Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

نود أن نشكر السيد باولو ماتيوسي والسيد جورج سميث لتوفير الأنسجة المريضة. كما أننا ممتنون للآنسة أمبر روز ستافورد لمساعدتها في جمع الأنسجة ونداء ديزي لتوفير مرافق المختبر.

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول التجريبي، نقوم بوصف طريقة محسنة لتقييم إغلاق الجرح في جلد الجسم الحي الخارجي البشري باستخدام تلطيخ الأنسجة الكاملة التركيب. هذا هو مورد مهم للسماح بإجراء تقييم نقدي لعلاجات الجروح المحتملة، وتوفير فهم أفضل للاستجابة لإصلاح الجرح البشري. لقد نشرنا تقييم الشفاء في الجروح الجلد في الجسم الحي السابق12,13, ولكن في هذه التقارير لم يستخدم نهج تلطيخ جبل كامل لقياس إغلاق الجروح. تلطيخ كامل جبل أسهل بكثير ويتطلب خبرة تقنية أقل من علم الأنسجة القياسية، والذي ينطوي على البارافين أو أكتوبر تضمين وتقسم العينات. كما يقلل إجراء التركيب الكامل من التباين التجريبي، مما يسمح بتحديد كمي للجرح بأكمله وليس مجرد مقطع عرضي واحد في موضع محدد داخل الأنسجة (انظر الشكل 4B للحصول على توضيح مقارن). ونحن نؤيد تماما أهمية تحديد كميا الشفاء من كامل بنية الجرح غير متناظرة، كما هو موضح بوضوح من قبل ريا ودونوالد للجروح الحادة مورين14. أظهر هؤلاء المؤلفون أهمية القسمة المتسلسلة في الجروح الطاردة في الجسم الحي للقياسات القابلة للاستنساخ والدقيقة لمورفولوجيا الجروح. ويمكن تطبيق الأقسام المتسلسلة على الجروح البشرية في الجسم الحي؛ ومع ذلك ، من أجل التحديد الكمي الدقيق لإغلاق الجرح وإعادة الظهارة ، يجب أن يكون تلطيخ التركيب الكامل عالي الإنتاجية هو الطريقة المفضلة. نلاحظ أن هذا البروتوكول تلطيخ كامل جبل ينبغي أيضا أن تكون متوافقة مع المعالجة اللاحقة (الشمع أو أكتوبر) للتحليل النسيجي التقليدي.
تلطيخ كامل جبل لا يخلو من العيوب. في حين أنه يوفر أعلى استنساخ في تجارب التئام الجروح، فإنه لا يتطلب استخدام المزيد من الأنسجة للتحليل من التقنيات النسيجية القياسية. قد تكون هذه مشكلة حيث يكون الوصول إلى الأنسجة محدودا ، خاصة عندما تحتاج الأجسام المضادة المتعددة إلى تقييم. وهناك نهج بديل هو استخدام طريقة الجرح شقي حيث عرض الجرح موحدة نسبيا ويتم تقليل التباين (كما هو مبين في الماوس والجروح البشرية15،16). ومع ذلك ، تظل الجروح الإستئصالية أكثر قابلية للتطبيق على معظم أنواع الجروح المرضية17.
في هذه الدراسة، تم إنشاء 2 مم جروح سمك جزئي داخل مركز 6 ملم الجلد explants. قد يكون الأمثل لهذه الطريقة للجرح استئصالي بديل وأحجام explant في أعماق الجلد المختلفة18. بالإضافة إلى ذلك، فإن القوة المطلوبة لتوليد الجروح تختلف بين المتبرعين، حيث تتطلب البشرة المسنة قوة أقل للخزعة. ونحن أيضا تجنب استخدام الجلد عرض علامات التمدد البارزة أو غيرها من التعديلات الهيكلية. لقد قمنا بالتحقق من صحة مجموعة من الأجسام المضادة للنظر في جوانب مختلفة من استجابة الشفاء في الجسم الحي السابق. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول مع الأجسام المضادة الأخرى ذات الصلة بالبشرة، حيث يجب تحسين تركيزات الأجسام المضادة وأوقات الحضانة. ومع ذلك، نعتقد أن بروتوكولنا هو الأنسب للقياس الكمي المطلق للإغلاق الكلي للجروح، يليه التقييم المكاني لبروتينات محددة ذات أهمية. في حين أن التركيب الكامل يوفر دقة منخفضة من تحديد المواقع المناعية مقابل التحليل النسيجي القياسي لأقسام الأنسجة ، فإنه يوفر معلومات ثلاثية الأبعاد إضافية مفقودة من الأنسجة ثنائية الأبعاد القياسية.
تحذير واحد من تقييم الشفاء في الجلد السابق في الجسم الحي مقابل في نماذج الجسم الحي هو أنه يفتقر إلى استجابة الجهازية. جانب مهم من إصلاح الجرح هو التهاب وتحبيب الأنسجة اللاحقة ، والذي يسببه تدفق الخلايا الالتهابية والخلايا البطانية من الأوعيةالدموية 19. على الرغم من هذا القيد، لا يزال الجلد الحي السابق يوفر خلاصة أفضل للشفاء السريري من فحوصات الجروح القائمة على الخلايا. في المختبر التجارب بشكل عام تنطوي على نوع وحيد من الخلايا أو الثقافات المشتركة التي تزرع على البلاستيك زراعة الأنسجة، في حين أن الجلد السابق فيفو يوفر بيئة أصلية لاستكشاف سلوك الخلية. وفي الآونة الأخيرة، ظهر عدد من أنظمة مكافئة للبشرة، حيث تزرع البشرة في بيئة مختبرية من مصفوفة اصطناعية وخلايا جلدية معزولة20و21. على الرغم من أن هذه النماذج تحاكي الجلد البشري أفضل من معظم النهج في المختبر، فإنها لا تزال لا تحاكي تماما بيئة الأنسجة الأصلية وعموما هشة جدا لإصابة استنساخ. بالإضافة إلى ذلك، نحن (وآخرون) قد أظهرت أن ex vivo أنسجة الجلد البشري يحتفظ الخلايا المناعية المقيمة، والتي لا شك في أن تسهم في إصلاح22،23. وينبغي أن يركز العمل في المستقبل الآن على توسيع نطاق صلاحية ونموذج الجسم الحي السابق للتغلب على الشفاء في المراحل المتأخرة24. أحد الخيارات هو زيادة تقدم تقنيات الجهاز على رقاقة الواعدة القادرة على إطالة صلاحية الأنسجة والحفاظ على بنية الجلد الأصلية لمدة تصل إلى أسبوعين في الثقافة25. كما بدأت نماذج الجسم الحي السابق للنظر في أهمية استجابة التهاب الجلد من خلال دمج الخلايا المناعية بنجاح ، مثل العدلات ، في الأنسجة المضيفة26 أو حقن الأنسجة المضيفة بالأجسام المضادة للحصول على رد فعل مناعي27. ونتوقع أن تمهد هذه النتائج الطريق لتطوير أساليب أكثر دقة وقابلية للترجمة في المستقبل.
فائدة رئيسية لاستخدام الجلد السابق في الجسم الحي لقياس إغلاق الجرح هو القدرة على مقارنة معدلات الشفاء في صحية (على سبيل المثال، غير السكري) مقابل المرضية (على سبيل المثال، السكري أو المسنين) الأنسجة. هنا أظهرنا أن إعادة الظهارة وتشكيل الحاجز تضعف في الواقع في السكري مقابل الجروح الجسم الحي السابق صحية. في الواقع ، يوفر هذا طريقا للتقييم قبل السريري للإصلاح المرضي ، حيث تعد الشيخوخة والسكري عوامل خطر رئيسية لتطوير الجروح المزمنة1. في حين توجد نماذج مرضية في المختبر ، مثل الخلايا المعزولة عن الأنسجة القديمة والسكرية ، أو الخلايا المستزرعة في الجلوكوز العالي لمحاكاة فرط السكر في الدم28،29، يمكن لهذه الخلايا أن تفقد بسرعة النمط الظاهري بمجرد إزالتها من البيئة الدقيقة في الجسم الحي. عنصر مهم من بيئة الشفاء المرضية extrinsic هو مصفوفة الجلد ، والتي يتم تغييرها في كل من الشيخوخة والسكري30. في الواقع ، هذه المصفوفة المضطربة تؤثر على سلوك الخلايا الليفية المقيمة والسذاجة31،32. وبالتالي، لا يمكن التقليل من أهمية دراسة الخلايا في بيئة الأنسجة المضيفة.
باختصار، يوفر بروتوكولنا منصة مهمة لقياس إعادة ظهارة الجرح البشري، واستكشاف العوامل التنظيمية واختبار صحة وفعالية العلاجات المحتملة12و13. في حين أن الاختبارات قبل السريرية لا تزال تتطلب في نهج الجسم الحي، واستراتيجية مشتركة باستخدام الأنسجة البشرية في الجسم الحي السابق والجرح في الجسم الحي مورين ينبغي صقل المسار قبل السريرية، والحد من استخدام الحيوانات مع زيادة قابلية الترجمة عبر الأنواع.

الجروح المزمنة غير التئام، والتي هي منتشرة للغاية في كبار السن والسكري، هي منطقة لا يقدرها أحد بشكل رئيسي من الحاجة السريرية غير الملباة. هذه الجروح تشكل عبئا جسديا ونفسيا كبيرا على المرضى وتكلف مقدمي الرعاية الصحية المليارات كل عام لعلاج1. على الرغم من تحسن فهم بيولوجيا الجروح والتقدم في التكنولوجيا ، لا يزال ما يصل إلى 40٪ من الجروح المزمنة يفشل في التئام بعد أفضل رعاية قياسية2. وهكذا، 14-26٪ من المرضى الذين يعانون من قرحة القدم السكري تتطلب في وقت لاحق بتر3،في حين أن معدل وفيات ما بعد البتر لمدة 5 سنوات يبلغ حوالي 70٪4. ونتيجة لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير علاجات جديدة فعالة لتحسين نوعية حياة المرضى مع الحد من عبء الرعاية الصحية الكبير الذي تفرضه الجروح التئام الفقراء. لا تزال النماذج السابقة للسريرية التنبؤية السيئة تشكل عقبة كبيرة أمام تطوير علاجات جديدة فعالة.
إصلاح الجرح هو عملية ديناميكية ومتعددة الأوجه تنطوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، ومستويات لا تحصى من الاتصالات وبيئة الأنسجة التي يتم تشكيلها زمنيا. ويدعم شفاء الجلد من قبل أربع مراحل إعادة تحديد رئيسية: التهاب الكبد، التهاب، والانتشار، وإعادة عرض مصفوفة. هذه المراحل تعمل في نهاية المطاف لمنع فقدان الدم والعدوى، وإغلاق سطح الجرح (عملية يطلق عليها إعادة الظهارة) وإعادة الجلد إلى حالة غيرمصابة 5. ترتبط الجروح المزمنة بعوامل مختلفة واضطرابات واسعة النطاق لعملياتالتئام 6، مما يزيد من تعقيد تحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، تم تطوير مجموعة واسعة من النماذج لتوضيح كل من الدوافع الجزيئية والخلوية لأمراض الجروح واختبار نهج علاجية جديدة7.
نموذج إصلاح الجرح الأكثر استخداما هو الجرح الحاد في الماوس. الفئران هي قابلة للسحب للغاية للدراسات الميكانيكية وتوفير نماذج التحقق من صحة الشيخوخة والسكري8. على الرغم من أوجه التشابه العامة التي تظهر بين الماوس والشفاء البشري ، لا تزال الاختلافات بين الأنواع في بنية الجلد وديناميكيات الشفاء قائمة. وهذا يعني أن معظم البحوث الجرح مورين لا تترجم بسهولة إلى العيادة9. وبالتالي، كان هناك دفع نحو الإنسان في المختبر وأنظمة الجسم الحي السابق مع قابلية عالية للتطبيق وقابلية الترجمة10،11.
هنا نقدم بروتوكول متعمق لأداء الجروح استئصال سمك جزئي في الجلد البشري في الجسم الحي السابق. كما نحدد نهجنا الكامل للتلطيخ كطريقة قابلة للاستنساخ للغاية لتقييم شفاء الجلد البشري في الجسم الحي السابق. نحن نظهر مسار إصلاح البشرة (إعادة الظهارة) وتشكيل الحاجز اللاحق ، وتقييم معدل إغلاق الجروح في الجلد البشري الصحي مقابل السكري. وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن تكييف تلطيخ كامل جبل للاستخدام مع مجموعة من الأجسام المضادة لتقييم جوانب مختلفة من الاستجابة الشفاء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

الجروح المزمنة غير التئام، والتي تؤثر في المقام الأول على كبار السن والسكري، هي مجال كبير من الاحتياجات السريرية التي لم تلب. لسوء الحظ، علاجات الجروح المزمنة الحالية غير كافية، في حين أن النماذج المتاحة قبل السريرية لا تتنبأ بشكل جيد بالفعالية السريرية للعلاجات الجديدة. هنا نصف إنتاجية عالية، نموذج ما قبل السريرية لتقييم جوانب متعددة من استجابة إصلاح الجلد البشري. تم إنشاء جروح سمك جزئي في الجلد الجسم الحي السابق الإنسان ومثقفة عبر مسار زمني الشفاء. تم جمع خزعات جرح الجلد في مثبت لإجراء تلطيخ الجبل بأكمله. تم حجب العينات الثابتة واحتضانها في الأجسام المضادة الأولية ، مع تحقيق الكشف عن طريق الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلورسنت. كانت الجروح ملطخة وصورة عن طريق المجهر الكونفوجكال قبل حساب نسبة إغلاق الجرح (إعادة الظهارة) في كل خزعة. تطبيق هذا البروتوكول، ونحن نكشف عن أن 2 مم الجروح الإستئصالية التي تم إنشاؤها في الجلد المانحة صحية يتم إعادة ظهارة تماما من قبل اليوم 4-5 بعد الجرح. بل على العكس من ذلك، فإن معدلات إغلاق الجروح الجلدية السكرية تنخفض بشكل كبير، مصحوبة بإصلاح الحواجز المضطربة. الجمع بين جرح الجلد البشري مع نهج جديد تلطيخ جبل كامل يسمح لطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ لقياس إصلاح الجرح في الجسم الحي السابق. يوفر هذا البروتوكول بشكل جماعي منصة بشرية قيمة لتقييم فعالية علاجات الجروح المحتملة، وتحويل الاختبار قبل السريري والتحقق من الصحة.

في هذا التقرير، نقدم رواية جديدة ex vivo الجلد الجرح وكامل جبل تلطيخ النهج لتقييم العوامل التي تؤثر على استجابة إصلاح الجلد البشري. ويبين الشكل 1 ألف تخطيط خط الأنابيب الإجرائي، الذي يمكن إجراؤه في غضون 3-10 أيام، تبعا لمرات حضانة الجرح. يتم استزراع جروح السمك الجزئي على أكوام الأغشية في الهواء : واجهة الغشاء ويمكن جمعها لتلطيخ التركيب الكامل ، جزءا لا يتجزأ من البارافين أو OCT المتوسطة لعلم الأنسجة العام ، أو المجمدة في النيتروجين السائل للتحليل الكيميائي الحيوي(الشكل 1B). نحن عموما خلق 2 مم الجروح سمك جزئي داخل مركز 6 ملم explants. ومع ذلك، قد يتم تغيير حجم الجرح والزرع المحيط به اعتمادا على المتطلبات. وقد تم تكييف الإجراء كامل جبل بنجاح لكلا immunoperoxidase وطرق تلطيخ immunofluorescence (الشكل 1C).
Immunofluorescence يسمح للتحقيق في الأنسجة مع الأجسام المضادة متعددة. لهذا، ننصح باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في أنواع مختلفة، والأنواع المتطابقة مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلورسنت للحد من التفاعل بين الأنواع. تركيزات الأجسام المضادة وأوقات الحضانة سوف تحتاج إلى تحسين. إذا لوحظ تلطيخ الخلفية، والحد من تركيزات الأجسام المضادة، وزيادة خطوات الغسيل، وإضافة العازلة حجب إلى الأجسام المضادة الثانوية. يمكن تقييم صلاحية الأنسجة الطازجة مباشرة باستخدام الأصباغ التجارية (انظر جدول المواد). كما نظهر أن الأنسجة قد تكون ثابتة بعد تلطيخ البقاء وصورت بنجاح عندما يكون مناسبا عمليا(الشكل 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> الشكل 1: الإنسان السابق فيفو الجرح وكامل جبل تلطيخ النهج. (أ) خط أنابيب يصور سير العمل الإجرائية من جمع الجلد وأداء الجرح في الجسم الحي السابق، لتلطيخ الأنسجة وتحليل البيانات. (ب) الرسم البياني الذي يدل على الإنسان السابق الجسم الحي الجلد الجرح نظام الثقافة مع التحليلات التي أجريت بشكل روتيني على الأنسجة. (ج)يمكن استخدام تلطيخ كامل الجبل باستخدام كل من تقنيات الأكسدة المناعية والمناعة. K14 = الكيراتين 14. (د)قد تكون ملطخة الأنسجة الحية مع الأصباغ الجدوى التجارية وصورت بنجاح بعد التثبيت. شريط = 100 ميكرومتر. تم إجراء هذا التلطيخ في الجلد غير السكري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الاستخدام الأكثر انتشارا لتلطيخ كامل جبل من الجروح هو تحديد معدل إغلاق الجرح بطريقة أكثر استنساخا مما يمكن توفيره عن طريق قسم النسيج. تم تحديد نسبة الإغلاق كنسبة مئوية لإعادة ظهارة سطح الجرح، كما هو موضح في الشكل 2A. يمكن قياس تغطية مساحة النسبة المئوية لعلامات محددة من إجمالي مساحة الجرح أو كنسبة مئوية من الجرح الذي أعيد ظهارته. تميزنا الشفاء في صحية (غير السكري) مقابل الجلد السكري عبر مسار زمني من سبعة أيام، وجمع الجروح في كل يوم بعد الجرح (صور تمثيلية، الشكل 2B). أغلقت جروح الجلد الصحية مع مرور الوقت كما هو متوقع، مع ملاحظة الإغلاق الكامل في معظم العينات بحلول اليوم 4-5. بل على العكس من ذلك، فشلت الجروح الجلدية السكرية في الإغلاق الكامل خلال فترة التحليل التي استمرت سبعة أيام(الشكل 2C). لوحظ تأخير كبير في إغلاق الجروح بين الجروح الجلدية الصحية والسكرية عند مقارنة معدلات الشفاء في كل نقطة زمنية بعد الإصابة(P < 0.001 إلى اليوم 6 ، P < 0.05 في اليوم 6 و P < 0.05 إلى P < 0.001 في اليوم 7).
بعد تقييم المعدلات الإجمالية لإغلاق الجرح؛ قمنا بقياس النسبة المئوية لمنطقة الجرح بأكملها (المنطقة الخارجية في الشكل 2A)حيث يمكن تصور الخلايا الإيجابية K14 (تلطيخ أخضر في الشكل 2B). ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أنه في صحية ex vivo الجلد الجروح، K14 تلطيخ بلغت ذروتها في اليوم 2 ثم انخفضت بسرعة (أهمية في كل نقطة زمنية مقابل ذروة اليوم 2، الشكل 2D). وهذا يعكس على الأرجح إعادة تشكيل حاجز البشرة المبكر، باستثناء اختراق الأجسام المضادة K14 من خلال طبقات البشرة المتمايزة (انظر الشكل 2E التخطيطي). أثناء عملية إعادة الظهارة ، تهاجر خلايا القرنية القاعدية (K14 +ve) إلى الداخل فوق الجرح المفتوح بحيث تتشكل البشرة الأقرب إلى حافة الجرح الخارجي في وقت أبكر من البشرة الأقرب إلى حافة الجرح الداخلية (جبهة الهجرة). في حين أن الحافة الأمامية للبشرة التي تشكلت حديثا لا تزال تهاجر لإغلاق الجرح المفتوح المتبقي ، يبدأ البشرة الخارجية في التفريق لإصلاح الطبقات البشرة الأخرى. في الشفاء المبكر ، نتوقع بالتالي أن نرى معظم المنطقة التي أعيد ظهارها تتكون من خلايا القاعدية (K14 +ve) ، بينما في وقت لاحق يتم فقدان تلطيخ K14 حيث يفرق البشرة من الداخل الخارجي (انظر صور التركيب الكامل في الشكل 2E). لذلك ، يرتبط الانخفاض في تلطيخ K14 الموضح في الشكل 2D (الأسهم الهابطة) بزيادة تمايز البشرة. ومن المثير للاهتمام، تلطيخ K14 مرئية بلغت ذروتها في وقت سابق في صحية (اليوم 2) مقابل السكري (اليوم 4) الجروح، مما يدل على أن إعادة الظهارة والتمايز البشرة اللاحقة تتأخر في جروح الجلد السكري.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> الشكل 2: تلطيخ كامل جبل يكشف عن معدلات الشفاء المضطربة في الجلد السكري مقابل صحة. (أ) الطريقة المستخدمة لقياس إغلاق الجرح من قياسات الجرح الخارجي والداخلي. تظهر صور برايتفيلد الكيراتين 14 (K14) تلطيخ باللون الأحمر. شريط = 300 ميكرومتر. (ب) صور تمثيلية للشفاء مع مرور الوقت (بعد يوم من الجرح) في الجلد صحية والسكري. شريط = 500 ميكرومتر. DAPI = نواة زرقاء. (ج)تحديد كمي لمعدلات إغلاق الجروح (نسبة إعادة الظهارة) تبين أن الجروح الجسم الحي السابق من الجلد السليم إغلاق أسرع بكثير من الجروح في الجسم الحي السابق من الجلد السكري. H = صحية. Db = السكري. (D) النسبة K14 تلطيخ قمم في وقت سابق في صحة الجلد مقابل السكري ثم ينخفض تمشيا مع زيادة التمايز البشرة (أسفل السهام). (E) K14 (خلية البشرة القاعدية) يتم فقدان تلطيخ كما يميز البشرة. D = متمايزة. ND = غير متمايزة. خطوط منقط أبيض تصور حواف الجرح الداخلية والخارجية. الأسهم البيضاء = اتجاه الترحيل. n = 6 جروح لكل متبرع، في كل نقطة زمنية. متوسط +/- SEM. * = P < 0.05، ** = P < 0.01 و *** = P < 0.001. صحية والسكري مقارنة في كل نقطة وقت الشفاء في C (قيمة P للمقارنة أقل أهمية). التغير الزمني في تلطيخ K14 مقارنة بذروة كل مانح في D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
استخدمنا التالي تلطيخ كامل جبل لاستكشاف التعبير عن الأنسجة وتوطين علامات أخرى ذات الصلة الجرح في الجلد غير السكري(الشكل 3). جميع الأجسام المضادة المستخدمة وتركيزات عملها متوفرة في جدول المواد. الأوعية الدموية في الجرح المفتوح ملطخة إيجابيا مع ألفا العضلات الملساء أكتين (A-SMA) الأجسام المضادة, تستخدم في تركيبة مع K14 لتحديد حواف البشرة في الصور السلطة أقل (الشكل 3A). كانت المصفوفة الجلدية ملطخة بالأجسام المضادة ضد نوع الكولاجين الأول (COL 1) وفيبروكتين (Fn). هنا لوحظ الكولاجين كما وفرة الألياف السميكة في حين كانت ألياف فيبروكتين متناثرة، متموج، ورقيقة(الشكل 3A). لدينا نهج تلطيخ كامل جبل قادر أيضا على توفير قرار مستوى الخلية من تلطيخ، كما هو موضح لK14 إيجابية keratinocytes (الشكل 3B).
وأخيرا، نظهر أن الجروح البشرية في الجسم الحي تمتلك خلايا مناعية مقيمة، مع اكتشاف خلايا لانغرهانز حول البشرة التي تشكلت حديثا في اليوم الثالث بعد الإصابة(الشكل 3C). في الواقع ، تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام تلطيخ التركيب الكامل للتحقيق في السمات الرئيسية للاستجابة العلاجية بما في ذلك الالتهاب والانتشار والمصفوفة خارج الخلية(الشكل 4A). إذا أخذنا معا، تكشف بياناتنا أن إجراء تلطيخ الجلد الجسم الحي المشترك وإجراء تلطيخ التركيب الكامل هو طريقة صالحة لتقييم جوانب مختلفة من إصلاح الجلد البشري الصحي والسكري (المرضي).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> الشكل 3:الأمثل لنهج تلطيخ جبل كامل للاستخدام مع الأجسام المضادة الأخرى. (أ) كانت ملطخة الأوعية الدموية مع ألفا أكتين العضلات الملساء (α-SMA, الأخضر) والكيراتين 14 (K14, أحمر), في حين كانت ملطخة ألياف مصفوفة مع الكولاجين الأول (COL 1, أحمر) وفيبروكتين (Fn, الأخضر). (ب) يوفر إجراء التركيب الكامل دقة مستوى الخلية للتعريب (K14، أخضر؛ K1، أحمر). (C) CD1a + ve خلايا لانغرهانس (الأخضر) لوحظ في البشرة شكلت حديثا. DAPI = نواة زرقاء. شريط = 100 ميكرومتر. خطوط منقط أبيض تظهر حواف الجرح الداخلية والخارجية والجرح منفصلة من البشرة. تم إجراء هذا التلطيخ في الجلد غير السكري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> الشكل 4: صلاحية إجراء تلطيخ التركيب الكامل لتقييم التئام الجروح. (A) توضيح يوضح كيف يمكن لتقنية تلطيخ التركيب الكامل تقييم العمليات ذات الصلة بالجروح. الأجسام المضادة المستخدمة = النص الأحمر. K14 = الكيراتين 14. COL 1 = الكولاجين 1. Fn = فيبروكتين. (ب)إجراء تلطيخ كامل جبل (الأسهم الزرقاء) يدخل أقل تقلبا لقياسات إغلاق الجرح من التحليل النسيجي القياسية (السهام الحمراء). S1 = القسم 1. نحن = حافة الجرح. شريط = 300 ميكرومتر. تم إجراء هذا التلطيخ في الجلد غير السكري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

هنا نظهر تقنية محسنة لتقييم إصلاح الجروح باستخدام الجلد البشري السابق vivo جنبا إلى جنب مع نهج تلطيخ جبل كامل. توفر هذه المنهجية منصة ما قبل السريرية لتقييم علاجات الجروح المحتملة.

الإنسان السابق الجسم الحي الجرح نموذج ونهج تلطيخ جبل كامل لتقييم بدقة إصلاح الجلد

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا محسنا لجرح الجلد البشري في الجسم الحي يمكن أن يوفر بيانات فعالية مهمة كجزء من خط أنابيب ترجمة سريري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم دقيق عالي الإنتاجية لإصلاح الجروح في الجلد البشري الحي. وستبرهن على الإجراء إليزابيث روبرتس، باحثة ما بعد الدكتوراه، والإسكندرية كيد، وهي مساعدة باحثة من مختبرنا.لإعداد عينة من أنسجة الجلد للجرح، ضع جانب الأدمة الجلدية لأسفل في طبق بيتري عيار 90 ملليمتر واستخدم مقصا معقما لإزالة الأنسجة الدهنية. عندما تتم إزالة جميع الدهون، ضع الجلد في 25 ملليلتر من HBSS تكملها المضادات الحيوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز متقطعة لإزالة أي دم المتبقية في الأنسجة الدهنية. بعد 10 دقائق، شطف الجلد في 25 ملليلتر من DPBS.بعد 10 دقائق، كرر شطف HBSS دون مضادات حيوية، ثم قم بإجراء شطف نهائي في 25 ملليلتر من DPBS. ثم ضع غشاء فلتر نايلون معقم على كومة الوسادة الماصة وجفف الجانب الجلدي من الجلد على شاش معقم في طبق بيتري عيار 90 ملليمترا لإزالة DPBS المتبقية. وضع الجلد المجفف الأدمة الجانب إلى أسفل على غطاء طبق بيتري نظيفة 90 ملليمتر لإزالة أي DPBS المتبقية وداب البشرة الجافة مع الشاش العقيم الطازج.لإنشاء جرح، اضغط على لكمة خزعة ملليمترين ضد الجلد مع الإمساك بالجلد بإحكام والتواء بلطف. باستخدام ملقط الأنسجة المسننة المنحنية، والتقاط كل جانب من الجرح قطرها ما يقرب من ملليمترين وربط مقص القزحية المنحني تحت الجرح. استخدام لكمة خزعة ستة ملليمتر لخزعة حول الجرح المركزي مليمترين لخلق explant ستة ملليمتر مع سمك جزئي جرح ملليمترين في المركز.ثم ضع الجرح explant البشرة الجانب حتى على كومة غشاء مرشح النايلون لاحتضان لمدة يوم إلى سبعة أيام في 32 إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتلطيخ الفلورسنت، وجمع explants الجرح في أنابيب الطرد الدقيق 1.5 ملليلتر تحتوي على 500 ميكرولتر من تثبيت الجلد لكل أنبوب واحتضان النباتات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، استبدل المثبت بميليلتر واحد من مخزن الغسيل المؤقت للتلطيخ.بعد الغسيل، قم بتغطية كل عينة بما يقرب من 150 ميكرولتر من العازلة العازلة واحتضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة العازلة حجب، إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف في حظر العازلة لكل أنبوب واحتضان explants الجرح بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، شطف العينات مع 500 ميكرولتر من تلطيخ غسل العازلة التي تحتوي على 0.2٪ azide الصوديوم تليها ثلاثة شطف في عازلة غسل العادية.بعد الغسيل، أضف 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المترافقة مع الفلورسينس المخففة في عازل غسل التلطيخ إلى كل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اشطف الشطف ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل التلطيخي لكل غسل قبل إزالة تلطيخ كل سعة مع 150 ميكرولتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، اغسل الزرع مرتين لمدة 30 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لكل غسلة.للتصوير التجريبي، ضع طبق بيتري عيار 60 ملليمترا على منصة التصوير لمجهر كونفوجكال وأضف طبقة ملليلتر واحدة تقريبا من DPBS إلى الطبق. استخدام ملقط لنقل explants الجرح إلى الطبق. بعد إعداد برنامج التصوير حسب الاقتضاء للتجربة ، ضع الجرح في وسط مستوى التصوير والحصول على صور خزعات الجرح.لإجراء التصوير بالمجهر الرقمي اللاسلكي للحصول على صور عالية الجودة بطريقة فعالة من حيث التكلفة، قم بتوصيل الهاتف أو الكمبيوتر المحمول بالمجهر الرقمي اللاسلكي. ضع جانب الجرح في النباتات السابقة على قطعة من أنسجة المختبر وأزل أي عازل غسيل متبقي من العينة. ثم ضع explant في وسط مجال الرؤية للمجهر والحصول على الصور باستخدام الكاميرا المتصلة.يمكن استخدام Immunoperoxidase والمناعة لتلطيخ الأنسجة جبل كامل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تلطيخ حية / ميتة على الأنسجة الطازجة وصورت قبل أو بعد التثبيت. يمكن استخدام تلطيخ الجروح بالكامل لتحديد معدلات إغلاق الجرح بطريقة قابلة للاستنساخ.في هذا التحليل التمثيلي، لوحظ إغلاق صحي لجروح الجلد بعد أربعة إلى خمسة أيام في حين فشلت جروح الجلد السكري في الإغلاق الكامل خلال فترة التحليل التي استمرت سبعة أيام. بلغ التعبير K14 ذروته في اليوم الثاني في جروح الجلد الصحية قبل أن ينخفض بسرعة مع زيادة التمايز البشرة. هذا إعادة الظهارة والتمايز البشرة اللاحقة تأخر في جروح الجلد السكري.إصلاح حاجز البشرة المبكر يستبعد اختراق الأجسام المضادة K14 داخل طبقات البشرة المتمايزة. في وقت مبكر من عملية إعادة الظهارة ، K14 إيجابية keratinocytes طبقة القاعدية الهجرة إلى الداخل على الجرح المفتوح ، بحيث البشرة أقرب إلى حافة الجرح الخارجي أشكال في وقت سابق من البشرة أقرب إلى حافة الجرح الداخلي. في وقت لاحق في مرحلة الإصلاح ، يتم فقدان تلطيخ K14 حيث يميز البشرة عن الداخل الخارجي.يمكن أيضا استخدام تلطيخ التركيب الكامل لدراسة التعبير عن علامات الجرح الأخرى ذات الصلة في الجلد وتوطينها ، بالإضافة إلى وجود خلايا مناعية ذات أهمية في موقع الجرح في مراحل مختلفة من الشفاء. توليد جروح ختانية قابلة للاستنساخ يمكن أن يكون تحديا في البداية. ننصح بممارسة إجراء الجرح باستخدام فائض الجلد.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

إنشاء ذات الصلة سريريا<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; موك الساد نموذج جراحة للتحقيق الظهارية إصلاح الجرح في المكروية الأم

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

استزراع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية على طراز السابقين فيفو غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

الجامعة-جبل [كنفوكل] الفحص المجهري للجلد الإذن الكبار: نظام نموذجي لدراسة Morphogenesis المتفرعة العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...