Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN은 FAPESP(교부금 번호: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5, 2013/08216-2) 및 CNPq(313662/2017-7)에 의해 지원됩니다.
ANAG (FAPESP 프로세스 2019/13880-5), VEM (FAPESP 프로세스 2019/16418-0), IMSC (FAPESP 프로세스 2020/05284-0), APV (FAPESP 프로세스 2019/2019/27146) RLTO (CNPq 프로세스 134204/2019-0).

이 프로토콜에 사용된 견본은 상파울루 대학에 생물 의학 과학의 생물학과 및 세르지페의 연방 대학의 미생물학의 학과에서 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다 (의정서: 54937216.5.5.5467 및 54835916.5546, 각각).
1. Docker 데스크톱 설치
참고: Docker 환경을 준비하는 단계는 운영 체제(OS)와 다릅니다. 따라서 Mac 사용자는 1.1로 나열된 단계를 수행해야 ?...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

시퀀싱 라이브러리를 준비하는 것은 생물학적 질문에 가능한 최선의 방법으로 답변하는 중요한 단계입니다. 연구의 관심성적증명서 유형은 어떤 유형의 시퀀싱 라이브러리를 선택하고 생물정보 분석을 유도할 것인지를 안내합니다. 예를 들어, 병원체 및 숙주 상호작용의 시퀀싱으로부터, 시퀀싱의 유형에 따라, 호스트 전사체 모두에서 또는 바로 서열을 식별할 수 있다.
차?...

뎅기열, 황열병, 치쿤구냐 및 지카와 같은 Arboviruses는 여러 발병과 널리 연관되어 있으며 지난 수십 년 동안 인간을 감염시키는 주요 병원체 중 하나로 부상했습니다1,2. 치쿤구냐 바이러스(CHIKV)에 감염된 개인은 종종 발열, 두통, 발진, 폴리아르트랄기아 및 관절염3,4,5명이 있다. 바이러스는 세포의 유전자 발현을 전복시키고 각종 숙주 신호 경로에 영향을 미칠 수 있습니다. 최근에는 혈액 전사체 연구를 활용하여 급성 CHIKV 감염과 관련된 분화 유전자(DEGs)를 확인하기 위해 RNA-seq를 활용하여 회복6 또는 건강한 대조군7과 비교하여. CHIKV 감염된 아이들은 바이러스성 RNA를 위한 세포 센서와 관련되었던 것과 같은 선천적인 면역에 관여하는 up-regulated 유전자를 가지고 있었습니다, JAK/STAT 신호, 및 수신과 같은 수용체 신호 통로6. CHIKV에 급성 감염된 성인은 또한 단핵구 및 수지상 세포 활성화와 관련된 유전자와 같은 선천성 면역과 관련된 유전자의 유도를 보여주었으며, 항바이러스 반응7. 다운 조절 유전자로 농축된 신호 경로는 T 세포 활성화 및 T 및 B 세포7에 있는 분화 및 농축과 같은 적응성 면역과 관련되었던 그들 포함했습니다7.
몇몇 방법은 숙주 및 병원체 유전자의 전사 데이터를 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 종종 RNA-seq 라이브러리 준비는 성숙한 폴리-A 성적 증명서의 농축으로 시작됩니다. 이 단계는 리보솜 RNA (rRNA)의 대부분을 제거하고 일부 경우 바이러스 / 세균 RNA를 제거합니다. 그러나, 생물학적 질문이 병원체 전사 검출및 RNA가 이전 선택과 무관하게 서열화될 때, 다른 많은 성적증명서는 시퀀싱에 의해 검출될 수 있었다. 예를 들어, subgenomic mRNAs는 질병의 중증도를 확인하는 중요한 요소로 표시되었다8. 또한, CHIKV 및 SARS-CoV-2와 같은 특정 바이러스의 경우 폴리A 농축 라이브러리조차도 다운스트림 분석에서 활용할 수 있는 바이러스 판독을 생성합니다9,10. 숙주 전사의 분석에 초점을 맞출 때, 연구원은 견본을 통해 생물학 동요를 조사하고, 분화한 유전자 및 농축된 통로를 확인하고, 공동 발현 모듈7,11,12를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 생물 정보 학적 접근 방식을 사용하여 CHIKV 감염 환자 및 건강한 개인의 전사 분석을 강조 (그림 1A). 이전에 발표된 연구에서 얻은 데이터7은 20명의 건강하고 39개의 CHIKV로 구성되어 급성 감염된 개인이 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

병원균은 다양한 전염병을 일으킬 수 있습니다. 감염에 응하여 숙주에 의해 유도된 생물학적 과정은 질병의 중증도를 결정한다. 이러한 프로세스를 연구하기 위하여는, 연구원은 감염, 임상 결과, 또는 질병 엄격의 다른 단계에서 호스트 전사의 동적 변경을 측정하는 고처리량 시퀀싱 기술 (RNA-seq)를 사용할 수 있습니다. 이 조사는 질병의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다., 잠재적인 약물 목표 와 치료를 발견 뿐만 아니라. 여기에 제시된 프로토콜은 원시 읽기에서 기능 분석에 RNA 시퀀싱 데이터를 분석하는 완벽한 파이프라인을 설명합니다. 파이프라인은 데이터의 (1) 품질 관리라는 다섯 단계로 나뉩니다. (2) 유전자의 매핑 및 인장; (3) 분화 유전자 및 공동 발현 유전자를 식별하는 통계 분석; (4) 시료의 섭란의 분자 정도의 결정; 및 (5) 기능 분석. 1단계는 다운스트림 분석의 품질에 영향을 줄 수 있는 기술 아티팩트를 제거합니다. 2단계에서 유전자는 표준 라이브러리 프로토콜에 따라 매핑되고 추가됩니다. 3단계의 통계 분석은 감염된 샘플에서 분화되거나 공동 발현되는 유전자를 비감염된 샘플과 비교하여 식별합니다. 시료 가변성 및 잠재적인 생물학적 이상치의 존재는 4단계에서 의 분자 정도의 교란 접근법을 사용하여 검증된다. 마지막으로, 5단계에서의 기능적 분석은 질병 표현형과 관련된 경로를 나타낸다. 제시된 파이프라인은 숙주 병원체 상호 작용 연구에서 RNA-seq 데이터 분석을 통해 연구원을 지원하고 감염의 분자 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 시험관 또는 생체 내 실험에서 미래를 추진하는 것을 목표로 합니다.

전사 분석을 위한 컴퓨팅 환경이 Docker 플랫폼에서 만들어지고 구성되었습니다. 이 방법을 사용하면 초보자 Linux 사용자가 사전 관리 지식없이 Linux 터미널 시스템을 사용할 수 있습니다. Docker 플랫폼은 호스트 OS의 리소스를 사용하여 특정 사용자의 도구가 포함된 서비스 컨테이너(그림 1B)를 만듭니다. Linux OS 우분투 20.04 배포판을 기반으로 하는 컨테이너가 만들어졌으며, 명...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

여기에 제시된 프로토콜은 고급 통계 분석 접근법에 품질 관리 및 전처리 단계를 포함하여 원시 읽기에서 기능 분석에 RNA-시퀀싱 전사 데이터를 분석하는 완전한 파이프라인을 설명합니다.

호스트-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

숙주 병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석 의정서에 오신 것을 환영합니다. 이 프로토콜은 다음 단계로 나뉩니다. 품질 관리는 낮은 품질의 판독을 필터링하고 또한 어댑터 서열 시퀀싱 및 주석을 제거하기 위해, 당신은 참조 게놈으로 판독을 매핑하고 유전자에 읽기를 주석해야합니다.분화유전자를 정의하고 또한 공동 발현 모듈을 찾아낸 통계 및 공동 발현 분석. 잠재적 인 이상치 샘플을 찾기 위해 교란 분석의 분자 정도. 그리고 마지막으로, 기능 분석은 분화 유전자의 생물학적 기능을 결정한다.이러한 파이프라인을 활용하는 모든 도구는 Linux 시스템에 사전 설치되었으며 Docker 컨테이너로 캡슐화되었습니다. 이러한 프로토콜을 활용하는 샘플은 PLOS 병원체에서 우리 그룹이 발행한 논문에서 파생되었습니다. 샘플은 치쿤구냐 바이러스에 감염된 20명의 건강한 사람들과 39명의 환자를 포함합니다.혈액 샘플을 채취하였고, RNA 시퀀싱이 수행되었다. Windows 시스템에 Docker를 설치하려면 다음 단계를 수행해야 합니다. Docker의 공식 웹 페이지로 이동하여 시작 하기에서 클릭 합니다.창에 대 한 Docker 데스크톱에 대 한 설치 프로그램을 찾을 수 있습니다. 파일을 다운로드합니다. 컴퓨터에 로컬로 설치합니다.이 두 옵션이 표시되어 있는지 확인합니다. 프로그램을 설치한 후 이 프로토콜에 대한 Docker 이미지를 다운로드합니다. Windows 터미널로 이동합니다.이미지를 다운로드하도록 명령을 실행합니다. 이미지를 다운로드한 후 Docker 데스크톱에서 파일을 볼 수 있으며 이 이미지에서 컨테이너를 시작할 수 있습니다. 라운드 버튼을 클릭한 후 원래 매개 변수 및 옵션을 확장하여 컨테이너 이름을 정의하고 로컬 컴퓨터의 폴더를 Docker 내부폴더와 연결해야 합니다.그런 다음 Run을 클릭하여 컨테이너를 시작합니다. 그런 다음 Docker 내부의 Linux 시스템에 있는 터미널에 액세스할 수 있습니다. 배쉬 명령을 입력한 다음 이 프로토콜의 모든 명령을 실행할 수 있습니다.먼저 이 프로토콜의 모든 도구를 사용할 수 있도록 소스를 실행해야 합니다. 디렉터리 스크립트에 액세스해야 합니다. 전사 분석을 수행하려면 먼저 기준 게놈을 다운로드해야 합니다.이를 위해 다음 명령을 실행해야 합니다. 게놈이 다운로드된 후에는 유전자의 부조를 다운로드해야 합니다. 이렇게 하려면 다음 명령을 입력해야 합니다.그런 다음 fastq 덤프를 구성해야 합니다. 이렇게 하면 예제의 시퀀싱 파일을 다운로드할 수 있습니다. 다음 명령을 입력한 후 탭 버튼을 사용하여 도구 옵션으로 이동하고 옵션 전류 디렉터리표시를 표시해야 합니다.탭 단추를 사용하여 저장한 다음 확인합니다. 그런 다음 도구 fastq-덤프를 종료합니다. 이제 다음 명령을 입력하여 읽기 다운로드를 시작할 수 있습니다.품질 관리는 순서읽기에서 오류의 확률로 구성되고 그래픽적으로 평가합니다. 이 단계에서어댑터와 같은 기술 시퀀스를 제거해야 합니다. 품질 관리 그래프를 생성하려면 FastQC 프로그램을 실행해야 합니다.어댑터 시퀀스와 저품질 시퀀스를 제거하려면 다음 명령을 입력해야 합니다. 양질의 읽기를 통해 이제 판독을 참조 게놈으로 매핑해야 합니다. 매핑 후, 우리는 인간 유전자에 따라 유전자에 대해 고개를 불고 각 인간 유전자와 일치하는 읽기 수를 계산해야합니다.첫 번째 단계는 다음 명령을 입력하여 기준 게놈을 인덱싱하는 것입니다. 그리고 우리는 이 명령을 입력하여 판독을 인간 게놈으로 매핑합니다. 그런 다음 읽기에 인가하는 스크립트를 실행해야 합니다.매핑 및 별표 후, 다른 그룹에 비해 한 그룹에서 발현이 더 높거나 낮은 유전자를 찾는 것으로 구성된 차동 발현 분석을 수행할 수 있다. 차별화된 발현 유전자 또는 DEG를 식별하려면 명령을 따라 실행해야 합니다. 그런 다음 Docker에서 로컬 컴퓨터로 데이터 결과를 전송할 수 있습니다.이를 위해 터미널로 이동하여 다음 명령을 입력하여 모든 결과를 로컬 폴더에 저장합니다. 나머지 분석을 수행하려면 디렉터리 데이터의 모든 파일을 로컬 컴퓨터의 디렉터리에 복사해야 합니다. 로컬 컴퓨터에서 Docker에서 데이터를 저장한 디렉터리를 볼 수 있습니다.보시다시피 모든 라이브러리에 액세스할 수 있습니다. 품질 관리 보고서가 포함된 HTML 파일을 열 수도 있습니다. 또한 분화 유전자를 포함하는 디렉토리에 접근할 수 있다.그리고이 디렉토리 안에, 당신은 당신이 건강한 대조군 대 Chikungunya 바이러스에 감염된 환자 대 다른 대 한 그룹에서 상류 또는 다운 규제되는 유전자를 볼 수있는 화산 플롯을 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜의 나머지 모든 단계는 브라우저를 사용하여 웹 도구에서 실행될 것입니다. 먼저 CEMiTool로 시작해 봅시다.브라우저로 이동하여 다음 주소를 입력합니다. CEMiTool은 사용자가 제공하는 식 데이터 집합의 공동 식 모듈을 식별합니다. 메인 페이지에서 메뉴로 이동하여 실행 버튼을 클릭할 수 있습니다.이렇게 하면 식 파일을 업로드할 수 있는 새 페이지가 열립니다. 이 파일은 로컬 컴퓨터의 디렉터리 데이터에 있습니다. 세 개의 식 파일이 있고 CEMiTool에 사용할 파일은 정규화 호출 tmm입니다.그런 다음 단백질-단백질 상호 작용을 포함하는 파일에 대해 동일한 것인 페노데이터 파일을 선택하고 마지막으로 유전자 세트 또는 경로를 포함하는 파일을 업로드해야 합니다. 유전자 세트 파일을 통해 CEMiTool은 각 공동 발현 모듈에 대한 농축 분석을 수행할 수 있습니다. 그런 다음 매개 변수 섹션을 확장하고 VST 적용을 클릭해야 합니다.그 후, 당신은 단지 CEMiTool 실행을 클릭 할 수 있습니다. CEMiTool을 실행하면 12개의 공동 식 모듈이 식별된 것을 볼 수 있습니다. 여기를 클릭하면 이러한 분석의 모든 결과를 다운로드할 수 있습니다.이 프로토콜에서 활용할 또 다른 도구는 민주당, 또는 동요의 분자 학위입니다. 그냥 브라우저 민주당.sysbio.tools에 입력합니다. 민주당은 잠재적 이상치뿐만 아니라 이 그룹에 비해 각 시료의 왜곡이 얼마나 혼란스럽는지 찾기 위해, 이 경우 건강한 대조군과 비교하여 각 시료의 분자 거리를 계산한다.실행 페이지에서 단추를 클릭하고 파일을 선택하여 표현식 파일을 업로드할 수 있습니다. 그런 다음 페노데이터 파일을 업로드해야 합니다. 그런 다음 그룹 또는 클래스에 대한 정보가 포함된 열을 정의한 다음 해당 클래스 또는 그룹이 대조군에 해당하도록 정의해야 합니다.그 후 민주당을 운영할 수 있습니다. 막대 그래프는 각 샘플에 대해 분자 정도의 섭동 점수를 막대로 표시하고 색상은 서로 다른 그룹을 나타냅니다. 그리고 상자 플롯은 각 점에 표시되는 동일한 결과를 시각화하는 또 다른 방법입니다.기능 분석을 수행하기 위해 Enrichr 도구를 사용할 것입니다. 이를 위해, 당신은 차분하게 표현된 유전자의 목록을 선택해야, 위 또는 다운 규제, Enrichr 도구에서 입력 유전자 목록으로 사용. 탭이 다른 것을 볼 수 있습니다.모든 결과를 로컬 컴퓨터에 다운로드할 수도 있습니다. 전사 분석을 위한 컴퓨터 환경이 Docker 플랫폼에 배치되었습니다. 이 방법을 사용하면 Linux 시스템에 대한 사전 경험이 없는 사용자가 터미널을 활용할 수 있습니다.이 컨테이너에는 모든 분석에 필요한 데이터 집합 및 스크립트에 미리 정의된 폴더 구조가 있습니다. 파이프라인에서 사용자는 치쿤구냐 바이러스에 감염된 20명의 건강한 개인과 39명의 환자로부터 혈액 전사 데이터를 활용할 것입니다. 시퀀싱 플랫폼은 DNA 서열을 포함하는 FASTQ 파일 집합(즉)을 반환합니다.각 뉴클레오티드 염기에 대한 판독 및 관련 품질. 프레드 품질 척도는 각 베이스에 대해 잘못된 판독의 가능성을 나타냅니다. 도구는 샘플에서 낮은 품질의 읽기를 식별하고 제거하고 매핑 판독의 확률을 높입니다.이 단계에서, 매핑 모듈, 복구된 고품질 판독은 인간 참조 게놈에 맞추기 위한 입력으로 사용된다. CEMiTool은 공동 식 모듈을 식별하고 분석합니다. 동일한 모듈 내의 유전자는 공동 표현되며, 이는 데이터 세트의 샘플에서 유사한 표현 패턴을 나타낸다는 것을 의미합니다.네트워크 분석은 가장 연결된 유전자, 즉 허브에 대한 정보를 제공합니다. 그 유전자의 이름은 네트워크에 표시됩니다.노드의 크기는 연결 정도에 비례합니다. DEG 분석에서 얻은 결과는 화산 플롯에 요약되었습니다. 섭란의 분자 정도의 분석은 건강하고 감염된 개별에게서 혼란시료의 확인을 허용합니다.민주당은 어떤 샘플이 잠재적인 생물학적 이상치라고 제안합니다. 이러한 샘플을 제거하면 다운스트림 결과에 영향을 미칩니다. AURA를 이용한 기능적 농축 분석은 농축기 도구를 사용하여 수행할 수 있습니다.이 단계는 차별화적으로 표현된 몇몇 유전자의 일반적인 기능적인 역할을 드러냄으로써 결과를 해석하는 것을 돕습니다. 바 그래프에 나타난 생물학적 과정은 p-값 순위에 따라 상위 10개의 농축 유전자 세트입니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 RNA-Seq 분석의 모든 단계를 다룹니다.파이프라인은 Docker라는 비상업적 시스템으로 개발및 캡슐화되었습니다. 이미지에 과학계에 사용할 수 있습니다. 컨테이너 시스템으로 인해 모든 스크립트와 도구는 재현성을 보장하기 위해 동일한 특정 버전에 따라 사용됩니다.또한, 생물정보학 분석의 일부는 무료 사용자 친화적 인 웹 도구를 통해 수행되었다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

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연구

면역학 및 감염병학

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장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

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Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

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높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

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A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

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Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

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