Name: high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

HN, FAPESP tarafından finanse edilmektedir (hibe numaraları: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 ve 2013/08216-2) ve CNPq (313662/2017-7).
Özellikle bursiyerler için aşağıdaki hibelere minnettarız: ANAG (FAPESP Süreci 2019/13880-5), VEM (FAPESP Süreci 2019/16418 -0), IMSC (FAPESP Süreci 2020/05284-0), APV (FAPESP Süreci 2019/27146-1) ve, RLTO (CNPq Süreci 134204/2019-0).

Bu protokolde kullanılan örnekler, hem São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Mikrobiyoloji Bölümü hem de Sergipe Federal Üniversitesi etik kurulları tarafından onaylanmıştır (Protokoller: 54937216.5.0000.5467 ve 54835916.2.0000.5546).
1. Docker masaüstü kurulumu
NOT: Docker ortamını hazırlama adımları işletim sistemleri (işletim sistemleri) arasında farklıdır. Bu nedenle, Mac kullanıcıları 1.1 olarak liste...

<ol>
	<li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+Chikungunya,+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases.">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li><li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus:+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen.">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li><li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus-associated+disease.">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69 (2017).</li><li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -. C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthritogenic+alphaviruses-an+overview.">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li><li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis.">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li><li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases.">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862 (2018).</li><li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus.">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880 (2019).</li><li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication.">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059 (2020).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features.">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li><li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation.">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155 (2017).</li><li>Gon&#231;alves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool.">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971 (2019).</li><li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEMiTool:+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses.">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56 (2018).</li><li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+differential+expression+analysis:+An+extended+review+and+a+software+tool.">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152 (2017).</li><li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies.">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li><li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis.">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, (2005).</li><li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data.">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975 (2020).</li><li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=webCEMiTool:+Co-expression+modular+analysis+made+easy.">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146 (2019).</li><li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination.">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li><li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications.">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999 (2017).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool.">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128 (2013).</li><li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichr:+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update.">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li><li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=g:Profiler:+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+(2019+update).">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li><li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq:+accounting+for+selection+bias.">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14 (2010).</li></ol>

Sıralama kütüphanelerinin hazırlanması, biyolojik soruları mümkün olan en iyi şekilde yanıtlamak için çok önemli bir adımdır. Çalışmanın ilgi çekici transkriptlerinin türü, hangi sıralama kütüphanesinin seçileceğine rehberlik edecek ve biyoinformatik analizleri yönlendirecektir. Örneğin, bir patojen ve konak etkileşiminin dizileninden, sıralama türüne göre, her ikisinden de veya yalnızca ana bilgisayar transkriptlerinden dizileri tanımlamak mümkündür.
Ye...

Dang humması, sarıhumma, chikungunya ve zika gibi arbovirüsler, çeşitli endemik salgınlarla yaygın olarak ilişkilendirilmiştir ve son on yıllarda insanlara bulaştırmaktan sorumlu ana patojenlerden biri olarak ortaya çıkmıştır1,2. Chikungunya virüsü (CHIKV) ile enfekte olan bireylerde sıklıkla ateş, baş ağrısı, döküntü, poliartralji ve artrit3,4,5 vardır. Virüsler hücrenin gen ekspresyonunu alt edebilir ve çeşitli konak sinyal yollarını etkileyebilir. Son zamanlarda, kan transkriptom çalışmaları, iyileşme6 veya sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında akut CHIKV enfeksiyonu ile ilişkili farklı olarak ifade edilen genleri (DEG' ler) tanımlamak için RNA-seq'i kullanmıştır7. CHIKV ile enfekte olmuş çocuklarda, viral RNA için hücresel sensörler, JAK/STAT sinyali ve toll benzeri reseptör sinyal yolları6 gibi doğuştan gelen bağışıklıkta yer alan yukarı düzenlenmiş genler vardı6. CHIKV ile akut olarak enfekte olan yetişkinler de monositler ve dendritik hücre aktivasyonu ile ilgili olanlar ve antiviral yanıtlar gibi doğuştan gelen bağışıklıkla ilgili genlerin indüksiyonunu gösterdi7. Aşağı düzenlenmiş genlerle zenginleştirilmiş sinyal yolları, T hücre aktivasyonu ve T ve B hücrelerinde farklılaşma ve zenginleştirme gibi uyarlanabilir bağışıklıkla ilgili olanları içeriyordu7.
Konak ve patojen genlerinin transkriptom verilerini analiz etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Genellikle, RNA-seq kütüphane hazırlığı olgun poli-A transkriptlerinin zenginleştirilmesi ile başlar. Bu adım ribozomal RNA'nın (rRNA) çoğunu ve bazı durumlarda viral/bakteriyel RNA'ları giderir. Bununla birlikte, biyolojik soru patojen transkript tespitini içerdiğinde ve RNA önceki seçimden bağımsız olarak sıralandığında, sıralama ile diğer birçok farklı transkript tespit edilebilir. Örneğin, subgenomik mRNA'ların hastalıkların şiddetini doğrulamak için önemli bir faktör olduğu gösterilmiştir8. Ek olarak, CHIKV ve SARS-CoV-2 gibi bazı virüsler için, poli-A zenginleştirilmiş kütüphaneler bile aşağı akış analizlerinde kullanılabilecek viral okumalar oluşturur9,10. Konak transkriptom analizine odaklandıklarında, araştırmacılar örnekler arasındaki biyolojik pertürbasyonu araştırabilir, farklı olarak ifade edilen genleri ve zenginleştirilmiş yolları tanımlayabilir ve ortak ifade modülleri oluşturabilir7,11,12. Bu protokol, CHIKV ile enfekte olmuş hastaların ve sağlıklı bireylerin farklı biyoinformatik yaklaşımlar kullanılarak yapılan transkriptom analizlerini vurgulamaktadır (Şekil 1A). Daha önce yayınlanan bir çalışmadan elde edilen veriler7, temsili sonuçları oluşturmak için 20 sağlıklı ve 39 CHIKV akut enfekte bireyden oluşan bir çalışmadan kullanıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.12.2</td>
			<td>Discovery and the analysis of co-expression gene modules in a fully automatic manner, while providing a user-friendly HTML report with high-quality graphs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdgeR</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td>
			<td>3.30.3</td>
			<td>Differential expression analysis of RNA-seq expression profiles with biological replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnhancedVolcano</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td>
			<td>1.6.0</td>
			<td>Publication-ready volcano plots with enhanced colouring and labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>Babraham Bioinformatics</td>
			<td>0.11.9</td>
			<td>Aims to provide a simple way to do some quality control checks on raw sequence data coming from high throughput sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeatureCounts</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.0.0</td>
			<td>Assign mapped sequencing reads to specified genomic features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>1.8.0</td>
			<td>Molecular Degree of Perturbation calculates scores for transcriptome data samples based on their perturbation from controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R</td>
			<td>R Core Group</td>
			<td>4.0.3</td>
			<td>Programming language and free software environment for statistical computing and graphics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR</td>
			<td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td>
			<td>2.7.6a</td>
			<td>Aligner designed to specifically address many of the challenges of RNA-seq data mapping using a strategy to account for spliced alignments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie2</td>
			<td>Johns Hopkins University</td>
			<td>2.4.2</td>
			<td>Ultrafast and memory-efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>THE USADEL LAB</td>
			<td>0.39</td>
			<td>Trimming adapter sequence tasks for Illumina paired-end and single-ended data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker</td>
			<td>Docker</td>
			<td>20.10.2</td>
			<td>Create a bioinformatic environment reproducible and predictable (https://docs.docker.com/get-docker/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSL2-Kernel</td>
			<td>Windows</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Get Docker Linux</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docker Linux Repository</td>
			<td>Docker</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDP Website</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://mdp.sysbio.tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrichr Website</td>
			<td>MaayanLab</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>webCEMiTool</td>
			<td>Computational Systems Biology Laboratory</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://cemitool.sysbio.tools/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gProfiler</td>
			<td>Bioinformatics, Algorithmics and Data Mining Group</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goseq</td>
			<td>Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA NCBI study</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput transcriptome analysis for investigating host-pathogen interactions

Patojenler çok çeşitli bulaşıcı hastalıklara neden olabilir. Konağın enfeksiyona yanıt olarak indüklediği biyolojik süreçler hastalığın şiddetini belirler. Bu tür süreçleri incelemek için araştırmacılar, konak transkriptomunun enfeksiyon, klinik sonuçlar veya hastalık şiddetinin farklı aşamalarında dinamik değişikliklerini ölçen yüksek verimli sıralama tekniklerini (RNA-seq) kullanabilirler. Bu araştırma, hastalıkların daha iyi anlaşılmasının yanı sıra potansiyel ilaç hedeflerini ve tedavilerini ortaya çıkarmaya yol açabilir. Burada sunulan protokol, RNA sıralama verilerini ham okumalardan işlevsel analize analiz etmek için tam bir işlem hattını açıklar. İşlem hattı beş adıma ayrılmıştır: (1) verilerin kalite kontrolü; (2) genlerin haritalanması ve ek açıklaması; (3) farklı ifade edilen genleri ve birlikte ifade edilen genleri tanımlamak için istatistiksel analiz; (4) numunelerin pertürbasyonunun moleküler derecesinin belirlenmesi; ve (5) fonksiyonel analiz. Adım 1, aşağı akış analizlerinin kalitesini etkileyebilecek teknik yapıtları kaldırır. 2. adımda genler standart kütüphane protokollerine göre eşlenir ve açıklama eklenir. 3. adımdaki istatistiksel analiz, enfekte olmayanlara kıyasla, enfekte örneklerde farklı olarak ifade edilen veya birlikte ifade edilen genleri tanımlar. Örnek değişkenliği ve potansiyel biyolojik aykırılıkların varlığı, 4. Son olarak, 5. Sunulan boru hattı, araştırmacıları konak-patojen etkileşim çalışmalarından elde edilen RNA-seq veri analizi yoluyla desteklemeyi ve enfeksiyonların moleküler mekanizmasını anlamak için gerekli olan gelecekteki in vitro veya in vivo deneyleri yönlendirmeyi amaçlamaktadır.

Transkriptom analizleri için bilgi işlem ortamı Docker platformunda oluşturulmuş ve yapılandırılmıştır. Bu yaklaşım, yeni başlayan Linux kullanıcılarının linux terminal sistemlerini priori yönetim bilgisi olmadan kullanmalarını sağlar. Docker platformu, belirli kullanıcıların araçlarını içeren bir hizmet kapsayıcısı oluşturmak için ana işletim sistemi kaynaklarını kullanır (Şekil 1B). Linux OS Ubuntu 20.04 dağıtımına dayalı bir konteyner oluşturul...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Burada sunulan protokol, RNA dizilimi transkriptom verilerini ham okumalardan fonksiyonel analize analiz etmek için kalite kontrolü ve gelişmiş istatistiksel analitik yaklaşımlara yönelik ön işleme adımları da dahil olmak üzere eksiksiz bir işlem hattını açıklar.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için yüksek verimli transkriptom analizi protokolüne hoş geldiniz. Bu iletişim kuralı aşağıdaki adımlara ayrılmıştır. Düşük kaliteli okumaları filtrelemek ve ayrıca bağdaştırıcı dizilerini sıralama ve ek açıklamaları kaldırmak için kalite kontrolü, okumaları bir referans genomlarına eşlemeniz ve okumaları genlere açıklama eklemeniz gerekir.Farklı olarak ifade edilen genleri tanımlayan ve aynı zamanda birlikte ifade modüllerini bulan istatistiksel ve birlikte ifade analizi. Potansiyel aykırı örnekleri bulmak için moleküler pertürbasyon analizi derecesi. Ve son olarak, farklı olarak ifade edilen genlerin biyolojik fonksiyonlarını belirlemek için fonksiyonel analiz.Bu işlem hatlarını kullanan tüm araçlar bir Linux sistemine önceden yüklenmiş ve bir Docker kapsayıcısına kapsüllenmiştir. Plos Patojen'de grubumuz tarafından yayınlanan bir makaleden elde edilen bu protokolleri kullanan örnekler. Örnekler 20 sağlıklı insan ve Chikungunya virüsü ile enfekte olmuş 39 hastadan oluşmaktadır.Kan örnekleri toplandı ve RNA dizilimi yapıldı. Docker'ı Windows sistemine yüklemek için şu adımları izlemeniz gerekir. Docker'ın resmi web sayfasına gidin ve Başlarken'e tıklayın.Pencereler için Docker Desktop yükleyicisini bulun. Dosyayı indirin. Makinenize yerel olarak yükleyin.Bu iki seçeneğin işaretli olduğundan emin olun. Programı yükledikten sonra, bu iletişim kuralı için Docker görüntüsünü indirir. Windows terminaline gidin.Görüntüyü indirmek için komutları yürütün. Görüntüyü indirdikten sonra, dosyayı Docker masaüstünde görebilirsiniz ve bu görüntüden kapsayıcıyı başlatabiliriz. Yuvarlak düğmeyi tıklattıktan sonra, kapsayıcının adını tanımlamak ve yerel bilgisayarınızdaki bir klasörü Docker içindeki klasörle ilişkilendirmek için özgün parametreleri ve seçenekleri genişletmeniz gerekir.Bundan sonra, kapsayıcıyı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. Daha sonra Docker içindeki Linux sisteminde bulunan terminale erişebilirsiniz. Bash komutlarını yazın ve sonra bu iletişim kuralının tüm komutlarını yürütebilirsiniz.İlk olarak, bu protokolün tüm araçlarını kullanılabilir hale getirmek için kaynağı yürütmeliyiz. Dizin komut dosyalarına erişmelisiniz. Transkriptomik analiz yapmak için önce referans genomu indirmeniz gerekir.Bunun için aşağıdaki komutları yürütmeniz gerekir. Genom indirildikten sonra, genlerin ek açıklamalarını indirmeniz gerekir. Bunu yapmak için aşağıdaki komutları yazmanız gerekir.Ardından, fastq dökümünü yapılandırmanız gerekir. Bu, örneklerin sıralama dosyalarını indirmenize olanak sağlar. Aşağıdaki komutları yazdıktan sonra, Araçlar seçeneğine gitmek ve seçenekler currents dizinini işaretlemek için Sekme düğmesini kullanmanız gerekir.Kaydetmek için Sekme düğmelerini kullanın ve tamam. Ve sonra araçtan fastq-dump çıkın. Artık aşağıdaki komutları yazarak okumaların indirilmesini başlatabiliriz.Kalite kontrolü oluşur ve sıralama okumalarında hata olasılığını grafiksel olarak değerlendirir. Bu adımda, bağdaştırıcılar gibi teknik sıraları da kaldırmanız gerekir. Kalite kontrol grafiklerini oluşturmak için FastQC programını çalıştırmanız gerekir.Bağdaştırıcı sıralarını ve düşük kaliteli sıraları kaldırmak için aşağıdaki komutları yazmanız gerekir. Kaliteli okumalarla, okumaları referans genomuna eşlememiz gerekiyor. Haritalamadan sonra, genlere insan genlerine göre açıklama eklememiz ve sonra her insan geniyle eşleşen okuma sayısını saymamız gerekecek.İlk adım, aşağıdaki komutu yazarak başvuru genomunu dizine almaktır. Ve sonra bu komutları yazıp okumaları insan genomuna eşleyeceğiz. Daha sonra, okumalara açıklama getiren komut dosyalarını çalıştırmalısınız.Haritalama ve ek açıklama yapıldıktan sonra, ifadesi bir grupta diğerine kıyasla daha yüksek veya daha düşük olan genleri bulmaktan oluşan diferansiyel ifade analizini gerçekleştirebilirsiniz. Farklı şekilde ifade edilen genleri veya DEG'leri tanımlamak için aşağıdaki komutları çalıştırmanız gerekir. Bundan sonra, veri sonuçlarını Docker'dan yerel bilgisayarınıza aktarabilirsiniz.Bunun için terminale gidin ve tüm sonuçları yerel bir klasöre kaydetmek için aşağıdaki komutları yazın. Kalan çözümlemeyi gerçekleştirmek için, dizin verilerinin tüm dosyalarını yerel bilgisayarınızdaki bir dizine de kopyalamanız gerekir. Yerel bilgisayarınızda, Verileri Docker'dan kaydettiğiniz dizinleri görebileceksiniz.Gördüğünüz gibi, tüm kütüphanelere erişebilirsiniz. Kalite kontrol raporlarını içeren HTML dosyasını da açabilirsiniz. Farklı olarak ifade edilen genleri içeren bir dizine de erişebilirsiniz.Ve bu dizinin içinde, bir grupta yukarı veya aşağı doğru kontrol edilen genleri görebileceğiniz volkan arazilerini bulacaksınız, bu durumda, Chikungunya virüsü ile enfekte olan hastalar sağlıklı kontrollere karşı. Bu protokolün kalan tüm adımları tarayıcınız kullanılarak web araçlarında yürütülecektir. Önce CEMiTool ile başlayalım.Tarayıcıya gidin ve aşağıdaki adresi yazın. CEMiTool, kullanıcılar tarafından sağlanan ifade veri kümelerinden ortak ifade modüllerini tanımlar. Ana sayfada, menüye gidebilir ve Çalıştır düğmesine tıklayabilirsiniz.Bu, ifade dosyasını karşıya yükleyebileceğiniz yeni bir sayfa açacaktır. Bu dosya yerel bilgisayarınızın dizin verilerindedir. Orada üç ifade dosyası göreceksiniz ve CEMiTool için kullanacağımız bir normalleşme çağrısı tmm.Daha sonra protein-protein etkileşimlerini içeren dosya için aynı şey olan fenodata dosyasını seçmeniz ve son olarak gen kümelerini veya yolları içeren dosyayı yüklemeniz gerekir. Gen kümeleri dosyası, CEMiTool'un ortak ifade modülünün her biri için zenginleştirme analizi gerçekleştirmesini sağlar. Ardından, parametre bölümünü genişletmeli ve VST Uygula'yı tıklatmalısınız.Bundan sonra, CEMiTool Çalıştır'ı tıklamanız yeterlidir. CEMiTool'u çalıştırdıktan sonra, 12 ortak ifade modülünin tanımlandığını göreceksiniz. Buraya tıklayarak, bu analizin tüm sonuçlarını indirebilirsiniz.Bu protokolde kullanacağımız bir diğer araç MDP veya Moleküler Pertürbasyon Derecesidir. Tarayıcınız mdp.sysbio.tools yazın. MDP, her numunenin moleküler mesafesini bir örnek referans grubuna kıyasla hesaplar, bu durumda, sağlıklı kontroller, sadece potansiyel aykırı değerleri değil, aynı zamanda her numunenin bu gruba kıyasla ne kadar rahatsız olduğunu bulmak için.Çalıştır sayfasında, düğmeyi tıklatıp dosyayı seçerek ifade dosyasını karşıya yükleyebilirsiniz. Ardından fenodata dosyasını yüklemeniz gerekir. Daha sonra hangi sütunun grup veya sınıf hakkındaki bilgileri içerdiğini ve sonra hangi sınıf veya grubun denetim grubuna karşılık geldiğini tanımlamanız gerekir.Bundan sonra, sadece MDP çalıştırabilirsiniz. Çubuk grafik, örneklerin her biri için moleküler pertürbasyon derecesini bir çubuk olarak gösterir ve renkler farklı grupları temsil eder. Ve kutu çizimi, her noktada gördüğünüz aynı sonuçları görselleştirmenin başka bir yoludur, iki gruba göre ayrı farklı bir örnektir.İşlevsel analizi gerçekleştirmek için Enrichr aracını kullanacağız. Bunun için, farklı olarak ifade edilen genlerin listesini seçmeniz, yukarı veya downregüle edilmiş olması ve Enrichr aracında bir giriş gen listesi olarak kullanmanız gerekir. Farklı sekmeler olduğunu göreceksiniz.Tüm sonuçlar yerel bilgisayarınıza da indirilebilir. Transkriptom analizi için bilgisayar ortamı Docker platformuna yerleştirildi. Bu yaklaşım, Linux sistemiyle önceden deneyimi olmayan kullanıcıların bir terminal kullanmasına olanak tanır.Bu kapsayıcıda, tüm çözümleme için gerekli olan veri kümesi ve komut dosyaları için önceden tanımlanmış bir klasör yapısı vardır. Boru hattında, kullanıcılar Chikungunya virüsü ile akut olarak enfekte olan 20 sağlıklı birey ve 39 hastanın kan transkriptom verilerini kullanacaklar. Sıralama platformu, DNA dizisini içeren bir dizi FASTQ dosyası döndürür, yani.okur ve her nükleotid tabanı için ilişkili kalite. Phred kalite ölçeği, her taban için yanlış okuma olasılığını gösterir. Araçlar, örneklerden düşük kaliteli okumaları tanımlar ve kaldırır ve okuma eşleme olasılığını artırır.Bu adımda, haritalama modülü, kurtarılan yüksek kaliteli okumalar, onları insan referans genomuna hizalamak için giriş olarak kullanılır. CEMiTool, birlikte ifade modüllerini tanımlar ve analiz eder. Aynı modüldeki genler birlikte ifade edilir, bu da veri kümelerinin örnekleri arasında benzer ifade kalıpları sergiledikleri anlamına gelir.Ağ analizi, en bağlı genler, yani hub'lar hakkında bilgi sağlar. Bu genlerin isimleri ağda gösterilir.Düğümlerin boyutu bağlantı derecesiyle orantılıdır. DEG analizinden elde edilen sonuçlar volkan arazilerinde özetlenmiştir. Pertürbasyonun moleküler derecesinin analizi, sağlıklı ve enfekte bireylerden gelen pertürbed örneklerin tanımlanmasına izin eder.MDP, hangi örneklerin potansiyel biyolojik aykırılıklar olduğunu öne sürmemektedir. Bu örneklerin kaldırılması aşağı akış sonuçlarını etkileyecektir. Enrichr aracı ile AURA kullanılarak fonksiyonel bir zenginleştirme analizi yapılabilir.Bu adımlar, farklı olarak ifade edilen birkaç genin ortak fonksiyonel rollerini ortaya çıkararak sonuçları yorumlamaya yardımcı olur. Çubuk grafiklerde gösterilen biyolojik süreç, p-değer sıralamasına göre en iyi 10 zenginleştirilmiş gen kümesidir. Sonuç olarak, bu protokoller RNA-Seq analizinin tüm adımlarını kapsar.Boru hattı geliştirildi ve Docker adlı ticari olmayan sisteme kapsüllendi. Bir görüntüde ve bilim camiası için kullanılabilir hale getirildi. Kapsayıcı sistemi nedeniyle, tüm komut dosyaları ve araçlar tekrarlanabilirliği garanti etmek için aynı belirli sürüm altındadır.Ayrıca biyoinformatik analizinin bazı bölümleri ücretsiz kullanıcı dostu web araçları ile gerçek gerçekleştirildi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...