Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN финансируется FAPESP (номера грантов: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 и 2013/08216-2) и CNPq (313662/2017-7).
Мы особенно благодарны следующим грантам для стипендиатов: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) и RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

Образцы, используемые в этом протоколе, были одобрены комитетами по этике как из Департамента микробиологии Института биомедицинских наук Университета Сан-Паулу, так и из Федерального университета Сержипи (Протоколы: 54937216.5.0000.5467 и 54835916.2.0000.5546, соответственно).
1. Устан...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Подготовка библиотек секвенирования является решающим шагом на пути к наилучшим ответам на биологические вопросы. Тип транскриптов, представляющих интерес для исследования, будет определять, какой тип библиотеки секвенирования будет выбран, и стимулировать биоинформационный анализ...

Арбовирусы, такие как лихорадка денге, желтая лихорадка, чикунгунья и зика, были широко связаны с несколькими эндемическими вспышками и стали одним из основных патогенов, ответственных за заражение людей в последние десятилетия1,2. Лица, инфицированные вирусом чикунгуньи (CHIKV), часто имеют лихорадку, головную боль, сыпь, полиартралгию и артрит3,4,5. Вирусы могут подрывать экспрессию генов клетки и влиять на различные сигнальные пути хозяина. Недавно в исследованиях транскриптома крови использовался RNA-seq для идентификации дифференциально экспрессированных генов (DEG), связанных с острой инфекцией CHIKV, по сравнению с реконвалесценцией6 или здоровыми контрольными группами7. Дети, инфицированные CHIKV, имели повышенные регулируемые гены, которые участвуют во врожденном иммунитете, такие как те, которые связаны с клеточными датчиками вирусной РНК, сигнализацией JAK / STAT и сигнальными путями toll-подобных рецепторов6. Взрослые, остро инфицированные CHIKV, также показали индукцию генов, связанных с врожденным иммунитетом, таких как гены, связанные с моноцитами и активацией дендритных клеток, а также с противовирусными реакциями7. Сигнальные пути, обогащенные низкорегулируемыми генами, включали те, которые связаны с адаптивным иммунитетом, такие как активация Т-клеток, дифференцировка и обогащение в Т- и В-клетках7.
Несколько методов могут быть использованы для анализа транскриптомных данных генов хозяина и патогена. Часто подготовка библиотеки RNA-seq начинается с обогащения зрелыми поли-А транскриптами. Этот шаг удаляет большую часть рибосомной РНК (рРНК) и в некоторых случаях вирусные / бактериальные РНК. Однако, когда биологический вопрос связан с обнаружением транскрипта патогена и РНК секвенируются независимо от предыдущего отбора, многие другие различные транскрипты могут быть обнаружены путем секвенирования. Например, было показано, что субгеномные мРНК являются важным фактором для проверки тяжести заболеваний8. Кроме того, для некоторых вирусов, таких как CHIKV и SARS-CoV-2, даже библиотеки, обогащенные поли-А, генерируют вирусные считывания, которые могут быть использованы в последующих анализах9,10. Сосредоточившись на анализе транскриптома хозяина, исследователи могут исследовать биологическое возмущение в образцах, идентифицировать дифференциально экспрессированные гены и обогащенные пути, а также генерировать модули коэкспрессии7,11,12. Этот протокол выделяет анализ транскриптома пациентов, инфицированных CHIKV, и здоровых людей с использованием различных биоинформационных подходов (рисунок 1A). Данные ранее опубликованного исследования7, состоящего из 20 здоровых и 39 остро инфицированных лиц CHIKV, были использованы для получения репрезентативных результатов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Возбудители могут вызывать самые разнообразные инфекционные заболевания. Биологические процессы, индуцированные хозяином в ответ на инфекцию, определяют тяжесть заболевания. Для изучения таких процессов исследователи могут использовать высокопроизводительные методы секвенирования (RNA-seq), которые измеряют динамические изменения транскриптома хозяина на разных стадиях инфекции, клинических исходах или тяжести заболевания. Это исследование может привести к лучшему пониманию заболеваний, а также к выявлению потенциальных лекарственных мишеней и методов лечения. Протокол, представленный здесь, описывает полный конвейер для анализа данных секвенирования РНК от необработанных считываний до функционального анализа. Конвейер разделен на пять этапов: (1) контроль качества данных; (2) картирование и аннотация генов; (3) статистический анализ для выявления дифференциально экспрессированных генов и коэкспрессированных генов; 4) определение молекулярной степени возмущения образцов; и 5) функциональный анализ. Шаг 1 удаляет технические артефакты, которые могут повлиять на качество последующего анализа. На этапе 2 гены отображаются и аннотируются в соответствии со стандартными библиотечными протоколами. Статистический анализ на этапе 3 идентифицирует гены, которые дифференциально экспрессируются или совместно экспрессируются в инфицированных образцах, по сравнению с неинфицированными. Изменчивость образца и наличие потенциальных биологических выбросов проверяются с использованием подхода, основанного на молекулярной степени возмущения на этапе 4. Наконец, функциональный анализ на шаге 5 выявляет пути, связанные с фенотипом заболевания. Представленный конвейер направлен на поддержку исследователей посредством анализа данных RNA-seq из исследований взаимодействия хозяина с патогеном и проведение будущих экспериментов in vitro или in vivo , которые необходимы для понимания молекулярного механизма инфекций.

Вычислительная среда для анализа транскриптома была создана и настроена на платформе Docker. Такой подход позволяет начинающим пользователям Linux использовать терминальные системы Linux без априорных управленческих знаний. Платформа Docker использует ресурсы ос хоста для создания контейнера...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Протокол, представленный здесь, описывает полный конвейер для анализа данных транскриптома РНК-секвенирования от необработанных считываний до функционального анализа, включая контроль качества и этапы предварительной обработки для передовых статистических аналитических подходов.

Высокопроизводительный анализ транскриптома для исследования взаимодействий хозяина и патогена

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Добро пожаловать в протокол высокопроизводительного анализа транскриптома для исследования взаимодействий хозяин-патоген. Этот протокол разделен на следующие шаги. Контроль качества для фильтрации низкокачественных считываний, а также для удаления последовательностей адаптера Секвенирование и аннотации, где вы должны сопоставить чтения в эталонные геномы и аннотировать считывания в гены.Статистический и коэкспрессионный анализ, который определяет дифференциально экспрессируемые гены, а также находит модули коэкспрессии. Анализ молекулярной степени возмущения для поиска потенциальных образцов выброса. И, наконец, функциональный анализ для определения биологических функций дифференциально экспрессированных генов.Все инструменты, использующие эти конвейеры, были предварительно установлены в системе Linux и инкапсулированы в контейнер Docker. Образцы, использующие эти протоколы, получены из статьи, опубликованной нашей группой в PLOS Pathogen. Образцы включают 20 здоровых людей и 39 пациентов, инфицированных вирусом чикунгунья.Были собраны образцы крови и проведено секвенирование РНК. Чтобы установить Docker в системе Windows, необходимо выполнить следующие действия. Перейдите на официальную веб-страницу Docker и нажмите кнопку Начало работы.Найдите установщик Docker Desktop для Windows. Загрузите файл. Установите локально на компьютере.Убедитесь, что эти два параметра отмечены. После установки программы загружается образ Docker для этого протокола. Перейдите в терминал Windows.Выполните команды для загрузки образа. После загрузки образа вы можете увидеть файл на рабочем столе Docker, и из этого образа мы можем инициировать контейнер. После нажатия круглой кнопки необходимо развернуть исходные параметры и параметры, чтобы определить имя контейнера и связать папку на локальном компьютере с папкой внутри Docker.После этого щелкните Выполнить, чтобы запустить контейнер. Затем вы можете получить доступ к терминалу, который находится в системе Linux внутри Docker. Введите команды bash, после чего можно будет выполнить все команды этого протокола.Во-первых, мы должны выполнить исходный код, чтобы сделать все инструменты этого протокола доступными. Вы должны получить доступ к сценариям каталога. Чтобы выполнить транскриптомный анализ, вы должны сначала загрузить эталонный геном.Для этого необходимо выполнить следующие команды. После загрузки генома вы должны загрузить аннотацию генов. Для этого необходимо ввести следующие команды.Далее вам предстоит настроить fastq-дамп. Это позволяет загружать файлы виртуализации примеров. После ввода следующих команд необходимо использовать кнопку Tab, чтобы перейти к опции Сервис и пометить каталог текущих параметров.Используйте кнопки Tab для сохранения, а затем ОК. А затем выйдите из инструмента fastq-dump. Теперь мы можем инициировать загрузку чтения, введя следующие команды.Контроль качества состоит и оценивает графически вероятность ошибок в последовательности чтения. На этом шаге также необходимо удалить технические последовательности, такие как адаптеры. Чтобы сгенерировать графики контроля качества, необходимо запустить программу FastQC.Чтобы удалить последовательности адаптера и последовательности низкого качества, необходимо ввести следующие команды. С хорошим качеством чтения мы должны теперь сопоставить чтения в эталонном геноме. После картирования нам придется аннотировать гены в соответствии с человеческими генами, а затем подсчитать количество считываний, которые соответствуют каждому человеческому гену.Первым шагом является индексация эталонного генома путем ввода следующей команды. Затем мы вводим эту команду, чтобы сопоставить показания в геноме человека. Затем следует запустить сценарии, которые аннотируют чтение.После картирования и аннотации можно выполнить дифференциальный экспресс-анализ, который заключается в нахождении генов, экспрессия которых выше или ниже в одной группе по сравнению с другой. Чтобы идентифицировать дифференциально экспрессированные гены, или DEG, необходимо выполнить следующие команды. После этого можно перенести результаты обработки данных из Docker на локальный компьютер.Для этого зайдите в терминал и введите следующие команды, чтобы сохранить все результаты в локальную папку. Для выполнения оставшегося анализа необходимо также скопировать все файлы данных каталога в каталог на локальном компьютере. На локальном компьютере вы сможете увидеть каталоги, в которых вы сохранили данные из Docker.Как видите, вы можете получить доступ ко всем библиотекам. Можно также открыть HTML-файл, содержащий отчеты о контроле качества. Вы также можете получить доступ к каталогу, содержащему дифференциально экспрессированные гены.И внутри этого каталога вы найдете графики вулканов, где вы можете увидеть гены, которые регулируются вверх или вниз в одной группе по сравнению с другой, в данном случае пациенты, инфицированные вирусом чикунгуньи, по сравнению со здоровыми контрольными группами. Все остальные шаги этого протокола будут выполняться в веб-инструментах с помощью вашего браузера. Давайте начнем с CEMiTool.Зайдите в браузер и введите следующий адрес. CEMiTool идентифицирует модули совместного выражения из наборов данных выражений, предоставляемых пользователями. На главной странице можно зайти в меню и нажать на кнопку Выполнить.Откроется новая страница, на которую можно загрузить файл выражения. Этот файл находится в каталоге локального компьютера. Вы увидите, что есть три файла выражений, и тот, который мы собираемся использовать для CEMiTool, является вызовом нормализации tmm.Затем вы должны выбрать файл фенодат, то же самое для файла, содержащего белково-белковые взаимодействия, и, наконец, загрузить файл, содержащий наборы генов или пути. Файл наборов генов позволяет CEMiTool выполнять анализ обогащения для каждого модуля коэкспрессии. Далее необходимо развернуть раздел параметров и щелкнуть в поле Применить VST.После этого вы можете просто нажать Запустить CEMiTool. После запуска CEMiTool вы увидите, что было идентифицировано 12 модулей совместного выражения. Нажав здесь, вы можете скачать все результаты этого анализа.Другим инструментом, который мы собираемся использовать в этом протоколе, является MDP, или молекулярная степень возмущения. Просто введите в браузере mdp.sysbio.tools. MDP вычисляет молекулярное расстояние каждого образца по сравнению с референтной группой образцов, в данном случае здоровыми контрольными группами, чтобы найти не только потенциальные выбросы, но и то, насколько возмущены каждый образец по сравнению с этой группой.На странице Выполнить можно просто загрузить файл выражения, нажав кнопку и выбрав файл. Затем вы должны загрузить файл phenodata. Затем необходимо определить, какой столбец содержит сведения о группе или классе, а затем какой класс или группа соответствуют контрольной группе.После этого вы можете просто запустить MDP. Гистограмма показывает для каждого из образцов в виде бара оценку молекулярной степени возмущения, а цвета представляют различные группы. И прямоугольный график - это еще один способ визуализации тех же результатов, где вы видите на каждой точке разные образцы, разделенные двумя группами.Для выполнения функционального анализа мы будем использовать инструмент Enrichr. Для этого вы должны выбрать список генов, которые были дифференциально экспрессированы, либо вверх, либо вниз, и использовать его в качестве входного списка генов в инструменте Enrichr. Вы увидите, что есть разные вкладки.Все результаты также можно загрузить на локальный компьютер. Компьютерная среда для анализа транскриптома была размещена на платформе Docker. Такой подход позволяет пользователям, не имеющим опыта работы с системой Linux, использовать терминал.В этом контейнере есть предопределенная структура папок для набора данных и скриптов, которые необходимы для всего анализа. В процессе разработки пользователи будут использовать данные транскриптома крови от 20 здоровых людей и 39 пациентов, остро инфицированных вирусом чикунгуньи. Платформа секвенирования возвращает набор файлов FASTQ, содержащих последовательность ДНК, т.е.показания и связанное с ними качество для каждого нуклеотидного основания. Шкала качества Phred указывает на вероятность неправильного считывания для каждой базы. Инструменты выявляют и удаляют некачественные считываемые данные из образцов и повышают вероятность сопоставления считываний.На этом этапе модуль картирования, восстановленные высококачественные считывания используются в качестве входных данных для выравнивания их с эталонным геномом человека. CEMiTool идентифицирует и анализирует модули совместного выражения. Гены в одном модуле совместно экспрессируются, что означает, что они демонстрируют сходные паттерны экспрессии в выборках наборов данных.Сетевой анализ предоставляет информацию о наиболее связанных генах, т.е. хабах. Названия этих генов показаны в сети.Размер узлов пропорционален степени его связности. Результаты, полученные в результате анализа DEG, были обобщены на участках вулканов. Анализ молекулярной степени возмущения позволяет идентифицировать возмущенные образцы от здоровых и инфицированных людей.MDP предполагает, какие образцы являются потенциальными биологическими выбросами. Удаление этих образцов повлияет на последующие результаты. Анализ функционального обогащения с использованием AURA может быть выполнен с помощью инструмента Enrichr.Эти шаги помогают интерпретировать результаты, выявляя общие функциональные роли нескольких генов, которые были дифференциально экспрессированы. Биологический процесс, показанный на гистограммах, представляет собой топ-10 обогащенных наборов генов, основанных на их рейтинге p-значения. В заключение, эти протоколы охватывают все этапы анализа RNA-Seq.Трубопровод был разработан и инкапсулирован в некоммерческую систему под названием Docker. На изображении и сделано доступным для научного сообщества. Из-за контейнерной системы все скрипты и инструменты находятся под одной и той же конкретной версией, чтобы гарантировать воспроизводимость.Кроме того, часть анализа биоинформатики была выполнена с помощью бесплатных удобных веб-инструментов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...