Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN é financiado pela FAPESP (números de subvenção: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 e 2013/08216-2) e CNPq (313662/2017-7).
Agradecemos especialmente as seguintes bolsas para bolsistas: ANAG (Processo FAPESP 2019/13880-5), VEM (Processo FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Processo FAPESP 2020/05284-0), APV (Processo FAPESP 2019/27146-1) e, RLTO (Processo CNPq 134204/2019-0).

As amostras utilizadas neste protocolo foram aprovadas pelos comitês de ética tanto do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo quanto da Universidade Federal de Sergipe (Protocolos: 54937216.5.0000.5467 e 54835916.2.0000.5546, respectivamente).
1. Instalação de desktop docker
NOTA: As etapas para preparar o ambiente Docker são diferentes entre os sistemas operacionais (OSs). Portanto, os u...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

A preparação das bibliotecas de sequenciamento é um passo crucial para responder às questões biológicas da melhor maneira possível. O tipo de transcrição de interesse do estudo orientará qual tipo de biblioteca de sequenciamento será escolhida e conduzirá análises bioinformáticas. Por exemplo, a partir do sequenciamento de um patógeno e interação do host, de acordo com o tipo de sequência, é possível identificar sequências de ambas ou apenas das transcrições do host.
O e...

Arboviroses, como dengue, febre amarela, chikungunya e zika, têm sido amplamente associadas a diversos surtos endêmicos e surgiram como um dos principais patógenos responsáveis por infectar humanos nas últimas décadas1,2. Indivíduos infectados com o vírus chikungunya (CHIKV) frequentemente têm febre, dor de cabeça, erupção cutânea, poliartalgia e artrite3,4,5. Vírus podem subverter a expressão genética da célula e influenciar várias vias de sinalização de hospedeiro. Recentemente, estudos de transcrição sanguínea utilizaram RNA-seq para identificar os genes expressos diferencialmente (DEGs) associados à infecção aguda de CHIKV em comparação com convalescência6 ou controles saudáveis7. Crianças infectadas pelo CHIKV tinham genes regulamentados que estão envolvidos na imunidade inata, como os relacionados a sensores celulares para RNA viral, sinalização JAK/STAT e vias de sinalização de receptores semelhantes a pedágio6. Adultos gravemente infectados com CHIKV também mostraram indução de genes relacionados à imunidade inata, como os relacionados a monócitos e ativação celular dendrítica, e às respostas antivirais7. As vias de sinalização enriquecidas com genes regulados incluíam as relacionadas à imunidade adaptativa, como ativação celular T e diferenciação e enriquecimento em células T e B7.
Vários métodos podem ser usados para analisar dados de transcriptome de genes hospedeiros e patógenos. Muitas vezes, a preparação da biblioteca RNA-seq começa com o enriquecimento de transcrições maduras poli-A. Esta etapa remove a maior parte do RNA ribossômico (rRNA) e, em alguns dos casos, RNAs virais/bacterianas. No entanto, quando a questão biológica envolve a detecção da transcrição do patógeno e o RNA são sequenciados independente da seleção anterior, muitas outras transcrições diferentes poderiam ser detectadas por sequenciamento. Por exemplo, os mRNAs subgênero têm se mostrado um fator importante para verificar a gravidade das doenças8. Além disso, para certos vírus, como CHIKV e SARS-CoV-2, até mesmo bibliotecas poli-A enriquecidas geram leituras virais que podem ser utilizadas em análises a jusante9,10. Quando focados na análise do transcriptome hospedeiro, os pesquisadores podem investigar a perturbação biológica entre amostras, identificar genes expressos diferencialmente e caminhos enriquecidos e gerar módulos de co-expressão7,11,12. Este protocolo destaca análises de transcriptome de pacientes infectados pelo CHIKV e indivíduos saudáveis utilizando diferentes abordagens bioinformáticas (Figura 1A). Foram utilizados dados de um estudo publicado anteriormente, composto por 20 indivíduos saudáveis e 39 CHIKV com infecções agudas para gerar os resultados representativos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Patógenos podem causar uma grande variedade de doenças infecciosas. Os processos biológicos induzidos pelo hospedeiro em resposta à infecção determinam a gravidade da doença. Para estudar tais processos, os pesquisadores podem usar técnicas de sequenciamento de alto rendimento (RNA-seq) que medem as mudanças dinâmicas do transcriptome hospedeiro em diferentes estágios de infecção, desfechos clínicos ou gravidade da doença. Essa investigação pode levar a uma melhor compreensão das doenças, bem como a descoberta de potenciais alvos e tratamentos medicamentosos. O protocolo aqui apresentado descreve um pipeline completo para analisar dados de sequenciamento de RNA desde leituras brutas até análises funcionais. O gasoduto é dividido em cinco etapas: (1) controle de qualidade dos dados; (2) mapeamento e anotação de genes; (3) análise estatística para identificar genes expressos diferencialmente e genes co-expressos; (4) determinação do grau molecular da perturbação das amostras; e (5) análise funcional. A etapa 1 remove artefatos técnicos que podem afetar a qualidade das análises a jusante. Na etapa 2, os genes são mapeados e anotados de acordo com os protocolos padrão da biblioteca. A análise estatística na etapa 3 identifica genes que são expressos diferencialmente ou co-expressos em amostras infectadas, em comparação com as não infectadas. A variabilidade da amostra e a presença de potenciais outliers biológicos são verificadas usando o grau molecular de abordagem de perturbação na etapa 4. Por fim, a análise funcional na etapa 5 revela os caminhos associados ao fenótipo da doença. O pipeline apresentado tem como objetivo apoiar pesquisadores através da análise de dados RNA-seq a partir de estudos de interação hospedeiro-patógeno e impulsionar futuros experimentos in vitro ou in vivo , que são essenciais para entender o mecanismo molecular das infecções.

O ambiente de computação para análises de transcriptome foi criado e configurado na plataforma Docker. Essa abordagem permite que usuários iniciantes do Linux usem sistemas de terminais Linux sem conhecimento de gerenciamento a priori. A plataforma Docker usa os recursos do sistema operacional host para criar um contêiner de serviço que inclua ferramentas específicas de usuários (Figura 1B). Um contêiner baseado na distribuição Linux OS Ubuntu 20.04 foi criado e foi totalmente con...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

O protocolo aqui apresentado descreve um pipeline completo para analisar dados de transcriptome de sequenciamento de RNA desde leituras brutas até análises funcionais, incluindo etapas de controle de qualidade e pré-processamento para abordagens analíticas estatísticas avançadas.

Análise de transcriptome de alto rendimento para investigar interações host-pathogen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Bem-vindos ao protocolo de análise de transcriptome de alto rendimento para investigar interações hospedeiro-patógeno. Este protocolo é dividido nas etapas seguintes. Controle de qualidade para filtrar leituras de baixa qualidade e também para remover sequências de adaptadores Sequenciamento e anotações, onde você tem que mapear as leituras em um genoma de referência e anotar as leituras nos genes.Análise estatística e de co-expressão, que define os genes expressos diferencialmente e também encontra os módulos de co-expressão. Grau molecular de análise de perturbação para encontrar amostras possíveis. E, finalmente, a análise funcional para determinar as funções biológicas dos genes expressos diferencialmente.Todas as ferramentas que utilizam esses dutos foram pré-instaladas em um sistema Linux e encapsuladas em um contêiner Docker. As amostras que utilizam esses protocolos derivam de um artigo publicado pelo nosso grupo no PLOS Pathogen. As amostras compreendem 20 pessoas saudáveis e 39 pacientes infectados com o vírus Chikungunya.As amostras de sangue foram coletadas e o sequenciamento do RNA foi realizado. Para instalar o Docker no sistema Windows, você tem que seguir essas etapas. Acesse a página oficial do Docker e clique em Get Started.Encontre o instalador do Docker Desktop para windows. Baixe o arquivo. Instale localmente em sua máquina.Certifique-se de que essas duas opções estão marcadas. Depois de instalar o programa, baixa a imagem do Docker para este protocolo. Vá para o terminal windows.Execute os comandos para baixar a imagem. Depois de baixar a imagem, você pode ver o arquivo na área de trabalho do Docker, e a partir desta imagem, podemos iniciar o contêiner. Depois de clicar no botão redondo, você tem que expandir os parâmetros e opções originais para definir o nome do contêiner e associar uma pasta em seu computador local com a pasta dentro do Docker.Depois disso, clique em Executar para iniciar o contêiner. Em seguida, você pode acessar o terminal, que está no sistema Linux dentro do Docker. Digite os comandos bash, e então você pode executar todos os comandos deste protocolo.Primeiro, temos que executar a fonte para disponibilizar todas as ferramentas deste protocolo. Você deve acessar os roteiros do diretório. Para realizar uma análise transcriômica, você tem que baixar primeiro o genoma de referência.Para isso, você tem que executar os seguintes comandos. Depois que o genoma é baixado, você tem que baixar a anotação dos genes. Para fazer isso, você tem que digitar os seguintes comandos.Em seguida, você tem que configurar o fastq-dump. Isso permite que você baixe os arquivos de sequenciamento dos exemplos. Depois de digitar os seguintes comandos, você tem que usar o botão Tab para ir à opção Ferramentas e marcar o diretório de opções atuais.Use os botões Tab para salvar e, em seguida, ok. E então saia da ferramenta fastq-dump. Agora podemos iniciar os downloads das leituras digitando os seguintes comandos.O controle de qualidade consiste e avalia graficamente a probabilidade de erros nas leituras de sequenciamento. Nesta etapa, você também tem que remover as sequências técnicas, como adaptadores. Para gerar os gráficos de controle de qualidade, você tem que executar o programa FastQC.Para remover as sequências do adaptador e as sequências de baixa qualidade, você tem que digitar os seguintes comandos. Com as leituras de boa qualidade, agora temos que mapear as leituras no genoma de referência. Após o mapeamento, teremos que anotar os genes de acordo com os genes humanos e, em seguida, contar o número de leituras que correspondem a cada gene humano.O primeiro passo é indexar o genoma de referência digitando o seguinte comando. E então digitamos este comando para mapear as leituras no genoma humano. Em seguida, você deve executar os scripts que anotam as leituras.Após mapeamento e anotação, você pode realizar a análise de expressão diferencial que consiste em encontrar os genes cuja expressão é maior ou menor em um grupo em comparação com outro. Para identificar os genes expressos diferencialmente, ou DEGs, você tem que executar após comandos. Depois disso, você pode transferir os resultados dos dados do Docker para o seu computador local.Para isso, vá até o terminal e digite os seguintes comandos para salvar todos os resultados em uma pasta local. Para realizar a análise restante, você também precisa copiar todos os arquivos dos dados do diretório para um diretório em seu computador local. Em seu computador local, você poderá ver os diretórios onde salvou os dados do Docker.Como você pode ver, você pode acessar todas as bibliotecas. Você também pode abrir o arquivo HTML contendo os relatórios de controle de qualidade. Você também pode acessar um diretório contendo os genes expressos diferencialmente.E dentro deste diretório, você encontrará as tramas do vulcão onde você pode ver os genes que são para cima ou para baixo regulados em um grupo versus outro, neste caso, pacientes infectados com vírus Chikungunya versus controles saudáveis. Todas as etapas restantes deste protocolo serão executadas em ferramentas web usando seu navegador. Vamos começar com o CEMiTool.Vá para o navegador e digite o seguinte endereço. O CEMiTool identifica módulos de co-expressão a partir de conjuntos de dados de expressão fornecidos pelos usuários. Na página principal, você pode ir ao menu e clicar no botão Executar.Isso abrirá uma nova página onde você pode carregar o arquivo de expressão. Este arquivo está nos dados do diretório do seu computador local. Você verá que há três arquivos de expressão, e o que vamos usar para o CEMiTool é uma chamada de normalização tmm.Então você tem que selecionar o arquivo de fenodados, a mesma coisa para o arquivo que contém as interações proteína-proteína, e finalmente, carregar o arquivo contendo os conjuntos genéticos ou caminhos. O arquivo de conjuntos genéticos permite que o CEMiTool realize análises de enriquecimento para cada um do módulo de co-expressão. Em seguida, você deve expandir a seção parâmetro e clicar em Aplicar VST.Depois disso, basta clicar em Executar CEMiTool. Depois de executar o CEMiTool, você verá que 12 módulos de co-expressão foram identificados. Clicando aqui, você pode baixar todos os resultados desta análise.Outra ferramenta que vamos utilizar neste protocolo é o MDP, ou Grau Molecular de Perturbação. Basta digitar no seu navegador mdp.sysbio.tools. O MDP calcula a distância molecular de cada amostra em comparação com um grupo de referência de amostras, neste caso, os controles saudáveis, a fim de encontrar não apenas potenciais outliers, mas também o quão perturbadas cada amostra é em comparação com este grupo.Na página Executar, você pode apenas carregar o arquivo de expressão clicando no botão e selecionando o arquivo. Então você tem que carregar o arquivo de fenodados. Em seguida, você tem que definir qual coluna contém as informações sobre o grupo ou a classe e, em seguida, qual classe ou grupo correspondem ao grupo de controle.Depois disso, você pode apenas executar MDP. O gráfico da barra mostra para cada uma das amostras como uma barra a pontuação do grau molecular de perturbação, e as cores representam os diferentes grupos. E o enredo da caixa é outra maneira de visualizar os mesmos resultados onde você vê em cada ponto, é uma amostra diferente separada por dois grupos.Para realizar a análise funcional, vamos usar a ferramenta Enrichr. Para isso, você tem que selecionar a lista de genes que foram expressos diferencialmente, para cima ou para baixo, e usá-lo como uma lista genética de entrada na ferramenta Enrichr. Você verá que existem guias diferentes.Todos os resultados também podem ser baixados para o seu computador local. O ambiente do computador para análise de transcriptome foi colocado na plataforma Docker. Essa abordagem permite que usuários sem experiência prévia com sistema Linux utilizem um terminal.Neste contêiner, há uma estrutura de pasta predefinida para conjunto de dados e scripts que são necessários para toda a análise. No pipeline, os usuários utilizarão dados de transcrição sanguínea de 20 indivíduos saudáveis e 39 pacientes gravemente infectados pelo vírus Chikungunya. A plataforma de sequenciamento retorna um conjunto de arquivos FASTQ contendo a sequência de DNA, ou seja.as leituras e a qualidade associada para cada base nucleotídea. A escala de qualidade phred indica a probabilidade de uma leitura incorreta para cada base. As ferramentas identificam e removem leituras de baixa qualidade das amostras e para aumentar a probabilidade de mapeamento de leituras.Nesta etapa, o módulo de mapeamento, as leituras de alta qualidade recuperadas são usadas como entradas para alinhá-las ao genoma de referência humana. O CEMiTool identifica e analisa módulos de co-expressão. Genes dentro do mesmo módulo são co-expressos, o que significa que eles exibem padrões de expressão semelhantes nas amostras dos conjuntos de dados.A análise da rede fornece informações sobre os genes mais conectados, ou seja, os hubs. Os nomes desses genes são mostrados na rede.O tamanho dos nódulos é proporcional ao seu grau de conectividade. Os resultados obtidos a partir da análise DEG foram resumidos nas parcelas do vulcão. A análise do grau molecular de perturbação permite a identificação de amostras perturbadas de indivíduos saudáveis e infectados.MDP sugere quais amostras são potenciais outliers biológicos. A remoção dessas amostras afetará os resultados a jusante. Uma análise de enriquecimento funcional utilizando AURA pode ser realizada com a ferramenta Enrichr.Essas etapas ajudam a interpretar os resultados revelando papéis funcionais comuns de vários genes que foram expressos diferencialmente. O processo biológico mostrado nos gráficos de barras são os 10 principais conjuntos genéticos enriquecidos com base em seu ranking de valor p. Em conclusão, esses protocolos abrangem todas as etapas da análise do RNA-Seq.O oleoduto foi desenvolvido e encapsulado no sistema não comercial chamado Docker. Em uma imagem e disponibilizada para a comunidade científica. Devido ao sistema de contêineres, todos os scripts e ferramentas estão sob a mesma versão específica para garantir a reprodutibilidade.Além disso, partes da análise bioinformática foram realizadas por meio de ferramentas web gratuitas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...