Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN è finanziato da FAPESP (numeri di sovvenzione: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 e 2013/08216-2) e CNPq (313662/2017-7).
Siamo particolarmente grati alle seguenti sovvenzioni per i borsisti: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) e, RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati approvati dai comitati etici sia del Dipartimento di Microbiologia dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo che dell'Università Federale di Sergipe (Protocolli: 54937216.5.0000.5467 e 54835916.2.0000.5546, rispettivamente).
1. Installazione desktop Docker
NOTA: i passaggi per preparare l'ambiente Docker sono diversi tra i sistemi operativi (OS). Pertanto, gli utenti Mac de...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

La preparazione delle librerie di sequenziamento è un passo cruciale per rispondere alle domande biologiche nel miglior modo possibile. Il tipo di trascrizioni di interesse dello studio guiderà quale tipo di libreria di sequenziamento sarà scelta e guiderà le analisi bioinformatiche. Ad esempio, dal sequenziamento di un agente patogeno e dell'interazione ospite, in base al tipo di sequenziamento, è possibile identificare sequenze da entrambi o solo dai trascritti dell'ospite.
Le apparecch...

Gli arbovirus, come la dengue, la febbre gialla, la chikungunya e la zika, sono stati ampiamente associati a diversi focolai endemici e sono emersi come uno dei principali agenti patogeni responsabili dell'infezione umana negli ultimi decenni1,2. Gli individui infettati dal virus chikungunya (CHIKV) hanno spesso febbre, mal di testa, eruzione cutanea, poliartralgia e artrite3,4,5. I virus possono sovvertire l'espressione genica della cellula e influenzare varie vie di segnalazione dell'ospite. Recentemente, gli studi sul trascrittoma del sangue hanno utilizzato RNA-seq per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) associati all'infezione acuta da CHIKV rispetto alla convalescenza6 o ai controlli sani7. I bambini infetti da CHIKV avevano geni up-regolati che sono coinvolti nell'immunità innata, come quelli relativi ai sensori cellulari per l'RNA virale, la segnalazione JAK / STAT e le vie di segnalazione del recettore toll-like6. Gli adulti acutamente infettati da CHIKV hanno anche mostrato l'induzione di geni correlati all'immunità innata, come quelli correlati ai monociti e all'attivazione delle cellule dendritiche, e alle risposte antivirali7. Le vie di segnalazione arricchite con geni down-regolati includevano quelle relative all'immunità adattativa, come l'attivazione e la differenziazione e l'arricchimento delle cellule T nelle cellule T e B7.
Diversi metodi possono essere utilizzati per analizzare i dati del trascrittoma dei geni dell'ospite e del patogeno. Spesso, la preparazione della libreria RNA-seq inizia con l'arricchimento di trascritti poli-A maturi. Questo passaggio rimuove la maggior parte dell'RNA ribosomiale (rRNA) e in alcuni casi gli RNA virali / batterici. Tuttavia, quando la questione biologica coinvolge il rilevamento del trascritto patogeno e l'RNA viene sequenziato indipendentemente dalla selezione precedente, molti altri trascritti diversi potrebbero essere rilevati mediante sequenziamento. Ad esempio, gli mRNA subgenomici hanno dimostrato di essere un fattore importante per verificare la gravità delle malattie8. Inoltre, per alcuni virus come CHIKV e SARS-CoV-2, anche le librerie arricchite di poly-A generano letture virali che possono essere utilizzate nelle analisi a valle9,10. Quando si concentrano sull'analisi del trascrittoma dell'ospite, i ricercatori possono studiare la perturbazione biologica tra i campioni, identificare geni differenzialmente espressi e percorsi arricchiti e generare moduli di co-espressione7,11,12. Questo protocollo evidenzia le analisi del trascrittoma di pazienti con infezione da CHIKV e individui sani utilizzando diversi approcci bioinformatici (Figura 1A). I dati di uno studio precedentemente pubblicato7 composto da 20 individui sani e 39 CHIKV acutamente infetti sono stati utilizzati per generare i risultati rappresentativi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Gli agenti patogeni possono causare un'ampia varietà di malattie infettive. I processi biologici indotti dall'ospite in risposta all'infezione determinano la gravità della malattia. Per studiare tali processi, i ricercatori possono utilizzare tecniche di sequenziamento ad alto rendimento (RNA-seq) che misurano i cambiamenti dinamici del trascrittoma dell'ospite in diverse fasi dell'infezione, esiti clinici o gravità della malattia. Questa indagine può portare a una migliore comprensione delle malattie, oltre a scoprire potenziali bersagli e trattamenti farmacologici. Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale. La pipeline è suddivisa in cinque fasi: (1) controllo di qualità dei dati; (2) mappatura e annotazione dei geni; (3) analisi statistica per identificare geni differenzialmente espressi e geni co-espressi; (4) determinazione del grado molecolare della perturbazione dei campioni; e (5) analisi funzionale. Il passaggio 1 rimuove gli elementi tecnici che potrebbero influire sulla qualità delle analisi a valle. Nel passaggio 2, i geni vengono mappati e annotati secondo i protocolli standard della libreria. L'analisi statistica nella fase 3 identifica i geni che sono differenzialmente espressi o co-espressi in campioni infetti, rispetto a quelli non infetti. La variabilità del campione e la presenza di potenziali valori anomali biologici sono verificate utilizzando l'approccio del grado molecolare di perturbazione nella fase 4. Infine, l'analisi funzionale nella fase 5 rivela i percorsi associati al fenotipo della malattia. La pipeline presentata mira a supportare i ricercatori attraverso l'analisi dei dati RNA-seq da studi di interazione ospite-patogeno e guidare futuri esperimenti in vitro o in vivo , che sono essenziali per comprendere il meccanismo molecolare delle infezioni.

L'ambiente di calcolo per le analisi del trascrittoma è stato creato e configurato sulla piattaforma Docker. Questo approccio consente agli utenti Linux principianti di utilizzare sistemi terminali Linux senza conoscenze di gestione a priori. La piattaforma Docker utilizza le risorse del sistema operativo host per creare un contenitore di servizi che include strumenti specifici per gli utenti (Figura 1B). È stato creato un contenitore basato sulla distribuzione Ubuntu 20.04 del sistema ope...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati del trascrittoma di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale, compresi i passaggi di controllo della qualità e pre-elaborazione per approcci analitici statistici avanzati.

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Benvenuti nel protocollo di analisi del trascrittoma ad alto rendimento per studiare le interazioni ospite-patogeno. Questo protocollo è suddiviso nei seguenti passaggi. Controllo di qualità per filtrare le letture di bassa qualità e anche per rimuovere le sequenze dell'adattatore Sequenziamento e annotazioni, dove sono necessari mappare le letture in un genoma di riferimento e annotare le letture nei geni.Analisi statistica e di co-espressione, che definisce i geni differenzialmente espressi e trova anche i moduli di co-espressione. Grado molecolare di analisi delle perturbazioni per trovare potenziali campioni anomali. E infine, l'analisi funzionale per determinare le funzioni biologiche dei geni differenzialmente espressi.Tutti gli strumenti che utilizzano queste pipeline sono stati preinstallati in un sistema Linux e incapsulati in un contenitore Docker. I campioni che utilizzano questi protocolli derivano da un articolo pubblicato dal nostro gruppo in PLOS Pathogen. I campioni comprendono 20 persone sane e 39 pazienti infetti dal virus Chikungunya.I campioni di sangue sono stati raccolti ed è stato eseguito il sequenziamento dell'RNA. Per installare Docker nel sistema Windows, è necessario seguire questi passaggi. Vai alla pagina Web ufficiale di Docker e fai clic su Inizia.Trova il programma di installazione per Docker Desktop per Windows. Scarica il file. Installare localmente nel computer.Assicurati che queste due opzioni siano contrassegnate. Dopo aver installato il programma, scarica l'immagine Docker per questo protocollo. Vai al terminale di Windows.Eseguire i comandi per scaricare l'immagine. Dopo aver scaricato l'immagine, puoi vedere il file nel desktop Docker e da questa immagine possiamo avviare il contenitore. Dopo aver fatto clic sul pulsante di arrotondamento, è necessario espandere i parametri e le opzioni originali per definire il nome del contenitore e associare una cartella nel computer locale alla cartella all'interno di Docker.Successivamente, fare clic su Esegui per avviare il contenitore. È quindi possibile accedere al terminale, che si trova nel sistema Linux all'interno del Docker. Digitare i comandi bash e quindi è possibile eseguire tutti i comandi di questo protocollo.Innanzitutto, dobbiamo eseguire il sorgente per rendere disponibili tutti gli strumenti di questo protocollo. È necessario accedere agli script di directory. Per eseguire un'analisi trascrittomica, è necessario scaricare prima il genoma di riferimento.Per questo, è necessario eseguire i seguenti comandi. Dopo aver scaricato il genoma, è necessario scaricare l'annotazione dei geni. Per fare ciò, è necessario digitare i seguenti comandi.Successivamente, è necessario configurare il fastq-dump. Questo consente di scaricare i file di sequenziazione degli esempi. Dopo aver digitato i seguenti comandi, è necessario utilizzare il pulsante Tab per andare all'opzione Strumenti e contrassegnare la directory delle opzioni correnti.Utilizzare i pulsanti TAB per salvare, quindi OK. E quindi uscire dallo strumento fastq-dump. Ora possiamo avviare i download delle letture digitando i seguenti comandi.Il controllo qualità consiste e valuta graficamente la probabilità di errori nelle letture di sequenziamento. In questo passaggio, è necessario rimuovere anche le sequenze tecniche come gli adattatori. Per generare i grafici di controllo qualità, è necessario eseguire il programma FastQC.Per rimuovere le sequenze dell'adattatore e le sequenze di bassa qualità, è necessario digitare i seguenti comandi. Con le letture di buona qualità, ora dobbiamo mappare le letture nel genoma di riferimento. Dopo la mappatura, dovremo annotare i geni in base ai geni umani e quindi contare il numero di letture che corrispondono a ciascun gene umano.Il primo passo è indicizzare il genoma di riferimento digitando il seguente comando. E poi digitiamo questi comandi per mappare le letture nel genoma umano. Successivamente, è necessario eseguire gli script che annotano le letture.Dopo la mappatura e l'annotazione, è possibile eseguire l'analisi dell'espressione differenziale che consiste nel trovare i geni la cui espressione è più alta o più bassa in un gruppo rispetto ad un altro. Per identificare i geni differenzialmente espressi, o DEG, è necessario eseguire i seguenti comandi. Successivamente, è possibile trasferire i risultati dei dati dalla Finestra Mobile Mobile al computer locale.Per questo, vai al terminale e digita i seguenti comandi per salvare tutti i risultati in una cartella locale. Per eseguire l'analisi rimanente, è inoltre necessario copiare tutti i file dei dati della directory in una directory nel computer locale. Nel computer locale, sarai in grado di vedere le directory in cui hai salvato i dati da Docker.Come puoi vedere, puoi accedere a tutte le librerie. È inoltre possibile aprire il file HTML contenente i report di controllo qualità. È inoltre possibile accedere a una directory contenente i geni differenzialmente espressi.E all'interno di questa directory, troverai le trame del vulcano in cui puoi vedere i geni che sono su o giù regolati in un gruppo rispetto a un altro, in questo caso, pazienti infetti da virus Chikungunya contro controlli sani. Tutti i passaggi rimanenti di questo protocollo verranno eseguiti in strumenti Web utilizzando il browser. Iniziamo prima con CEMiTool.Vai al browser e digita il seguente indirizzo. CEMiTool identifica i moduli di co-espressione dai set di dati di espressione forniti dagli utenti. Nella pagina principale, puoi andare al menu e fare clic sul pulsante Esegui.Si aprirà una nuova pagina in cui è possibile caricare il file di espressione. Questo file si trova nei dati della directory del computer locale. Vedrai che ci sono tre file di espressione e quello che useremo per CEMiTool è una chiamata di normalizzazione tmm.Quindi devi selezionare il file fenodata, la stessa cosa per il file contenente le interazioni proteina-proteina e, infine, caricare il file contenente i set di geni o i percorsi. Il file dei set genetici consente a CEMiTool di eseguire analisi di arricchimento per ciascuno dei moduli di co-espressione. Successivamente, è necessario espandere la sezione dei parametri e fare clic su Applica VST.Successivamente, puoi semplicemente fare clic su Esegui CEMiTool. Dopo aver eseguito CEMiTool, si vedrà che sono stati identificati 12 moduli di coespressione. Cliccando qui, è possibile scaricare tutti i risultati di queste analisi.Un altro strumento che utilizzeremo in questo protocollo è MDP, o Grado molecolare di perturbazione. Basta digitare nel browser mdp.sysbio.tools. MDP calcola la distanza molecolare di ciascun campione rispetto a un gruppo di riferimento di campioni, in questo caso i controlli sani, al fine di trovare non solo potenziali valori anomali ma anche quanto sono perturbati ciascun campione rispetto a questo gruppo.Nella pagina Esegui, è sufficiente caricare il file di espressione facendo clic sul pulsante e selezionando il file. Quindi devi caricare il file phenodata. Quindi è necessario definire quale colonna contiene le informazioni sul gruppo o sulla classe e quindi quale classe o gruppo corrisponde al gruppo di controllo.Dopo questo, puoi semplicemente eseguire MDP. Il grafico a barre mostra per ciascuno dei campioni come una barra il punteggio del grado molecolare di perturbazione e i colori rappresentano i diversi gruppi. E il box plot è un altro modo di visualizzare gli stessi risultati in cui si vede su ogni punto il è un campione diverso separato da due gruppi.Per eseguire l'analisi funzionale, useremo lo strumento Enrichr. Per questo, è necessario selezionare l'elenco dei geni che sono stati espressi in modo differenziale, su o giù, e usarlo come elenco di geni di input nello strumento Enrichr. Vedrai che ci sono diverse schede.Tutti i risultati possono anche essere scaricati sul computer locale. L'ambiente informatico per l'analisi del trascrittoma è stato inserito sulla piattaforma Docker. Questo approccio consente agli utenti senza precedenti esperienze con il sistema Linux di utilizzare un terminale.In questo contenitore, c'è una struttura di cartelle predefinita per set di dati e script che sono necessari per tutta l'analisi. In cantiere, gli utenti utilizzeranno i dati del trascrittoma del sangue di 20 individui sani e 39 pazienti acutamente infetti dal virus Chikungunya. La piattaforma di sequenziamento restituisce un set di file FASTQ contenenti la sequenza del DNA, ovverole letture e la qualità associata per ciascuna base nucleotidica. La scala di qualità Phred indica la probabilità di una lettura errata per ogni base. Gli strumenti identificano e rimuovono le letture di bassa qualità dai campioni e aumentano la probabilità di mapping delle letture.In questa fase, il modulo di mappatura, le letture di alta qualità recuperate vengono utilizzate come input per allinearle al genoma umano di riferimento. CEMiTool identifica e analizza i moduli di co-espressione. I geni all'interno dello stesso modulo sono co-espressi, il che significa che mostrano modelli di espressione simili tra i campioni dei set di dati.L'analisi della rete fornisce informazioni sui geni più connessi, ovvero gli hub. I nomi di questi geni sono mostrati nella rete.La dimensione dei nodi è proporzionale al suo grado di connettività. I risultati ottenuti dall'analisi DEG sono stati riassunti nei grafici del vulcano. L'analisi del grado molecolare di perturbazione permette l'identificazione di campioni perturbati provenienti da individui sani e infetti.MDP suggerisce quali campioni sono potenziali valori anomali biologici. La rimozione di tali campioni avrà un impatto sui risultati a valle. Un'analisi di arricchimento funzionale utilizzando AURA può essere eseguita con lo strumento Enrichr.Questi passaggi aiutano a interpretare i risultati rivelando i ruoli funzionali comuni di diversi geni che sono stati espressi in modo differenziale. Il processo biologico mostrato nei grafici a barre sono i primi 10 set di geni arricchiti in base alla loro classifica del valore p. In conclusione, questi protocolli coprono tutte le fasi dell'analisi RNA-Seq.La pipeline è stata sviluppata e incapsulata nel sistema non commerciale chiamato Docker. Su un'immagine e resa disponibile per la comunità scientifica. Grazie al sistema contenitore, tutti gli script e gli strumenti sono sotto la stessa versione specifica per garantire la riproducibilità.Inoltre, parti dell'analisi bioinformatica sono state eseguite tramite strumenti web gratuiti e di facile utilizzo.

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