים של הגנים. כדי לעשות זאת, עליך להקליד את הפקודות הבאות.לאחר מכן, עליך להגדיר את fastq-dump. פעולה זו מאפשרת לך להוריד את קבצי הרצף של הדוגמאות. לאחר הקלדת הפקודות הבאות, עליך להשתמש בלחצן Tab כדי לעבור לאפשרות כלים ולסמן את ספריית הנוכחים של האפשרויות.השתמש בלחצני Tab כדי לשמור ולאחר מכן אישור. ואז לצאת מהכלי מהיר-dump. עכשיו אנחנו יכולים ליזום את ההורדות של הקריאות על ידי הקלדת הפקודות הבאות.בקרת האיכות מורכבת ומעריכה באופן גרפי את ההסתברות לשגיאות בקריאה של הריצוף. בשלב זה, עליך גם להסיר את הרצפים הטכניים כגון מתאמים. כדי ליצור את תרשימי בקרת האיכות, עליך להפעיל את תוכנית FastQC.כדי להסיר את רצפי המתאם ואת הרצפים באיכות נמוכה, עליך להקליד את הפקודות הבאות. עם הקריאות באיכות טובה, אנחנו צריכים עכשיו למפות את הקריאות לגנום הייחוס. לאחר המיפוי, נצטרך להוסיף ביאורים לגנים על פי הגנים האנושיים ואז לספור את מספר הקריאות התואמות לכל גן אנושי.השלב הראשון הוא ליצור אינדקס של גנום הייחוס על-ידי הקלדת הפקודה הבאה. ואז אנחנו מקלידים את הפקודות האלה כדי למפות את הקריאות לגנום האנושי. לאחר מכן, עליך להפעיל את קבצי ה- Script המביאים את הקריאות.לאחר מיפוי וביאור, באפשרותך לבצע את ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המורכב מלמצוא את הגנים שהביטוי שלהם גבוה או נמוך יותר בקבוצה אחת בהשוואה לאחרת. כדי לזהות את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי, או DEGs, עליך להפעיל את הפקודות הבאות. לאחר מכן, באפשרותך להעביר את תוצאות הנתונים מה- Docker למחשב המקומי שלך.לקבלת זאת, עבור אל המסוף והקלד את הפקודות הבאות כדי לשמור את כל התוצאות בתיקיה מקומית. כדי לבצע את הניתוח הנותר, עליך גם להעתיק את כל הקבצים של נתוני הספריה לספריה במחשב המקומי שלך. במחשב המקומי שלך, תוכל לראות את הספריות שבהן שמרת את הנתונים מ- Docker.כפי שאתה יכול לראות, אתה יכול לגשת לכל הספריות. באפשרותך גם לפתוח את קובץ ה- HTML המכיל את דוחות בקרת האיכות. באפשרותך גם לגשת לספריה המכילה את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי.ובתוך הספריה הזו, תמצאו את חלקות הר הגעש שבהן תוכלו לראות את הגנים שנמצאים למעלה או מוזנחים בקבוצה אחת לעומת אחרת, במקרה זה, חולים נגועים בנגיף צ'יקונגוניה לעומת בקרות בריאות. כל השלבים הנותרים של פרוטוקול זה יבוצעו בכלי אינטרנט באמצעות הדפדפן שלך. בואו נתחיל קודם עם CEMiTool.עבור אל הדפדפן והקלד את הכתובת הבאה. CEMiTool מזהה מודולי ביטוי משותף מתוך ערכות נתונים של ביטוי המסופקים על-ידי המשתמשים. בדף הראשי, באפשרותך לעבור לתפריט וללחוץ על הלחצן הפעל.פעולה זו תפתח דף חדש שבו תוכל להעלות את קובץ הביטוי. קובץ זה נמצא בנתוני הספריות של המחשב המקומי שלך. אתה תראה שיש שלושה קבצי ביטוי, וזה שאנחנו הולכים להשתמש עבור CEMiTool הוא נורמליזציה שיחה tmm.אז אתה צריך לבחור את קובץ פנודטה, אותו הדבר עבור הקובץ המכיל את אינטראקציות חלבון-חלבון, ולבסוף, להעלות את הקובץ המכיל את ערכות הגנים או מסלולים. קובץ ערכות הגנים מאפשר ל- CEMiTool לבצע ניתוח העשרה עבור כל אחד ממודול הביטוי המשותף. לאחר מכן, עליך להרחיב את מקטע הפרמטרים וללחוץ תחת החל VST.לאחר מכן, אתה יכול פשוט ללחוץ על הפעל CEMiTool. לאחר הפעלת CEMiTool, תראה שזוהו 12 מודולי ביטוי משותף. על ידי לחיצה כאן, אתה יכול להוריד את כל התוצאות של ניתוחים אלה.כלי נוסף שאנחנו הולכים להשתמש בפרוטוקול זה הוא MDP, או דרגה מולקולרית של Perturbation. פשוט הקלד את הדפדפן שלך mdp.sysbio.tools. MDP מחשב את המרחק המולקולרי של כל מדגם בהשוואה לקבוצת התייחסות של דגימות, במקרה זה, את הפקדים הבריאים, על מנת למצוא לא רק חריגים פוטנציאליים אלא גם עד כמה מוטרדים כל דגימות בהשוואה לקבוצה זו.בדף 'הפעלה', באפשרותך פשוט להעלות את קובץ הביטוי על-ידי לחיצה על הלחצן ובחירת הקובץ. אז אתה צריך להעלות את קובץ פנודטה. לאחר מכן עליך להגדיר איזו עמודה מכילה את המידע אודות הקבוצה או המחלקה ולאחר מכן איזו מחלקה או קבוצה תואמות לקבוצת הביקורת.אחרי זה, אתה יכול פשוט להפעיל MDP. גרף העמודות מציג עבור כל אחת מהדגימות כסרגל את הציון של דרגה מולקולרית של שיבוש, והצבעים מייצגים את הקבוצות השונות. והתוויה של התיבה היא דרך נוספת לדמיין את אותן תוצאות שבהן רואים בכל נקודות את הדגימות השונות בנפרד משתי קבוצות.כדי לבצע את הניתוח הפונקציונלי, אנחנו הולכים להשתמש בכלי מעשיר. בשביל זה, אתה צריך לבחור את רשימת הגנים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, למעלה או downregulated, ולהשתמש בו כרשימת גנים קלט בכלי מעשיר. תראה שקיימות כרטיסיות שונות.ניתן גם להוריד את כל התוצאות למחשב המקומי שלך. סביבת המחשב לניתוח תמלול הוצבה על פלטפורמת Docker. גישה זו מאפשרת למשתמשים ללא ניסיון קודם עם מערכת לינוקס להשתמש במסוף.בגורם מכיל זה, קיים מבנה תיקיות מוגדר מראש עבור ערכת נתונים וקבצי Script הנחוצים לכל הניתוח. בצנרת, משתמשים ישתמשו בנתוני תמלול הדם מ -20 אנשים בריאים ו -39 חולים נגועים בחריפות בנגיף Chikungunya. פלטפורמת הרצף מחזירה קבוצה של קבצי FASTQ המכילים את רצף ה- DNA, כלומר.הקריאות, והאיכות המשויכת לכל בסיס נוקלאוטיד. סולם האיכות Phred מציין את ההסתברות לקריאה שגויה עבור כל בסיס. כלים מזהים ומסירים קריאות באיכות נמוכה מדגימות ומגדילים את ההסתברות למיפוי קריאות.בשלב זה, מודול המיפוי, קריאות באיכות גבוהה התאושש משמשים תשומות כדי ליישר אותם נגד הגנום התייחסות אנושי. CEMiTool מזהה ומנתח מודולי ביטוי משותף. גנים בתוך אותו מודול באים לידי ביטוי משותף, מה שאומר שהם מציגים דפוסי ביטוי דומים על פני הדגימות של ערכות הנתונים.ניתוח הרשת מספק מידע על הגנים המחוברים ביותר, כלומר הרכזות. שמות הגנים האלה מוצגים ברשת.גודל הצמתים הוא פרופורציונלי במידת הקישוריות שלו. התוצאות שהתקבלו מניתוח DEG סוכמו בחלקות הר הגעש. ניתוח מידת ההסתעפות המולקולרית מאפשר זיהוי של דגימות מוטרדות מאנשים בריאים ונגועים.MDP מציע אילו דגימות הן חריגות ביולוגיות פוטנציאליות. הסרת דגימות אלה תשפיע על התוצאות במורד הזרם. ניתוח העשרה פונקציונלי באמצעות AURA יכול להתבצע באמצעות הכלי Enrichr.שלבים אלה מסייעים לפרש את התוצאות על ידי חשיפת תפקידים פונקציונליים נפוצים של מספר גנים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. התהליך הביולוגי המוצג בתרשימי העמודות הם עשרת ערכות הגנים המועשרות המובילות בהתבסס על דירוג ערך ה- p שלהם. לסיכום, פרוטוקולים אלה מכסים את כל השלבים של ניתוח RNA-Seq.הצינור פותח ועטוף במערכת הלא מסחרית בשם Docker. על תמונה וזמין עבור הקהילה המדעית. בשל מערכת הגורם המכיל, כל קבצי ה- Script והכלים נמצאים תחת אותה גירסה ספציפית כדי להבטיח שכפול.יתר על כן, חלקים מניתוח הביו-אינפורמטיקה בוצעו באמצעות כלי אינטרנט ידידותיים למשתמש בחינם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...