Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN er finansiert av FAPESP (tilskuddsnumre: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 og 2013/08216-2) og CNPq (313662/2017-7).
Vi er spesielt takknemlige for følgende tilskudd til stipendiater: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) og RLTO (CNPq Prosess 134204/2019-0).

Prøvene som ble brukt i denne protokollen ble godkjent av etikkkomiteene fra både Institutt for mikrobiologi ved Institutt for biomedisinske ved Universitetet i São Paulo og Federal University of Sergipe (Protokoller: 54937216.5.0000.5467 og 54835916.2.0000.5546).
1. Docker stasjonær installasjon
MERK: Trinn for å klargjøre Docker-miljøet er forskjellige mellom operativsystemene (OSer). Derfor må Mac-brukere følge trinnene som er oppført som...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Utarbeidelsen av sekvenseringsbibliotekene er et avgjørende skritt mot å svare på biologiske spørsmål på best mulig måte. Type transkripsjoner av interesse for studien vil veilede hvilken type sekvenseringsbibliotek som skal velges og drive bioinformatiske analyser. For eksempel, fra sekvensering av et patogen og vertsinteraksjon, i henhold til sekvenseringstypen, er det mulig å identifisere sekvenser fra begge eller bare fra vertsutskriftene.
Neste generasjons sekvenseringsutstyr, for...

Arbovirus, som denguefeber, gul feber, chikungunya og zika, har vært mye forbundet med flere endemiske utbrudd og har dukket opp som et av de viktigste patogenene som er ansvarlige for å infisere mennesker de siste tiårene1,2. Personer som er smittet med chikungunya-viruset (CHIKV) har ofte feber, hodepine,, polyarytralgi og leddgikt3,4,5. Virus kan undergrave genuttrykket til cellen og påvirke ulike vertssignaleringsveier. Nylig brukte blodtranskripsjonsstudier RNA-seq for å identifisere differensialt uttrykte gener (DEG) forbundet med akutt CHIKV-infeksjon sammenlignet med rekonvalesens6 eller sunne kontroller7. CHIKV-infiserte barn hadde oppregulerte gener som er involvert i medfødt immunitet, som de som er relatert til cellulære sensorer for viral RNA, JAK /STAT-signalering og bompengelignende reseptorsignaleringsveier6. Voksne akutt smittet med CHIKV viste også induksjon av gener relatert til medfødt immunitet, som de som er relatert til monocytter og dendritisk celleaktivering, og til antivirale responser7. Signalveiene beriket med nedregulerte gener inkluderte de som var relatert til adaptiv immunitet, for eksempel T-celleaktivering og differensiering og berikelse i T- og B-celler7.
Flere metoder kan brukes til å analysere transkripsjonsdata fra verts- og patogengener. Ofte starter RNA-seq bibliotekforberedelse med berikelse av modne poly-A-transkripsjoner. Dette trinnet fjerner det meste av ribosomal RNA (rRNA) og i noen av tilfellene virale / bakterielle RNAer. Men når det biologiske spørsmålet involverer patogenutskriftsdeteksjon og RNA er sekvensert uavhengig av forrige valg, kan mange andre forskjellige transkripsjoner oppdages ved sekvensering. For eksempel har subgenomiske mRNAer vist seg å være en viktig faktor for å verifisere alvorlighetsgraden av sykdommene8. I tillegg, for visse virus som CHIKV og SARS-CoV-2, genererer selv poly-A berikede biblioteker virale lesninger som kan brukes i nedstrømsanalyser9,10. Når forskerne fokuserer på analysen av vertstranskripsjonen, kan de undersøke den biologiske perturbasjonen på tvers av prøver, identifisere differensialt uttrykte gener og berikede veier og generere samuttrykksmoduler7,11,12. Denne protokollen fremhever transkripsjonsanalyser av CHIKV-infiserte pasienter og friske personer ved hjelp av ulike bioinformatiske tilnærminger (figur 1A). Data fra en tidligere publisert studie7 bestående av 20 friske og 39 CHIKV akutt infiserte personer ble brukt til å generere de representative resultatene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Patogener kan forårsake et bredt spekter av smittsomme sykdommer. De biologiske prosessene som er indusert av verten som svar på infeksjon, bestemmer alvorlighetsgraden av sykdommen. For å studere slike prosesser kan forskere bruke sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning (RNA-seq) som måler de dynamiske endringene i vertstranskripsjonen på ulike stadier av infeksjon, kliniske resultater eller sykdoms alvorlighetsgrad. Denne undersøkelsen kan føre til en bedre forståelse av sykdommene, samt avdekke potensielle narkotikamål og behandlinger. Protokollen som presenteres her beskriver en komplett rørledning for å analysere RNA-sekvenseringsdata fra rådata til funksjonell analyse. Rørledningen er delt inn i fem trinn: (1) kvalitetskontroll av dataene; (2) kartlegging og merknad av gener; (3) statistisk analyse for å identifisere differensialt uttrykte gener og sam-uttrykte gener; (4) Bestemmelse av den molekylære graden av perturbasjon av prøver; og (5) funksjonell analyse. Trinn 1 fjerner tekniske artefakter som kan påvirke kvaliteten på nedstrømsanalyser. I trinn 2 kartlegges og kommenteres gener i henhold til standard bibliotekprotokoller. Den statistiske analysen i trinn 3 identifiserer gener som er differensialt uttrykt eller sam-uttrykt i infiserte prøver, sammenlignet med ikke-infiserte. Prøvevariabilitet og tilstedeværelse av potensielle biologiske outliers verifiseres ved hjelp av den molekylære graden av perturbasjonstilnærming i trinn 4. Til slutt avslører den funksjonelle analysen i trinn 5 veiene forbundet med sykdommen fenotype. Den presenterte rørledningen tar sikte på å støtte forskere gjennom RNA-seq dataanalyse fra host-patogen interaksjonsstudier og drive fremtidige in vitro - eller in vivo-eksperimenter , som er avgjørende for å forstå den molekylære mekanismen for infeksjoner.

Datamiljøet for transkripsjonsanalyser ble opprettet og konfigurert på Docker-plattformen. Denne tilnærmingen gjør det mulig for nybegynnere Linux-brukere å bruke Linux-terminalsystemer uten kjennskap til prioriteringsadministrasjon. Docker-plattformen bruker ressursene til vertsoperativsystemet til å opprette en tjenestebeholder som inneholder bestemte brukeres verktøy (figur 1B). En beholder basert på Linux OS Ubuntu 20.04-distribusjonen ble opprettet, og den ble fullstendig konfig...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Protokollen som presenteres her beskriver en komplett rørledning for å analysere RNA-sekvensering transkripsjonsdata fra rålesninger til funksjonell analyse, inkludert kvalitetskontroll og forbehandlingstrinn til avanserte statistiske analytiske tilnærminger.

Transkripsjonsanalyse med høy gjennomstrømning for undersøkelse av vertspatogeninteraksjoner

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Velkommen til protokollen for transkripsjonsanalyse med høy gjennomstrømning for å undersøke vert-patogen interaksjoner. Denne protokollen er delt inn i følgende trinn. Kvalitetskontroll for å filtrere leseoperasjoner av lav kvalitet og også for å fjerne kortsekvenser Sekvensering og merknader, hvor må du kartlegge lesningene til et referansegenom og kommentere lesningene inn i genene.Statistisk og samuttrykksanalyse, som definerer differensialt uttrykte gener og også finner samuttrykksmodulene. Molekylær grad av perturbasjonsanalyse for å finne potensielle ytre prøver. Og til slutt, den funksjonelle analysen for å bestemme de biologiske funksjonene til differensialt uttrykte gener.Alle verktøyene som benyttet disse rørledningene ble forhåndsinstallert i et Linux-system og innkapslet i en Docker-beholder. Prøvene som benytter disse protokollene er hentet fra en artikkel publisert av vår gruppe i PLOS Pathogen. Prøvene består av 20 friske mennesker og 39 pasienter smittet med Chikungunya-virus.Blodprøvene ble samlet inn, og RNA-sekvensering ble utført. Hvis du vil installere Docker i Windows-systemet, må du følge disse trinnene. Gå til den offisielle nettsiden til Docker, og klikk i Kom i gang.Finn installasjonsprogrammet for Docker Desktop for Windows. Last ned filen. Installer lokalt i maskinen.Kontroller at disse to alternativene er merket. Når du har installert programmet, laster du ned Docker-avbildningen for denne protokollen. Gå til Windows-terminalen.Utfør kommandoene for å laste ned bildet. Etter å ha lastet ned bildet, kan du se filen i Docker-skrivebordet, og fra dette bildet kan vi starte beholderen. Når du har klikket i den runde knappen, må du utvide de opprinnelige parameterne og alternativene for å definere navnet på beholderen og knytte en mappe på den lokale datamaskinen til mappen i Docker.Etter dette klikker du i Kjør for å starte beholderen. Du kan deretter få tilgang til terminalen, som er i Linux-systemet inne i Docker. Skriv inn bash -kommandoene, og deretter kan du utføre alle kommandoene i denne protokollen.Først må vi utføre kilden for å gjøre alle verktøyene i denne protokollen tilgjengelige. Du bør få tilgang til katalogskriptene. For å utføre en transkripsjonsanalyse, må du først laste ned referansegenomet.For dette må du utføre følgende kommandoer. Etter at genomet er lastet ned, må du laste ned merknaden til genene. Hvis du vil gjøre dette, må du skrive inn følgende kommandoer.Deretter må du konfigurere fastq-dumpen. Dette gjør at du kan laste ned sekvenseringsfilene for eksemplene. Når du har skrevet inn følgende kommandoer, må du bruke Tab -knappen til å gå til Verktøy -alternativet og merke alternativmappen.Bruk Tab-knappene til å lagre, og deretter ok. Og gå deretter ut av verktøyet fastq-dump. Nå kan vi starte nedlastingene av lesningene ved å skrive inn følgende kommandoer.Kvalitetskontroll består og evaluerer grafisk sannsynligheten for feil i sekvenseringen. I dette trinnet må du også fjerne de tekniske sekvensene, for eksempel kort. For å generere kvalitetskontrollgrafene, må du kjøre FastQC-programmet.Hvis du vil fjerne kortsekvensene og sekvensene med lav kvalitet, må du skrive inn følgende kommandoer. Med god kvalitet leser, må vi nå kartlegge lesningene inn i referansegenomet. Etter kartleggingen må vi kommentere genene i henhold til de menneskelige genene og deretter telle antall lesninger som samsvarer med hvert menneskelige gen.Det første trinnet er å indeksere referansegenomet ved å skrive inn følgende kommando. Og så skriver vi inn disse kommandoene for å kartlegge lesningene inn i det menneskelige genom. Deretter bør du kjøre skriptene som kommenterer lesingene.Etter kartlegging og merknad kan du utføre differensialuttrykksanalysen som den består i å finne genene hvis uttrykk er høyere eller lavere i en gruppe sammenlignet med en annen. For å identifisere differensialt uttrykte gener, eller DEGs, må du kjøre følgende kommandoer. Etter dette kan du overføre dataresultatene fra Docker til din lokale datamaskin.For dette, gå til terminalen og skriv inn følgende kommandoer for å lagre alle resultatene i en lokal mappe. Hvis du vil utføre den gjenværende analysen, må du også kopiere alle filene i katalogdataene til en mappe på den lokale datamaskinen. På den lokale datamaskinen kan du se katalogene der du lagret dataene fra Docker.Som du kan se, kan du få tilgang til alle bibliotekene. Du kan også åpne HTML-filen som inneholder kvalitetskontrollrapportene. Du kan også få tilgang til en katalog som inneholder differensialt uttrykte gener.Og inne i denne katalogen finner du vulkanplottene der du kan se genene som er opp- eller nedregulert i den ene gruppen kontra en annen, i dette tilfellet pasienter infisert med Chikungunya virus versus sunne kontroller. Alle de gjenværende trinnene i denne protokollen kommer til å bli utført i webverktøy ved hjelp av nettleseren din. La oss først starte med CEMiTool.Gå til nettleseren, og skriv inn følgende adresse. CEMiTool identifiserer samuttrykksmoduler fra uttrykksdatasett fra brukerne. På hovedsiden kan du gå til menyen og klikke på knappen Kjør.Dette åpner en ny side der du kan laste opp uttrykksfilen. Denne filen finnes i katalogdataene på den lokale datamaskinen. Du vil se at det er tre uttrykksfiler, og den vi skal bruke til CEMiTool er en normaliseringssamtale tmm.Deretter må du velge fenodatafilen, det samme for filen som inneholder proteinproteininteraksjonene, og til slutt laste opp filen som inneholder gensettene eller banene. Gensettfilen gjør det mulig for CEMiTool å utføre berikelsesanalyser for hver av meduttrykksmodulene. Deretter bør du utvide parameterdelen og klikke i Bruk VST.Etter det kan du bare klikke på Kjør CEMiTool. Etter at du har kjørt CEMiTool, vil du se at 12 samuttrykksmoduler ble identifisert. Ved å klikke her kan du laste ned alle resultatene av denne analysen.Et annet verktøy som vi skal bruke i denne protokollen er MDP, eller Molecular Degree of Perturbation. Bare skriv inn nettleseren din mdp.sysbio.tools. MDP beregner den molekylære avstanden til hver prøve sammenlignet med en referansegruppe av prøver, i dette tilfellet de sunne kontrollene, for å finne ikke bare potensielle outliers, men også hvor perturbert er hver prøve sammenlignet med denne gruppen.På Kjør-siden kan du bare laste opp uttrykksfilen ved å klikke knappen og velge filen. Da må du laste opp fenodatafilen. Deretter må du definere hvilken kolonne som inneholder informasjonen om gruppen eller klassen, og deretter hvilken klasse eller gruppe som tilsvarer kontrollgruppen.Etter dette kan du bare kjøre MDP. Stolpediagrammet viser for hvert av prøvene som en stolpe poengsummen for molekylær grad av perturbasjon, og fargene representerer de forskjellige gruppene. Og bokstegningen er en annen måte å visualisere de samme resultatene på der du ser på hver prikk, er forskjellige prøver atskilt med to grupper.For å utføre den funksjonelle analysen, skal vi bruke Enrichr-verktøyet. For dette må du velge listen over gener som ble differensialt uttrykt, enten opp eller nedregulert, og bruke den som en inngangsgenliste i Enrichr-verktøyet. Du vil se at det er forskjellige faner.Alle resultatene kan også lastes ned til din lokale datamaskin. Datamiljøet for transkripsjonsanalyse er plassert på Docker-plattformen. Denne tilnærmingen gjør det mulig for brukere uten tidligere erfaring med Linux-systemet å bruke en terminal.I denne beholderen er det en forhåndsdefinert mappestruktur for datasett og skript som er nødvendige for all analysen. I rørledningen vil brukerne bruke blodtranskripsjonsdata fra 20 friske personer og 39 pasienter akutt smittet med Chikungunya-virus. Sekvenseringsplattformen returnerer et sett med FASTQ-filer som inneholder DNA-sekvensen, dvs.og tilhørende kvalitet for hver nukleotidbase. Phred-kvalitetsskalaen indikerer sannsynligheten for feil avlesning for hver base. Verktøy identifiserer og fjerner leseoperasjoner av lav kvalitet fra utvalg og øker sannsynligheten for å kartlegge lesinger.I dette trinnet, kartleggingsmodulen, brukes høykvalitetsavlesningene som gjenopprettes som innganger for å justere dem mot det menneskelige referansegenomet. CEMiTool identifiserer og analyserer samuttrykksmoduler. Gener i samme modul uttrykkes samtidig, noe som betyr at de viser lignende uttrykksmønstre på tvers av utvalgene av datasettene.Nettverksanalysen gir informasjon om de mest tilkoblede genene, det vil si knutepunktene. Navnene på disse genene er vist i nettverket.Størrelsen på nodene er proporsjonal med tilkoblingsgraden. Resultatene fra DEG-analysen ble oppsummert i vulkanplottene. Analysen av den molekylære graden av perturbasjon tillater identifisering av perturbed prøver fra friske og infiserte individer.MDP antyder hvilke prøver som er potensielle biologiske outliers. Hvis du fjerner disse prøvene, påvirkes nedstrømsresultatene. En funksjonell berikelsesanalyse ved hjelp av AURA kan utføres med Enrichr-verktøyet.Disse trinnene bidrar til å tolke resultatene ved å avsløre vanlige funksjonelle roller til flere gener som ble differensialt uttrykt. Den biologiske prosessen som vises i bargrafene er de 10 beste berikede gensettene basert på deres p-verdirangering. Til slutt dekker disse protokollene alle trinnene i RNA-Seq-analysen.Rørledningen ble utviklet og innkapslet i det ikke-kommersielle systemet Docker. På et bilde og gjort tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet. På grunn av beholdersystemet er alle skript og verktøy under samme spesifikke versjon for å garantere reproduserbarhet.Videre ble deler av bioinformatikkanalysen utført via gratis brukervennlige webverktøy.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilnærming til preger landskapet av Host-patogenfrie Protein-protein interaksjoner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Høy throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metode for kvalitativ Multi-skala analyse av bakterielle biofilmer på Trådformede soppkolonier Bruke Confocal og elektronmikroskopi

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...