Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HNはFAPESP(助成金番号:#2017/50137-3、2012/19278-6、2018/14933-2、2018/21934-5、2013/08216-2)およびCNPq(313662/2017-7)によって資金提供されています。
私たちは、フェローのための次の助成金に特に感謝しています: ANAG (FAPESPプロセス2019/13880-5), VEM (FAPESPプロセス2019/16418-0), IMSC (FAPESPプロセス2020/05284-0), APV (FAPESPプロセス2019/27146-1) RLTO (CNPq プロセス 134204/2019-0)。

このプロトコルで使用されるサンプルは、サンパウロ大学生物医学研究所の微生物学部門とセルジペ連邦大学の両方の倫理委員会によって承認されました(プロトコル:54937216.5.0000.5400.5467と54835916.2.0000.5546)。
1. Docker デスクトップのインストール
注: Docker 環境を準備する手順は、オペレーティング システム (OS) によって異なります。したが?...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

シーケンシングライブラリの準備は、可能な限り最善の方法で生物学的な質問に答えするための重要なステップです。研究の関心のあるトランスクリプトの種類は、どのシーケンシングライブラリが選択されるかの指針となり、バイオインフォマティクス分析を推進します。例えば、病原体と宿主相互作用のシーケンシングから、シーケンシングの種類に応じて、ホストトランスクリプトの?...

デング熱、黄熱病、チクングニア、ジカなどのアルボウイルスは、いくつかの流行の流行に広く関連しており、過去数十年でヒトに感染する主な病原体の1つとして出現しました1,2。チクングニアウイルス(CHIKV)に感染した人は、発熱、頭痛、発疹、ポリアルーギー、関節炎を持つことがよくあります3,4,5。ウイルスは、細胞の遺伝子発現を破壊し、様々な宿主シグナル伝達経路に影響を与える可能性があります。近年、血液転写酵素研究は、RNA-seqを利用して、回復期6または健康なコントロール7と比較して急性CHIKV感染に関連する微分発現遺伝子(DEG)を同定した。CHIKVに感染した小児は、ウイルスRNAの細胞センサー、JAK/STATシグナル伝達、TOLL様受容体シグナル伝達経路に関連するものなど、先天性免疫に関与する遺伝子を有していた。CHIKVに急性感染した成人は、単球および樹状細胞活性化に関連するもの、および抗ウイルス応答に関連するものなど、先天性免疫に関連する遺伝子の誘導も示した。ダウンレギュレーション遺伝子を豊富に含むシグナル経路には、T細胞の活性化やT細胞およびB細胞における分化および濃縮などの適応免疫に関連するものが含まれていた。
宿主および病原体遺伝子のトランスクリプトームデータを分析するために、いくつかの方法を使用することができる。多くの場合、RNA-seqライブラリー調製は成熟したポリA転写物の濃縮から始まります。このステップは、リボソームRNA(rRNA)の大部分を除去し、いくつかのケースではウイルス/細菌RNAを除去する。しかし、生物学的な質問が病原体転写物検出を伴い、RNAが以前の選択とは無関係に配列化される場合、他の多くの異なる転写物はシーケンシングによって検出され得る。例えば、サブゲノムmRNAは、疾患の重症度を確認する重要な因子であることが示されている8。さらに、CHIKVやSARS-CoV-2のような特定のウイルスに対して、ポリA濃縮ライブラリでさえ、下流の分析で利用できるウイルス読み取りを生成します9,10。宿主転写体の分析に焦点を当てると、研究者はサンプル間の生物学的摂動を調べ、微分発現された遺伝子および濃縮経路を同定し、共発現モジュール7,11,12を生成することができます。このプロトコルは、異なるバイオインフォマティクスアプローチを用いたCHIKV感染患者および健常者の転写分析を強調する(図1A)。以前に発表された研究からのデータ7は、20人の健康な人と39人のCHIKV急性感染者からなるが、代表的な結果を生成するために使用された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

病原体は、多種多様な感染症を引き起こす可能性があります。感染に応答して宿主によって誘導される生物学的プロセスは、疾患の重症度を決定する。このようなプロセスを研究するために、研究者は、感染、臨床結果、または疾患重症度の異なる段階で宿主転写体の動的変化を測定するハイスループットシーケンシング技術(RNA-seq)を使用することができます。この調査は、病気のより良い理解につながるだけでなく、潜在的な薬物標的と治療を明らかにすることができます。ここで示すプロトコルは、生の読み取りから機能解析までの RNA シーケンシング データを分析するための完全なパイプラインを記述します。パイプラインは 5 つのステップに分けられます: (1) データの品質管理;(2)遺伝子のマッピングと注釈(3)遺伝子と共発現遺伝子の遺伝子を分化して同定する統計解析(4)サンプルの摂動の分子程度の決定;(5)機能分析。手順 1 では、下流解析の品質に影響を与える可能性のある技術的なアーティファクトを削除します。ステップ2では、遺伝子は標準ライブラリプロトコルに従ってマッピングされ、また、アポイントトされます。ステップ3の統計解析では、感染していないサンプルと比較して、感染したサンプルで差で発現または共発現している遺伝子を特定します。サンプルの変動性および潜在的な生物学的外れ値の存在は、ステップ4の摂動アプローチの分子程度を使用して検証される。最後に、ステップ5の機能解析は、疾患表現型に関連する経路を明らかにする。このパイプラインは、宿主と病原体の相互作用研究によるRNA-seqデータ分析を通じて研究者を支援し、感染の分子メカニズムを理解するために不可欠なインビトロ または インビボ実験の 未来を推進することを目的としています。

トランスクリプトーム分析のコンピューティング環境は、Docker プラットフォームで作成および構成されました。このアプローチにより、初心者の Linux ユーザーは、事前管理知識を持たずに Linux 端末システムを使用できます。Docker プラットフォームは、ホスト OS のリソースを使用して、特定のユーザーのツールを含むサービス コンテナーを作成します (図 1B)。Linux OS U...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

ここで示すプロトコルは、高度な統計分析アプローチへの品質管理と前処理のステップを含む、生の読み取りから機能分析までのRNAシーケンシングトランスクリプトームデータを分析するための完全なパイプラインを説明しています。

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

宿主と病原体の相互作用を調査するためのハイスループットトランスクリプトーム分析のプロトコルへようこそ。このプロトコルは、次の手順で分かれています。品質管理は、低品質の読み取りをフィルタリングし、アダプターシーケンスのシーケンスシーケンスを削除し、注釈を削除します。統計的および共発現解析は、微分発現遺伝子を定義し、共発現モジュールを見つける。潜在的な外れ値サンプルを見つけるために摂動分析の分子程度。そして最後に、機能解析により、遺伝子の発現の生物学的機能を決定する。これらのパイプラインを利用するすべてのツールは、Linux システムにプリインストールされ、Docker コンテナーにカプセル化されています。これらのプロトコルを利用したサンプルは、当社グループがPLOS病原体で発表した論文に由来する。サンプルは、チクングニアウイルスに感染した20人の健康な人々と39人の患者で構成されています。血液サンプルを採取し、RNAシーケンシングを行った。Windows システムに Docker をインストールするには、次の手順を実行する必要があります。Docker の公式 Web ページに移動し、開始の順にクリックします。ウィンドウ用の Docker デスクトップのインストーラーを見つけます。ファイルをダウンロードします。コンピュータにローカルにインストールします。これら 2 つのオプションがマークされていることを確認します。プログラムをインストールした後、このプロトコルの Docker イメージをダウンロードします。Windows ターミナルに移動します。コマンドを実行してイメージをダウンロードします。イメージをダウンロードした後、Docker デスクトップでファイルを確認でき、このイメージからコンテナーを開始できます。丸いボタンをクリックした後、元のパラメータとオプションを展開してコンテナの名前を定義し、ローカルコンピュータのフォルダを Docker 内のフォルダに関連付ける必要があります。この後、[実行] をクリックしてコンテナーを開始します。その後、Docker 内の Linux システムにあるターミナルにアクセスできます。bash コマンドを入力すると、このプロトコルのすべてのコマンドを実行できます。まず、このプロトコルのすべてのツールを使用できるようにするために、ソースを実行する必要があります。ディレクトリ スクリプトにアクセスする必要があります。トランスクリプトーミック解析を実行するには、まず参照ゲノムをダウンロードする必要があります。このためには、次のコマンドを実行する必要があります。ゲノムをダウンロードした後、遺伝子の注釈をダウンロードする必要があります。これを行うには、次のコマンドを入力する必要があります。次に、fastq-dump を設定する必要があります。これにより、例のシーケンスファイルをダウンロードできます。次のコマンドを入力した後、Tab ボタンを使用して[ツール]オプションに移動し、オプションの現在のディレクトリにマークを付ける必要があります。[タブ] ボタンを使用して保存し、次に OK をクリックします。次に、ツール fastq-dump を終了します。次のコマンドを入力して、読み取りのダウンロードを開始できます。品質管理は、シーケンス読み込みにおけるエラーの確率をグラフィカルに構成し、評価します。このステップでは、アダプターなどの技術シーケンスも削除する必要があります。品質管理グラフを生成するには、FastQC プログラムを実行する必要があります。アダプター・シーケンスと低品質シーケンスを除去するには、以下のコマンドを入力する必要があります。良質の読み取りでは、読み取りを参照ゲノムにマッピングする必要があります。マッピングの後、我々は、ヒト遺伝子に応じて遺伝子にアポイントを付け、各ヒト遺伝子に一致する読み取り数を数える必要があります。最初のステップは、次のコマンドを入力して参照ゲノムをインデックス化することです。そして、このコマンドを入力して、読み取りをヒトゲノムにマッピングします。次に、読み取りに注意を付け込むスクリプトを実行します。マッピングとアノテーションの後、あるグループで発現が他の群と比較して高いか低い遺伝子を見つけることで構成される微分発現解析を行うことができます。遺伝子の発現を確認するには、次のコマンドを実行する必要があります。その後、データ結果を Docker からローカル コンピューターに転送できます。この場合は、ターミナルに移動し、次のコマンドを入力して、すべての結果をローカルフォルダーに保存します。残りの分析を実行するには、ディレクトリ データのすべてのファイルをローカル コンピュータのディレクトリにコピーする必要があります。ローカル コンピューターで、Docker からデータを保存したディレクトリを確認できます。ご覧のとおり、すべてのライブラリにアクセスできます。品質管理レポートを含む HTML ファイルを開くことができます。また、遺伝子の発現が微分されたディレクトリにアクセスすることもできます。そして、このディレクトリの中には、チクングニアウイルスに感染した患者と健康なコントロールに対して、あるグループと別のグループでアップまたはダウンレギュレートされている遺伝子を見ることができる火山プロットがあります。このプロトコルの残りの手順はすべて、ブラウザを使用してWebツールで実行されます。まずはCEMiToolから始めましょう。ブラウザに移動し、次のアドレスを入力します。CEMiTool は、ユーザーが提供する式データ・セットから、コ式モジュールを識別します。メインページで、メニューに移動してボタンの実行をクリックできます。これにより、式ファイルをアップロードできる新しいページが開きます。このファイルは、ローカル コンピュータのディレクトリ データに格納されています。3 つの式ファイルがあり、CEMiTool に使用する式ファイルは tmm の正規化呼び出しです。次に、フェノデータファイル、タンパク質とタンパク質の相互作用を含むファイルに対して同じものを選択し、最後に、遺伝子セットまたは経路を含むファイルをアップロードする必要があります。遺伝子セットファイルにより、CEMiToolは共発現モジュールのそれぞれについて濃縮分析を行うことができます。次に、パラメーター セクションを展開し、[VST の適用] をクリックします。その後、CEMiToolを実行をクリックするだけです。CEMiTool を実行すると、12 個の共式モジュールが識別されていることがわかります。ここをクリックすると、これらの分析のすべての結果をダウンロードすることができます。このプロトコルで使用するもう一つのツールは、MDP、または摂動の分子程度です。ブラウザ mdp.sysbio.tools を入力してください。MDPは、各サンプルの分子距離をサンプルの参照群と比較して計算し、この場合、健康なコントロールは、潜在的な外れ値だけでなく、このグループと比較して各サンプルがどのように摂動されているかを見つけるために計算します。[実行] ページでは、ボタンをクリックしてファイルを選択するだけで、式ファイルをアップロードできます。その後、フェノデータファイルをアップロードする必要があります。次に、グループまたはクラスに関する情報を含む列を定義し、その後、どのクラスまたはグループが制御グループに対応するかを定義する必要があります。この後、MDP を実行できます。棒グラフは、各サンプルの分子摂動度のスコアをバーとして示し、色は異なるグループを表します。そして、ボックスプロットは、各ドットに表示される同じ結果を視覚化する別の方法であり、2つのグループによって分離された異なるサンプルです。機能解析を実行するには、エンリッチャツールを使用します。このためには、アップまたはダウンレギュレートのいずれかで差し出した遺伝子のリストを選択し、エンリッチャーツールの入力遺伝子リストとして使用する必要があります。異なるタブがあることがわかります。すべての結果は、ローカル コンピューターにダウンロードすることもできます。トランスクリプトーム分析用のコンピューター環境は、Docker プラットフォームに配置されています。このアプローチにより、Linux システムに関する経験のないユーザーは端末を利用できます。このコンテナには、データセットとスクリプト用の定義済みのフォルダ構造があり、すべての分析に必要です。パイプラインでは、ユーザーはチクングニアウイルスに急性感染した20人の健康な個人と39人の患者からの血液トランスクリプトームデータを利用します。シーケンス処理プラットフォームは、DNA 配列を含む一連の FASTQ ファイルを返します。読み取り、および各ヌクレオチド塩基に関連する品質。Phred の品質スケールは、各ベースの誤った読み取りの確率を示します。ツールは、サンプルから低品質の読み取りを識別して削除し、読み取りのマッピングの確率を高めます。このステップでは、マッピングモジュールは、回収された高品質の読み取り値を入力として使用し、それらをヒト参照ゲノムに対して整列させる。CEMiTool は、コエクスプレッション・モジュールを識別し、分析します。同じモジュール内の遺伝子は共発現しており、データセットのサンプル全体で同様の発現パターンを示します。ネットワーク解析は、最も接続されている遺伝子、すなわちハブに関する情報を提供します。これらの遺伝子の名前はネットワークに表示されます。ノードのサイズは、接続の程度に比例します。DEG解析から得られた結果を火山プロットにまとめた。摂動の分子程度の分析は健康な、感染した個人からの摂動サンプルの識別を可能にする。MDPは、どのサンプルが潜在的な生物学的外れ値かを示唆しています。これらのサンプルを削除すると、ダウンストリームの結果に影響します。エンリッチツールを使用して、AURAを使用した機能強化分析を行うことができます。これらのステップは、差異発現したいくつかの遺伝子の共通の機能的役割を明らかにすることによって、結果を解釈するのに役立ちます。棒グラフに示されている生物学的プロセスは、p値のランク付けに基づく上位10の濃縮遺伝子セットです。結論として、これらのプロトコルはRNA-Seq分析のすべてのステップをカバーしています。パイプラインは開発され、Docker という名前の非商用システムにカプセル化されました。画像上で、科学界のために利用可能になりました。コンテナシステムにより、すべてのスクリプトとツールは、再現性を保証するために同じ特定のバージョンの下にあります。さらに、バイオインフォマティクス解析の一部を、無料の使いやすいウェブツールを介して行った。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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