Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
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HN es financiado por la FAPESP (números de subvención: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 y 2013/08216-2) y CNPq (313662/2017-7).
Estamos particularmente agradecidos a las siguientes becas para becarios: ANAG (Proceso FAPESP 2019/13880-5), VEM (Proceso FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Proceso FAPESP 2020/05284-0), APV (Proceso FAPESP 2019/27146-1) y, RLTO (Proceso CNPq 134204/2019-0).

Las muestras utilizadas en este protocolo fueron aprobadas por los comités de ética tanto del Departamento de Microbiología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo como de la Universidad Federal de Sergipe (Protocolos: 54937216.5.0000.5467 y 54835916.2.0000.5546, respectivamente).
1. Instalación de escritorio de Docker
NOTA: Los pasos para preparar el entorno de Docker son diferentes entre los sistemas operativos (SO)...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

La preparación de las bibliotecas de secuenciación es un paso crucial para responder a las preguntas biológicas de la mejor manera posible. El tipo de transcripciones de interés del estudio guiará qué tipo de biblioteca de secuenciación se elegirá e impulsará los análisis bioinformáticos. Por ejemplo, a partir de la secuenciación de un patógeno y la interacción del huésped, de acuerdo con el tipo de secuenciación, es posible identificar secuencias de ambos o solo de las transcripciones del huésped.
<...

Los arbovirus, como el dengue, la fiebre amarilla, el chikungunya y el zika, se han asociado ampliamente con varios brotes endémicos y se han convertido en uno de los principales patógenos responsables de infectar a los humanos en las últimas décadas1,2. Las personas infectadas con el virus chikungunya (CHIKV) a menudo tienen fiebre, dolor de cabeza, erupción cutánea, poliartralgia y artritis3,4,5. Los virus pueden subvertir la expresión génica de la célula e influir en varias vías de señalización del huésped. Recientemente, los estudios de transcriptoma sanguíneo utilizaron RNA-seq para identificar los genes expresados diferencialmente (DEG) asociados con la infección aguda por CHIKV en comparación con la convalecencia6 o los controles sanos7. Los niños infectados con CHIKV tenían genes regulados al alza que están involucrados en la inmunidad innata, como los relacionados con los sensores celulares para el ARN viral, la señalización JAK/STAT y las vías de señalización del receptor tipo toll6. Los adultos infectados agudamente con CHIKV también mostraron inducción de genes relacionados con la inmunidad innata, como los relacionados con los monocitos y la activación de las células dendríticas, y con las respuestas antivirales7. Las vías de señalización enriquecidas con genes regulados a la baja incluyeron las relacionadas con la inmunidad adaptativa, como la activación y diferenciación y enriquecimiento de células T en células T y B7.
Se pueden utilizar varios métodos para analizar los datos del transcriptoma de los genes huésped y patógeno. A menudo, la preparación de la biblioteca RNA-seq comienza con el enriquecimiento de transcripciones maduras de poli-A. Este paso elimina la mayor parte del ARN ribosómico (ARNr) y, en algunos de los casos, los ARN virales/bacterianos. Sin embargo, cuando la cuestión biológica involucra la detección de la transcripción del patógeno y el ARN se secuencia independientemente de la selección anterior, se podrían detectar muchas otras transcripciones diferentes mediante secuenciación. Por ejemplo, se ha demostrado que los ARNm subgenómicos son un factor importante para verificar la gravedad de las enfermedades8. Además, para ciertos virus como CHIKV y SARS-CoV-2, incluso las bibliotecas enriquecidas con poli-A generan lecturas virales que se pueden utilizar en análisis posteriores9,10. Cuando se centran en el análisis del transcriptoma del huésped, los investigadores pueden investigar la perturbación biológica a través de las muestras, identificar genes expresados diferencialmente y vías enriquecidas, y generar módulos de coexpresión7,11,12. Este protocolo destaca los análisis de transcriptomas de pacientes infectados por CHIKV e individuos sanos utilizando diferentes enfoques bioinformáticos (Figura 1A). Se utilizaron datos de un estudio publicado previamente7 que consta de 20 individuos sanos y 39 infectados agudamente por CHIKV para generar los resultados representativos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Los patógenos pueden causar una amplia variedad de enfermedades infecciosas. Los procesos biológicos inducidos por el huésped en respuesta a la infección determinan la gravedad de la enfermedad. Para estudiar tales procesos, los investigadores pueden utilizar técnicas de secuenciación de alto rendimiento (RNA-seq) que miden los cambios dinámicos del transcriptoma del huésped en diferentes etapas de la infección, los resultados clínicos o la gravedad de la enfermedad. Esta investigación puede conducir a una mejor comprensión de las enfermedades, así como a descubrir posibles objetivos farmacológicos y tratamientos. El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales. La tubería se divide en cinco pasos: (1) control de calidad de los datos; (2) mapeo y anotación de genes; (3) análisis estadístico para identificar genes expresados diferencialmente y genes coexpresados; (4) determinación del grado molecular de la perturbación de las muestras; y (5) análisis funcional. El paso 1 elimina los artefactos técnicos que pueden afectar a la calidad de los análisis posteriores. En el paso 2, los genes se mapean y anotan de acuerdo con los protocolos de biblioteca estándar. El análisis estadístico en el paso 3 identifica genes que se expresan diferencialmente o coexpresan en muestras infectadas, en comparación con las no infectadas. La variabilidad de la muestra y la presencia de posibles valores biológicos atípicos se verifican utilizando el enfoque de grado molecular de perturbación en el paso 4. Finalmente, el análisis funcional en el paso 5 revela las vías asociadas con el fenotipo de la enfermedad. La tubería presentada tiene como objetivo apoyar a los investigadores a través del análisis de datos de ARN-seq de estudios de interacción huésped-patógeno e impulsar futuros experimentos in vitro o in vivo , que son esenciales para comprender el mecanismo molecular de las infecciones.

El entorno informático para los análisis de transcriptomas se creó y configuró en la plataforma Docker. Este enfoque permite a los usuarios principiantes de Linux utilizar sistemas de terminal Linux sin conocimientos de gestión a priori. La plataforma Docker utiliza los recursos del sistema operativo host para crear un contenedor de servicios que incluye herramientas de usuarios específicos (Figura 1B). Se creó un contenedor basado en la distribución Linux OS Ubuntu 20.04 y se config...

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High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

El protocolo presentado aquí describe una tubería completa para analizar los datos del transcriptoma de secuenciación de ARN desde lecturas sin procesar hasta análisis funcionales, incluidos los pasos de control de calidad y preprocesamiento para enfoques analíticos estadísticos avanzados.

Análisis de transcriptoma de alto rendimiento para investigar las interacciones huésped-patógeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Bienvenido al protocolo de análisis de transcriptomas de alto rendimiento para investigar las interacciones huésped-patógeno. Este protocolo se divide en los siguientes pasos. Control de calidad para filtrar lecturas de baja calidad y también para eliminar secuencias adaptadoras Secuenciación y anotaciones, donde hay que mapear las lecturas en genomas de referencia y anotar las lecturas en los genes.Análisis estadístico y de coexpresión, que define los genes expresados diferencialmente y también encuentra los módulos de coexpresión. Análisis del grado molecular de perturbación para encontrar posibles muestras atípicas. Y finalmente, el análisis funcional para determinar las funciones biológicas de los genes expresados diferencialmente.Todas las herramientas que utilizan estas canalizaciones fueron preinstaladas en un sistema Linux y encapsuladas en un contenedor Docker. Las muestras que utilizan estos protocolos derivan de un artículo publicado por nuestro grupo en PLOS Pathogen. Las muestras comprenden 20 personas sanas y 39 pacientes infectados con el virus Chikungunya.Se recogieron las muestras de sangre y se realizó la secuenciación del ARN. Para instalar Docker en el sistema Windows, debe seguir estos pasos. Vaya a la página web oficial de Docker y haga clic en Comenzar.Busque el instalador de Docker Desktop para Windows. Descargue el archivo. Instale localmente en su máquina.Asegúrese de que estas dos opciones estén marcadas. Después de instalar el programa, descarga la imagen de Docker para este protocolo. Vaya al terminal de Windows.Ejecute los comandos para descargar la imagen. Después de descargar la imagen, puede ver el archivo en el escritorio de Docker, y desde esta imagen, podemos iniciar el contenedor. Después de hacer clic en el botón redondo, debe expandir los parámetros y opciones originales para definir el nombre del contenedor y asociar una carpeta en su computadora local con la carpeta dentro de Docker.Después de esto, haga clic en Ejecutar para iniciar el contenedor. A continuación, puede acceder al terminal, que se encuentra en el sistema Linux dentro de Docker. Escriba los comandos bash y, a continuación, podrá ejecutar todos los comandos de este protocolo.Primero, tenemos que ejecutar la fuente para que todas las herramientas de este protocolo estén disponibles. Debe acceder a los scripts del directorio. Para realizar un análisis transcriptómico, primero hay que descargar el genoma de referencia.Para ello, hay que ejecutar los siguientes comandos. Después de descargar el genoma, debe descargar la anotación de los genes. Para ello, tienes que escribir los siguientes comandos.A continuación, debe configurar el fastq-dump. Esto le permite descargar los archivos de secuenciación de los ejemplos. Después de escribir los siguientes comandos, debe usar el botón Tab para ir a la opción Herramientas y marcar el directorio options currents.Utilice los botones Tab para guardar y, a continuación, aceptar. Y luego salga de la herramienta fastq-dump. Ahora podemos iniciar las descargas de las lecturas escribiendo los siguientes comandos.El control de calidad consiste y evalúa gráficamente la probabilidad de errores en las lecturas de secuenciación. En este paso, también debe eliminar las secuencias técnicas, como los adaptadores. Para generar los gráficos de control de calidad, debe ejecutar el programa FastQC.Para quitar las secuencias del adaptador y las secuencias de baja calidad, debe escribir los siguientes comandos. Con las lecturas de buena calidad, ahora tenemos que mapear las lecturas en el genoma de referencia. Después del mapeo, vamos a tener que anotar los genes de acuerdo con los genes humanos y luego contar el número de lecturas que coinciden con cada gen humano.El primer paso es indexar el genoma de referencia escribiendo el siguiente comando. Y luego escribimos estos comandos para mapear las lecturas en el genoma humano. A continuación, debe ejecutar los scripts que anotan las lecturas.Tras el mapeo y la anotación, se puede realizar el análisis de expresión diferencial que consiste en encontrar los genes cuya expresión es mayor o menor en un grupo en comparación con otro. Para identificar los genes expresados diferencialmente, o DEG, debe ejecutar los siguientes comandos. Después de esto, puede transferir los resultados de datos desde Docker a su computadora local.Para ello, vaya al terminal y escriba los siguientes comandos para guardar todos los resultados en una carpeta local. Para realizar el análisis restante, también debe copiar todos los archivos de los datos del directorio en un directorio en su equipo local. En su computadora local, podrá ver los directorios donde guardó los datos de Docker.Como puede ver, puede acceder a todas las bibliotecas. También puede abrir el archivo HTML que contiene los informes de control de calidad. También puede acceder a un directorio que contiene los genes expresados diferencialmente.Y dentro de este directorio, encontrará las gráficas del volcán donde puede ver los genes que están regulados hacia arriba o hacia abajo en un grupo frente a otro, en este caso, pacientes infectados con el virus Chikungunya versus controles sanos. Todos los pasos restantes de este protocolo se ejecutarán en herramientas web utilizando su navegador. Comencemos primero con CEMiTool.Vaya al navegador y escriba la siguiente dirección. CEMiTool identifica módulos de coexpresión a partir de conjuntos de datos de expresiones proporcionados por los usuarios. En la página principal, puede ir al menú y hacer clic en el botón Ejecutar.Esto abrirá una nueva página donde puede cargar el archivo de expresión. Este archivo se encuentra en los datos del directorio del equipo local. Verás que hay tres archivos de expresión, y el que vamos a utilizar para el CEMiTool es una llamada de normalización tmm.Luego debe seleccionar el archivo de fenodatos, lo mismo para el archivo que contiene las interacciones proteína-proteína, y finalmente, cargar el archivo que contiene los conjuntos de genes o vías. El archivo de conjuntos de genes permite a CEMiTool realizar análisis de enriquecimiento para cada uno de los módulos de coexpresión. A continuación, debe expandir la sección de parámetros y hacer clic en Aplicar VST.Después de eso, puede hacer clic en Ejecutar CEMiTool. Después de ejecutar CEMiTool, verá que se identificaron 12 módulos de coexpresión. Haciendo clic aquí, puede descargar todos los resultados de estos análisis.Otra herramienta que vamos a utilizar en este protocolo es MDP, o Grado Molecular de Perturbación. Simplemente escriba en su navegador mdp.sysbio.tools. MDP calcula la distancia molecular de cada muestra en comparación con un grupo de referencia de muestras, en este caso, los controles sanos, con el fin de encontrar no solo valores atípicos potenciales, sino también qué tan perturbadas están cada muestra en comparación con este grupo.En la página Ejecutar, puede cargar el archivo de expresión haciendo clic en el botón y seleccionando el archivo. Luego tienes que subir el archivo phenodata. A continuación, debe definir qué columna contiene la información sobre el grupo o la clase y, a continuación, qué clase o grupo corresponde al grupo de control.Después de esto, puede ejecutar MDP. El gráfico de barras muestra para cada una de las muestras como una barra la puntuación del grado molecular de perturbación, y los colores representan los diferentes grupos. Y el diagrama de caja es otra forma de visualizar los mismos resultados donde se ve en cada punto que es una muestra diferente separada por dos grupos.Para realizar el análisis funcional, vamos a utilizar la herramienta Enrichr. Para esto, debe seleccionar la lista de genes que se expresaron diferencialmente, ya sea regulada hacia arriba o hacia abajo, y usarla como una lista de genes de entrada en la herramienta Enrichr. Verás que hay diferentes pestañas.Todos los resultados también se pueden descargar en su computadora local. El entorno informático para el análisis del transcriptoma se ha colocado en la plataforma Docker. Este enfoque permite a los usuarios sin experiencia previa con el sistema Linux utilizar un terminal.En este contenedor, hay una estructura de carpetas predefinida para el conjunto de datos y los scripts que son necesarios para todo el análisis. En la tubería, los usuarios utilizarán datos de transcriptoma de sangre de 20 individuos sanos y 39 pacientes infectados agudamente con el virus Chikungunya. La plataforma de secuenciación devuelve un conjunto de archivos FASTQ que contienen la secuencia de ADN, es decir,las lecturas y la calidad asociada para cada base de nucleótidos. La escala de calidad de Phred indica la probabilidad de una lectura incorrecta para cada base. Las herramientas identifican y eliminan lecturas de baja calidad de las muestras y aumentan la probabilidad de lecturas de mapeo.En este paso, el módulo de mapeo, las lecturas de alta calidad recuperadas se utilizan como entradas para alinearlas con el genoma humano de referencia. CEMiTool identifica y analiza módulos de coexpresión. Los genes dentro del mismo módulo se coexpresan, lo que significa que exhiben patrones similares de expresión en las muestras de los conjuntos de datos.El análisis de red proporciona información sobre los genes más conectados, es decir, los hubs. Los nombres de esos genes se muestran en la red.El tamaño de los nodos es proporcional a su grado de conectividad. Los resultados obtenidos del análisis DEG se resumieron en las gráficas de volcanes. El análisis del grado molecular de perturbación permite la identificación de muestras perturbadas de individuos sanos e infectados.MDP sugiere qué muestras son valores atípicos biológicos potenciales. La eliminación de esas muestras afectará a los resultados posteriores. Se puede realizar un análisis de enriquecimiento funcional utilizando AURA con la herramienta Enrichr.Estos pasos ayudan a interpretar los resultados al revelar las funciones funcionales comunes de varios genes que se expresaron de manera diferencial. El proceso biológico que se muestra en los gráficos de barras son los 10 mejores conjuntos de genes enriquecidos en función de su clasificación de valor p. En conclusión, estos protocolos cubren todos los pasos del análisis de ARN-Seq.La tubería fue desarrollada y encapsulada en el sistema no comercial llamado Docker. En una imagen y puesta a disposición de la comunidad científica. Debido al sistema de contenedores, todos los scripts y herramientas están bajo la misma versión específica para garantizar la reproducibilidad.Además, partes del análisis bioinformático se realizaron a través de herramientas web gratuitas y fáciles de usar.

Research

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