Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN finansieras av FAPESP (bidragsnummer: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 och 2013/08216-2) och CNPq (313662/2017).
Vi är särskilt tacksamma för följande bidrag till stipendiater: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) och RLTO (CNPq- Process 134204).

De prover som användes i detta protokoll godkändes av de etiska kommittéerna från både institutionen för mikrobiologi vid Institutet för biomedicinska vetenskaper vid universitetet i São Paulo och Federal University of Sergipe (protokoll: 54937216.5.0000.5467 respektive 54835916.2.0000.5546).
1. Installation av Docker-skrivbordet
OBS: Steg för att förbereda Docker-miljön skiljer sig åt mellan operativsystemen (OPERATIVSYSTEM). Därför må...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Förberedelsen av sekvenseringsbiblioteken är ett avgörande steg mot att besvara biologiska frågor på bästa möjliga sätt. Typen av betyg av intresse för studien kommer att vägleda vilken typ av sekvenseringsbibliotek som kommer att väljas och driva bioinformatiska analyser. Till exempel, från sekvenseringen av en patogen och värdinteraktion, enligt typen av sekvensering, är det möjligt att identifiera sekvenser från båda eller bara från värdutskrifterna.
Nästa generations se...

Arbovirus, såsom denguefeber, gula febern, chikungunya och zika, har varit allmänt förknippade med flera endemiska utbrott och har dykt upp som en av de viktigaste patogenerna som är ansvariga för att infektera människor under de senaste decennierna1,2. Individer infekterade med chikungunyaviruset (CHIKV) har ofta feber, huvudvärk, utslag, polyarthralgi och artrit3,4,5. Virus kan undergräva cellens genuttryck och påverka olika värdsignaleringsvägar. Nyligen använde blod transkriptom studier RNA-seq för att identifiera differentiellt uttryckta gener (DEGs) associerade med akut CHIKV infektion i jämförelse med konvalescens6 eller friska kontroller7. CHIKV-infekterade barn hade uppreglerade gener som är involverade i medfödd immunitet, såsom de relaterade till cellulära sensorer för viralt RNA, JAK/STAT-signalering och avgiftsliknande receptorsignaleringsvägar6. Vuxna som var akut infekterade med CHIKV visade också induktion av gener relaterade till medfödd immunitet, såsom de relaterade till monocyter och dendritisk cellaktivering, och antivirala svar7. Signalvägarna berikade med nedreglerade gener inkluderade de relaterade till adaptiv immunitet, såsom T-cellsaktivering och differentiering och anrikning i T- och B-celler7.
Flera metoder kan användas för att analysera transkriptomdata för värd- och patogengener. Ofta börjar RNA-seq biblioteksförberedelser med berikning av mogna poly-A-transkriptioner. Detta steg tar bort det mesta av ribosomal RNA (rRNA) och i vissa fall virala/bakteriella RNAs. Men när den biologiska frågan involverar patogen transkript upptäckt och RNA är sekvenserade oberoende av föregående val, många andra olika transkript kan upptäckas genom sekvensering. Till exempel har subgenomiska mRNAs visat sig vara en viktig faktor för att verifiera svårighetsgraden av sjukdomarna8. Dessutom, för vissa virus som CHIKV och SARS-CoV-2, även poly-A berikade bibliotek genererar virala läsningar som kan användas i nedströms analyser9,10. När forskarna fokuserar på analysen av värdutskriftstomen kan de undersöka den biologiska störtheten mellan prover, identifiera differentiellt uttryckta gener och berikade vägar och generera meduttrycksmoduler7,11,12. Detta protokoll belyser transkriptomanalyser av CHIKV-infekterade patienter och friska individer med olika bioinformatiska metoder (figur 1A). Data från en tidigare publicerad studie7 bestående av 20 friska och 39 CHIKV akut infekterade individer användes för att generera de representativa resultaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Patogener kan orsaka en mängd olika infektionssjukdomar. De biologiska processer som induceras av värden som svar på infektion bestämmer sjukdomens svårighetsgrad. För att studera sådana processer kan forskare använda RNA-seq (high-throughput sekvensering techniques) som mäter de dynamiska förändringarna av värdens transkriptom vid olika stadier av infektion, kliniska resultat eller sjukdomens svårighetsgrad. Denna undersökning kan leda till en bättre förståelse för sjukdomarna, samt avslöja potentiella läkemedelsmål och behandlingar. Protokollet som presenteras här beskriver en komplett pipeline för att analysera RNA-sekvenseringsdata från råa läsningar till funktionell analys. Rörledningen är indelad i fem steg: (1) kvalitetskontroll av data; 2. Kartläggning och anteckning av gener. (3) Statistisk analys för att identifiera differentiellt uttryckta gener och sam uttryckta gener. 4. Bestämning av den molekylära graden av störtheten av prover. och (5) funktionell analys. Steg 1 tar bort tekniska artefakter som kan påverka kvaliteten på nedströms analyser. I steg 2 kartläggs och kommenteras gener enligt standardbiblioteksprotokoll. Den statistiska analysen i steg 3 identifierar gener som uttrycks eller uttrycks med i infekterade prover, i jämförelse med icke-infekterade. Provvariation och förekomsten av potentiella biologiska avvikare verifieras med hjälp av den molekylära graden av störthetsmetod i steg 4. Slutligen visar den funktionella analysen i steg 5 de vägar som är associerade med sjukdomen fenotyp. Den presenterade pipelinen syftar till att stödja forskare genom RNA-seq dataanalys från värdpatogena interaktionsstudier och driva framtida in vitro- eller in vivo-experiment , som är viktiga för att förstå den molekylära mekanismen för infektioner.

Datormiljön för transkriptomanalyser skapades och konfigurerades på Docker-plattformen. Den här metoden gör det möjligt för nybörjare Linux-användare att använda Linux-terminalsystem utan a priori-hanteringskunskap. Docker-plattformen använder resurserna i värd operativ systemet för att skapa en tjänst behållare som innehåller specifika användares verktyg (bild 1B). En behållare baserad på Linux OS Ubuntu 20.04-distribution skapades och den var helt konfigurerad för trans...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Protokollet som presenteras här beskriver en komplett pipeline för att analysera RNA-sekvensering transkriptomdata från råa läsningar till funktionell analys, inklusive kvalitetskontroll och förbearbetning steg till avancerade statistiska analytiska metoder.

Transkriptomanalys med hög genomströmning för att undersöka värdpatogeninteraktioner

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Välkommen till protokollet för transkriptomanalys med hög genomströmning för att undersöka värdpatogena interaktioner. Det här protokollet är uppdelat i följande steg. Kvalitetskontroll för att filtrera läsningar av låg kvalitet och även för att ta bort adaptersekvenser Sekvensering och anteckningar, var måste du mappa läsningarna till ett referensgenom och kommentera avläsningarna i generna.Statistisk analys och samuttrycksanalys, som definierar de differentiellt uttryckta generna och även hittar meduttrycksmodulerna. Molekylär grad av störtsam analys för att hitta potentiella avvikande prover. Och slutligen den funktionella analysen för att bestämma de biologiska funktionerna hos differentiellt uttryckta gener.Alla verktyg som använder dessa pipelines var förinstallerade i ett Linux-system och inkapslade i en Docker-behållare. Proverna som använder dessa protokoll härrör från en artikel publicerad av vår grupp i PLOS Pathogen. Proverna består av 20 friska personer och 39 patienter infekterade med Chikungunya virus.Blodproverna samlades in och RNA sekvensering utfördes. Om du vill installera Docker i Windows-systemet måste du följa dessa steg. Gå till Dockers officiella webbsida och klicka i Kom igång.Leta reda på installationsprogrammet för Docker Desktop för windows. Ladda ner filen. Installera lokalt i datorn.Se till att dessa två alternativ är markerade. När du har installerat programmet hämtar du Docker-avbildningen för det här protokollet. Gå till Windows-terminalen.Kör kommandona för att hämta bilden. När du har laddat ner avbildningen kan du se filen i Docker-skrivbordet, och från den här avbildningen kan vi initiera behållaren. När du har klickat på den runda knappen måste du expandera de ursprungliga parametrarna och alternativen för att definiera namnet på behållaren och associera en mapp i den lokala datorn med mappen i Docker.Därefter klickar du i Kör för att initiera behållaren. Du kan sedan komma åt terminalen, som finns i Linux-systemet inuti Docker. Skriv bash-kommandona så kan du köra alla kommandon i det här protokollet.Först måste vi köra källan för att göra alla verktyg i detta protokoll tillgängliga. Du bör komma åt katalogskripten. För att utföra en transkriptomisk analys måste du först ladda ner referensgenomet.För detta måste du köra följande kommandon. När genomet har laddats ner måste du ladda ner anteckningen av generna. För att göra detta måste du skriva följande kommandon.Därefter måste du konfigurera fastq-dumpen. Detta gör att du kan ladda ner sekvenseringsfilerna i exemplen. När du har skrivit följande kommandon måste du använda tabbknappen för att gå till alternativet Verktyg och markera katalogen alternativströmmar.Använd tabbknapparna för att spara och sedan ok. Och sedan lämna verktyget fastq-dump. Nu kan vi initiera nedladdningarna av läsningarna genom att skriva följande kommandon.Kvalitetskontroll består och utvärderar grafiskt sannolikheten för fel i sekvenseringen läser. I det här steget måste du också ta bort de tekniska sekvenserna, till exempel adaptrar. För att generera kvalitetskontrolldiagrammen måste du köra FastQC-programmet.Om du vill ta bort adaptersekvenserna och lågkvalitativa sekvenserna måste du skriva följande kommandon. Med avläsningarna av god kvalitet måste vi nu kartlägga avläsningarna i referensgenomet. Efter kartläggningen måste vi kommentera generna enligt de mänskliga generna och sedan räkna antalet avläsningar som matchar varje mänsklig gen.Det första steget är att indexera referensgenomet genom att skriva följande kommando. Och sedan skriver vi dessa kommandon för att kartlägga läsningarna i det mänskliga genomet. Därefter bör du köra skripten som kommenterar läsningarna.Efter mappning och anteckning kan du utföra den differentialuttrycksanalys som den består i att hitta de gener vars uttryck är högre eller lägre i en grupp jämfört med en annan. För att identifiera de differentiellt uttryckta generna, eller DEGs, måste du köra följande kommandon. Därefter kan du överföra dataresultaten från Docker till din lokala dator.För detta går du till terminalen och skriver följande kommandon för att spara alla resultat i en lokal mapp. För att utföra den återstående analysen måste du också kopiera alla filer i katalogdata till en katalog på den lokala datorn. I den lokala datorn kan du se katalogerna där du sparade data från Docker.Som du kan se kan du komma åt alla bibliotek. Du kan också öppna HTML-filen som innehåller kvalitetsrapporterna. Du kan också komma åt en katalog som innehåller de differentiellt uttryckta generna.Och inuti denna katalog hittar du vulkanområdena där du kan se generna som är upp- eller nedreglerade i den ena gruppen kontra en annan, i det här fallet patienter infekterade med Chikungunya-virus kontra friska kontroller. Alla återstående steg i detta protokoll kommer att utföras i webbverktyg med din webbläsare. Låt oss börja med CEMiTool.Gå till webbläsaren och skriv följande adress. CEMiTool identifierar meduttrycksmoduler från uttrycksdatauppsättningar som tillhandahålls av användarna. På startsidan kan du gå till menyn och klicka på knappen Kör.Detta öppnar en ny sida där du kan ladda upp uttrycksfilen. Den här filen finns i katalogdata på den lokala datorn. Du kommer att se att det finns tre uttrycksfiler, och den som vi kommer att använda för CEMiTool är ett normaliseringssamtal tmm.Då måste du välja fenodatafilen, samma sak för filen som innehåller protein-proteininteraktioner, och slutligen ladda upp filen som innehåller genuppsättningarna eller vägarna. Genuppsättningsfilen gör det möjligt för CEMiTool att utföra anrikningsanalys för var och en av meduttrycksmodulen. Därefter bör du expandera parameteravsnittet och klicka i Använd VST.Därefter kan du bara klicka på Kör CEMiTool. När du har kört CEMiTool ser du att 12 meduttrycksmoduler identifierades. Genom att klicka här kan du ladda ner alla resultat av denna analys.Ett annat verktyg som vi kommer att använda i detta protokoll är MDP, eller Molekylär grad av perturbation. Skriv bara in din webbläsare mdp.sysbio.tools. MDP beräknar det molekylära avståndet för varje prov jämfört med en referensgrupp av prover, i detta fall de friska kontrollerna, för att hitta inte bara potentiella avvikande värden utan också hur störda varje prov är jämfört med denna grupp.På sidan Kör kan du bara ladda upp uttrycksfilen genom att klicka på knappen och välja filen. Då måste du ladda upp fenodatafilen. Sedan måste du definiera vilken kolumn som innehåller informationen om gruppen eller klassen och sedan vilken klass eller grupp som motsvarar kontrollgruppen.Efter detta kan du bara köra MDP. Stapeldiagrammet visar för vart och ett av proverna som en stapel poängen för molekyl graden av störthet, och färgerna representerar de olika grupperna. Och rutadiagrammet är ett annat sätt att visualisera samma resultat där du ser på varje prick är ett annat exempel separat av två grupper.För att utföra den funktionella analysen kommer vi att använda enrichrverktyget. För detta måste du välja listan över gener som uttrycktes differentiellt, antingen upp- eller nedreglerade, och använda den som en indatagenlista i Enrichr-verktyget. Du kommer att se att det finns olika flikar.Alla resultat kan också laddas ner till din lokala dator. Datormiljön för transkriptomanalys har placerats på Docker-plattformen. Den här metoden gör det möjligt för användare utan tidigare erfarenhet av Linux-system att använda en terminal.I den här behållaren finns det en fördefinierad mappstruktur för datauppsättningar och skript som är nödvändiga för all analys. I pipelinen kommer användare att använda blod transkriptomdata från 20 friska individer och 39 patienter akut infekterade med Chikungunya virus. Sekvenseringsplattformen returnerar en uppsättning FASTQ-filer som innehåller DNA-sekvensen, dvs.läsningarna och den tillhörande kvaliteten för varje nukleotidbas. Phreds kvalitetsskala anger sannolikheten för en felaktig avläsning för varje bas. Verktyg identifierar och tar bort läsningar av låg kvalitet från exempel och för att öka sannolikheten för mappningsläsningar.I det här steget, mappningsmodulen, används de högkvalitativa avläsningar som återställs som indata för att anpassa dem mot det mänskliga referensgenomet. CEMiTool identifierar och analyserar meduttrycksmoduler. Gener inom samma modul uttrycks samtidigt, vilket innebär att de uppvisar liknande uttrycksmönster i de datamängdernas prover.Nätverksanalysen ger information om de mest anslutna generna, det vill säga naven. Namnen på dessa gener visas i nätverket.Nodernas storlek står i proportion till dess anslutningsgrad. Resultaten från DEG-analysen sammanfattades i vulkanens tomter. Analysen av den molekylära graden av störthet tillåter identifiering av störda prover från friska och infekterade individer.MDP föreslår vilka prover som är potentiella biologiska avvikande värden. Om du tar bort dessa prover kommer resultaten nedströms att påverkas. En funktionell anrikningsanalys med AURA kan utföras med Enrichr-verktyget.Dessa steg hjälper till att tolka resultaten genom att avslöja gemensamma funktionella roller för flera gener som uttrycktes differentiellt. Den biologiska processen som visas i stapeldiagrammen är de 10 bästa berikade genuppsättningarna baserat på deras p-värderankning. Sammanfattningsvis täcker dessa protokoll alla steg i RNA-Seq-analysen.Rörledningen utvecklades och kapslades in i det icke-kommersiella systemet Med namnet Docker. På en bild och tillgängliggjord för forskarsamhället. På grund av behållar systemet är alla skript och verktyg under samma specifika version för att garantera reproducerbarhet.Dessutom utfördes delar av bioinformatikanalysen via kostnadsfria användarvänliga webbverktyg.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Hög genomströmning Gene taggning i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metod för kvalitativ Multi-skala Analys av bakteriell Biofilmer på rådiga svampkolonier Använda Confocal och elektronmikroskopi

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...