Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Vi vil gerne takke hr. Paolo Matteuci og hr. George Smith for at have leveret patientvæv. Vi er også taknemmelige for Miss Amber Rose Stafford for at hjælpe med vævsindsamling og Daisy Appeal for at levere laboratoriefaciliteter.

Human hud blev opnået fra patienter, der gennemgår rekonstruktionskirurgi på Castle Hill Hospital og Hull Royal Infirmary (Hull, UK) under fuldt informeret, skriftligt patientsamtykke, institutionelle retningslinjer og etisk godkendelse (LRECs: 17/SC/0220 og 19/NE/0150). Ikke-diabetisk hud blev indsamlet fra patienter, der gennemgår rutinemæssig kirurgi (gennemsnitsalder = 68). Diabetisk hud blev udvalgt blandt donorer, der havde etableret type II-diabetes og en historie med sårdannelse (gennemsnitsalder = 81). Prøver fra kirurgi blev transporteret i bedriften medier og behandles umiddelbart efter ankomsten til laboratoriet. Alle eksperimentelle trin ved hjælp af ikke-fastgjort humant væv blev udført på Biosafety Level-2 (BSL-2) i et klasse II laminar flow biosikkerhedsskab.
1. Fremstilling af hudkulturmedier og farvningsreagenser
BEMÆRK: Alle oplysninger om reagens og forbrugsstoffer findes i materialeoversigten. Sørg for, at alle reagenser og alt udstyr, der anvendes til behandling og dyrkning af humant væv, er sterilt. Steriliser instrumenter før brug og dekontaminere med desinfektionsmiddel efter kontakt med vævet. Dekontaminer affaldsprodukter i 1% desinfektionsmiddel før bortskaffelse.
<ol><li>Holding medier: Tillægge høj glukose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 2 mM L-glutamin og 4% (v / v) antibiotisk-antimykotisk opløsning.</li>
	<li>Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) med antibiotika: Tilsæt 4% (v/v) antibiotisk antimykotisk opløsning til HBSS. Opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug.</li>
	<li>Dulbeccos fosfatbufferet saltvand (DPBS): Forbered DPBS ved at opløse 9,6 g DPBS-pulver pr. liter destilleret vand (dH2O). Autoklave til sterilisering og opbevaring ved 4 °C, indtil den er i brug.</li>
	<li>Human hudvækst medier: Supplere høj glukose DMEM med 2 mM L-glutamin, 1% (v / v) antibiotisk-antimykotisk opløsning og 10% (v / v) føtal kvæg serum. Opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug.</li>
	<li>Huden fikseringsmiddel: Til 450 ml dH2O tilsættes 40 ml formaldehydopløsning, 10 ml iseddike, 4,5 g natriumchlorid og 0,25 g alkyltrimethylammoniumbromid. Opbevares ved stuetemperatur (RT) og bruges inden for et par dage. ADVARSEL: Fikseringsmiddel er farligt (irriterende og brandfarligt). Håndter med omhu og kassér via en passende rute.</li>
	<li>Fosfatbufferet saltvand (PBS): Forbered PBS til helmonteringspletning ved at tilsætte 6 g natriumchlorid til 100 ml fosfatbufferopløsning og 900 ml dH2O.</li>
	<li>Farvning vask buffer: Opløs 0,5% (v/ v) Triton X-100 i PBS.</li>
	<li>Blokeringsbuffer: Der tilsættes 0,2 % (w/v) natriumsid og 2 % (v/v) serum til farvningsvaskbuffer. Opbevares ved 4 °C i op til to uger. BEMÆRK: Bloker i serumet af den sekundære antistof værtsart. Natrium azide vil forhindre bakteriel vækst under inkubation.</li>
	<li>DAPI arbejdsløsning: Forbered en 5 mg/mL lager af 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i dimethyl sulfoxid. Bestanden fortyndes 1:1.000 i farvningsvaskbuffer for at give en 5 μg/mL DAPI arbejdsopløsning.</li>
	<li>Peroxidase blok: Tilsæt 0,3% (v/ v) brintoverilte til farvning vask buffer. Opbevares ved 4 °C, indtil den er i brug. Hold i mørke for at forhindre nedbrydning.</li>
	<li>ABC-HRP-sæt:<ol>
<li>HRP-konjugeret sekundært antistof: 1 dråbe biotinyleret kanin anti-ged IgG i 5 mL farvningsbuffer. Opbevares ved 4 °C i op til to uger. BEMÆRK: Det anvendte kit/sekundære vil afhænge af værtsarten for det primære antistof.</li>
		<li>Avidin-biotin kompleks (ABC) reagens: 2 dråber reagens A og 2 dråber reagens B i 5 mL farvning vask buffer. ABC reagens skal fremstilles mindst 30 minutter før brug. Opbevares ved 4 °C i op til to uger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Substrate for peroxidase: 3 dråber reagens 1, 2 dråber reagens 2, 2 dråber reagens 3 og 2 dråber hydrogenperoxid i 5 mL dH2O. Peroxidase-substrat skal tilberedes frisk umiddelbart før brug og kan ikke opbevares.</li>
</ol>2. Forberedelse af huden til sår
BEMÆRK: Disse trin skal udføres i et klasse II laminar flow biosikkerhedsskab.
<ol><li>Saml huden i holde medier og transport til BSL-2 kabinet.</li>
	<li>Placer huden dermis side ned i en 90 mm steril Petri parabol og fjerne fedtvæv med steril saks.</li>
	<li>Placer huden i et 50 mL rør, der indeholder 25 mL HBSS med antibiotika i 10 minutter ved RT. Ryst periodisk for at fjerne eventuelt restblod og fedtvæv.</li>
	<li>Gentag trin 2.3 med et nyt 50 mL rør.</li>
	<li>Placer huden i et friskt 50 mL rør, der indeholder 25 mL HBSS, denne gang uden antibiotika i 10 minutter på RT. Ryst som i trin 2.3.</li>
	<li>Udfør en endelig hudskylning ved at placere huden i et nyt rør med 25 mL DPBS. Huden er nu klar til at blive såret.</li>
</ol>3. Oprettelse af ex vivo menneskelige hudsår
BEMÆRK: Disse trin skal udføres i et klasse II laminar flow biosikkerhedsskab.
<ol><li>Forbered huden kultur retter før sår. I en 60 mm petriskål skal du stable to sterile absorberende puder og tilføje 4 mL menneskelige hudmedier via siden af skålen. Placer en steril nylonfiltermembran på den absorberende pad stack. BEMÆRK: Hudmedier kan ændres afhængigt af de krævede behandlingsforhold. Op til tre sår explants kan dyrkes på hver stak.</li>
	<li>Tør hudens dermale side på steril gaze i en 90 mm petriskål for at fjerne resterende DPBS. BEMÆRK: Dette forhindrer huden i at glide rundt, når den såres.</li>
	<li>Placer huden dermis side ned på en ren 90 mm Petri parabol låg og duppe epidermis tør med frisk steril gaze. BEMÆRK: Det er lettere at såre huden i et petriskålslåg end basen. Efterfølgende arbejde skal udføres hurtigt for at forhindre, at huden tørrer ud.</li>
	<li>Hold huden stram, tryk en 2 mm biopsi punch mod huden og drej forsigtigt. Punch ikke helt gennem huden. BEMÆRK: Delvis tykkelse sår er designet til punch gennem epidermis og delvist ind i dermis. Der kan være donor-til-donor og site-to-site variation i den kraft, der kræves for at skabe den delvise tykkelse sår.</li>
	<li>Brug buede tandvævsplyd til at samle hver side af det 2 mm sår op og tilslutte buede irissakse under 2 mm såret for at skære det ud ensartet.</li>
	<li>Biopsi omkring det centrale 2 mm sår ved hjælp af en 6 mm biopsi punch for at skabe en 6 mm explant med en delvis tykkelse 2 mm sår i midten. BEMÆRK: Der kan anvendes en 6 mm biopsipunch til at score huden for at markere, hvor hvert 2 mm sår skal være. Pas på ikke at gennembore vævet helt. Opret sår explants i en honeycomb mønster for at reducere spild.</li>
	<li>Placer sår explants epidermis side op på nylon filter membran stakken (udarbejdet i trin 3.1). BEMÆRK: Ved håndtering af sår explants, skal du passe på ikke at beskadige det centrale sår. Brug små pincet og afhente hver explant på modsatte sider.</li>
	<li>Inkuber sår ved 32-37 °C og 5% CO2 i fugtig atmosfære (90-95%) i 1-7 dage. Udskift mediet hver 2-3 dage.</li>
</ol>4. Helmontering af ex vivo-sår
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver immunfluorescens og immunoperoxidase farvning metoder. Bland alle reagenser i godt tid før brug.
<ol><li>Fluorescerende farvningsmetode<ol>
<li>Der opsamles sårfobier i 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 500 μL hudens fikseringsmiddel og inkuberes ved 4 °C natten over. BEMÆRK: Det fikseringsmiddel, der bruges i denne protokol, fungerer godt for de beskrevne antistoffer. Optimering vil være påkrævet for andre antistoffer. Vævsfiksering længere end 24 timer kan føre til overfiksering.</li>
		<li>Den følgende dag fjernes fikseringsmærket og erstattes med 1 mL farvningsvaskbuffer. Biopsier kan opbevares i farvningsvaskbuffer ved 4 °C op til 2 uger før farvning. BEMÆRK: For alle vaskebuffertrin skal du bruge en serologisk pipette eller pipettespids, idet du skal passe på ikke at beskadige såret.</li>
		<li>Udsug farvningsvaskbufferen, og udfør endnu en skyl med 1 mL farvningsvaskbuffer.</li>
		<li>Den mængde blokeringsbuffer, der kræves til trin 4.1.5-4.1.6 (antal prøver x 300 μL = mængden af blokeringsbuffer i μL) beregnes. Lav ekstra buffer, hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Der tilsættes 150 μL blokeringsbuffer til hver prøve og inkuberes i 1 time ved RT. For alle farvningstrin skal du sikre dig, at hver prøve er tilstrækkeligt dækket, og at der ikke er bobler, der dækker biopsiets såroverflade. BEMÆRK: Dette trin og fremefter kan udføres i 1,5 mL mikrocentrifugerør eller i en 48 brøndplade. Hvis du bruger en 48 godt plade, inkubere sårene med ansigtet nedad i hver brønd.</li>
		<li>Det primære antistof fortyndes i den resterende blokeringsbuffer. BEMÆRK: Anti-mus keratin 14 (K14) fortyndet 1:1,000 i blokering buffer fungerer godt. Optimer dette trin til brug sammen med andre antistoffer eller flere sonder.</li>
		<li>Stødpuden aspireres, og der tilsættes 150 μL primært antistof pr. brønd/mikrocentrifugerør. Inkubere sår explants i primær antistof ved 4 °C natten over.</li>
		<li>Den næste dag aspireres det primære antistof, og det skylles i farvningsvaskbuffer, der indeholder 0,2% natriumanzid i 1 time ved RT (500 μL pr. prøve).</li>
		<li>Der udføres yderligere tre skylningstrin ved hjælp af farvningsvaskbuffer (30 min pr. vask, 500 μL pr. prøve).</li>
		<li>Det fluorescerende konjugerede sekundære antistof fortyndes i farvningsvaskbuffer (f.eks. gedeantimus 488 ved 1:400 fortynding).</li>
		<li>Den krævede mængde sekundært antistof beregnes (antal prøver x 150 μL = mængde i μL).</li>
		<li>Der tilsættes 150 μL sekundært antistof til hvert brønd/mikrocentrifugerør. Inkuber i 1 time ved RT. Udfør inkubationstrin 4.1.10 - 4.1.16 i mørke, da det sekundære antistof er lysfølsomt. BEMÆRK: Dette trin kan udføres ved 4 °C natten over, hvis det er nødvendigt. Optimer koncentrationen af sekundært antistof, der kræves for at opnå tilstrækkelig signal og begrænset baggrundsplejning.</li>
		<li>Det sekundære antistof fjernes, og der skylles 3 x 30 minutter med farvningsvaskbuffer (500 μL pr. prøve).</li>
		<li>Kassere den resterende vaskebuffer og beregne den nødvendige MÆNGDE DAPI-arbejdsløsning (pr. trin 4.1.11).</li>
		<li>Modstiv hver explant med 150 μL DAPI-arbejdsopløsning i 10 minutter ved RT. BEMÆRK: DAPI vil plette cellekerner blå. Hoechst farvestof kan bruges som et alternativ til DAPI.</li>
		<li>Udfør to sidste 30 minutters vask med farvningsvaskbuffer (500 μL pr. prøve). Biopsier kan opbevares i farvningsvaskbuffer ved 4 °C i mørke op til to uger før billeddannelse.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield farvning metode.<ol>
<li>Udfør trin 4.1.1 - 4.1.3.</li>
		<li>Quench endogen peroxidaseaktivitet med peroxidaseblok ved 4 °C natten over. BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, når du bruger et HRP-konjugeret antistof til at reducere ikke-specifik baggrundsfarvning fra vævet. Meget vaskulært væv vil indeholde mere endogen peroxidase aktivitet.</li>
		<li>Kasser peroxidaseblokken, og skyl to gange i 30 minutter i farvningsvaskbuffer.</li>
		<li>Udfør trin 4.1.4 - 4.1.8. BEMÆRK: Vasker efter trin 4.1.7 er særligt vigtige for at fjerne natriumanzid fra prøverne. Hvis natriumanziden ikke fjernes tilstrækkeligt, vil den inaktivere HRP'en og forstyrre pletdetektionen.</li>
		<li>Der tilsættes 150 μL HRP-konjugeret sekundært antistof til hvert brønd-/mikrocentrifugerør og inkuberes natten over ved 4 °C eller 1 time ved RT.</li>
		<li>Fjern det sekundære antistof og udfør 3 x 30 min vasker i farvning vask buffer.</li>
		<li>Der tilsættes 150 μL ABC-reagens til hvert brønd-/mikrocentrifugerør, og der inkuberes natten over ved 4 °C eller 1 time ved RT.</li>
		<li>Aspirere ABC reagens og udføre 3 x 30 min vasker i farvning vask buffer.</li>
		<li>Der tilsættes 150 μL peroxidase-substrat til en eksplant, og den tid, det tager at registrere en mærkbar farveændring, bestemmes. BEMÆRK: Vælg en prøve, hvor der forventes stærk farvning. I dette tilfælde en rød ring for at vise den migrerende epidermis (K14). 3,3'-diaminobenzidin-4 eller ethvert andet passende kromogenunderlag kan anvendes som erstatning for dette peroxidase-substrat.</li>
		<li>Når en farveændring er observeret, skal du fjerne peroxidase-substratet og erstatte med 1 mL dH2O.</li>
		<li>Der gentages detektion af peroxidaseunderlag for de øvrige explanter, som inkuberes i det tidsrum, der er fastsat i trin 4.2.11.</li>
		<li>Skyl alle explants med 1 mL dH2O for at fjerne restperoxidase substrat. Selv om explants kan opbevares op til en uge ved 4 °C før billeddannelse, er det bedre at afbilde dem så hurtigt som muligt for at forhindre udvaskning af peroxidase substratet i dH2O over tid.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Billeddannelse og kvantificering
<ol><li>Fluorescerende billeddannelse BEMÆRK: Fluorescerende billeddannelse udføres ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop. Et omvendt fluorescerende mikroskop kan dog være tilstrækkeligt til at erhverve 2D-billeder til at kvantificere sårlukningshastigheder. Ved valg af sekundære antistoffer skal det sikres, at de valgte fluorchromer er forenelige med excitations- og emissionsspektre på det mikroskopiudstyr, der er til rådighed.<ol>
<li>Brug et konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med et mål på 2,5x, 10x og 20x, x-y-z motoriseret scene, digitalt kamera og anskaffelsessoftware. Tænd den transmitterede lysdetektor (TPMT) for at muliggøre nem visualisering af hver biopsi og for at muliggøre måling af total sårlukning. Alternativt kan du måle hvert sår via brightfield mikroskopi efter fluorescensbilleddannelse.</li>
		<li>Placer en 60 mm petriskålsbase på billedplatformen, og tilsæt et tyndt lag (ca. 1 mL) DPBS. BEMÆRK: Hvis der anvendes for meget DPBS, vil biopsi bevæge sig rundt under billeddannelse. Alternativt kan du bruge en 48 brøndplade, hvis der er en pladeholder til rådighed.</li>
		<li>Brug små vævsplyns til at overføre sårfobier fra brønde/mikrocentrifugerør til petriskålen, der indeholder DPBS. Placer biopsi sårsiden ned i Petri parabol.</li>
		<li>Brug okularet og lysstofrøret til at lokalisere og fokusere på såret. Hvis bobler fanges under prøven i synsfeltet, skal såret afhentes med vævsplygter og flyttes.</li>
		<li>Opsæt billedbehandlingssoftwaren, hvilket sikrer lige så stor pinhole-størrelse mellem kanalerne for optimal konfoskalitet. Til dette skal du kontrollere værdien af en luftig enhed for hver kanal og vælge den største værdi. Vælg scanningshastighed, billedkvalitet og gennemsnit. BEMÆRK: Fluorchromerne i de konjugerede sekundære antistoffer og den valgte modstain (f.eks. DAPI) dikterer de nødvendige kanaler.</li>
		<li>Tænd for live acquisition-softwaren, og juster lasereffekten og forstærkningen for hver kanal til de niveauer, der kræves for at visualisere farvning. Reducer baggrundsstøj ved at øge den digitale offset.</li>
		<li>Placer såret i midten af billedplanet. BEMÆRK: Hvis såret ikke fylder hele billedet på grund af at bruge et mindre mål eller skabe et større sår, skal du tage et panel af billeder og sy dem sammen (manuelt eller med en flisefunktion i den relevante billedbehandlingssoftware).</li>
		<li>Få billeder af sårets biopsier. Brug de samme billedindstillinger mellem explants. BEMÆRK: Højere effektbilleder vil gøre det muligt at vurdere vævsstrukturer og cellulær markørudtryk og placering.</li>
		<li>Saml seriel Z stakke gennem såret, især hvor vævet ikke er helt fladt mod Petri parabol. Brug analysesoftware til at skjule Z-stakken i et enkelt projektionsbillede med maksimal intensitet.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield-billedbehandling BEMÆRK: Brightfield billeddannelse af immunoperoxidase farvede biopsier kan udføres på flere måder.<ol>
<li>Inverteret mikroskopbilleddannelse: Forbered sårfudser til billeddannelse ved at placere dem i en petriskål/samt beskrevet i trin 5.1.2-5.1.3. Anskaf digitale billeder under lysfeltbelysning på et omvendt mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Sy flere billeder sammen, hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Trådløs digital mikroskop billedbehandling: Brug et trådløst digitalt mikroskop tilsluttet en telefon eller bærbar computer for at opnå billeder i høj kvalitet på en omkostningseffektiv måde. Placer explants såret side op på nogle væv og fjerne eventuelle resterende dH2O (eller farvning vask buffer) fra prøve opbevaring. Placer såret explant i midten af mikroskopet synsfelt. Hent billeder ved hjælp af det tilsluttede kamera.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantificering BEMÆRK: Procentvis sårlukning kan kvantificeres i enhver software, der gør det muligt at tegne og måle frihåndsformer. ImageJ kan bruges til at udføre kvantificering på følgende måde:<ol>
<li>Åbn det billede, der skal kvantificeres i ImageJ-softwaren.</li>
		<li>Brug frihåndsformværktøjet til at tegne rundt om ydersiden af det re-epiteliserede sår, hvor det møder den normale hud. Tryk på M (eller Analyser | foranstaltning) for at opnå en »ydre« arealmåling. BEMÆRK: Den re-epiteliserede sårvævsstruktur adskiller sig fra normal hud. Billederne behøver ikke at blive skaleret før denne type analyse.</li>
		<li>Brug frihåndsformværktøjet til at tegne rundt om det åbne sårområde. Det er her det åbne sår møder den indvendige kant af det re-epithelialiserende væv. Tryk på M (eller Analyser | foranstaltning) for at opnå en »indre« arealmåling.</li>
		<li>Brug følgende ligning til at udlede procentvis re-epitelisering/lukning: % lukning = (ydre sårområde - indersårsområde) / (ydre sårområde) x 100 BEMÆRK: Dækningen af antistoffer i det procentvise areal kan udledes på samme måde (f.eks. Procentintensitet kan også give semiktatiske oplysninger om vævsniveau udtryk for markører af interesse, mens høj effekt billeddannelse præsenterer udtryksdata på cellulært niveau.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

I denne eksperimentelle protokol beskriver vi en optimeret metode til vurdering af sårlukning i human ex vivo-hud ved hjælp af helmontering af vævsbegævning. Dette er en vigtig ressource til at muliggøre kritisk vurdering af potentielle sårbehandlinger, og til at give en bedre forståelse af de menneskelige sår reparation svar. Vi har offentliggjort healing vurdering i ex vivo hud sår tidligere12,13, men i disse rapporter hele mount farvning tilgang blev ikke brugt til at måle sår lukning. Helmontering farvning er langt lettere og kræver mindre teknisk erfaring end standard histologi, som indebærer paraffin eller OCT indlejring og sektionsopderinger af prøver. Hele monteringsproceduren reducerer også eksperimentel variation, hvilket gør det muligt at kvantificere hele såret og ikke kun et enkelt tværgående afsnit på et bestemt sted i vævet (se figur 4B for sammenlignende illustration). Vi støtter fuldt ud vigtigheden af at kvantificere heling af hele den ikke-symmetriske sårstruktur, som klart skitseret af Rhea og Dunnwald for murine akutte sår14. Disse forfattere viste vigtigheden af serielt sektion i vivo excisional sår for reproducerbare og præcise målinger af sårmorfologi. Seriel sektionsopderinger kan også anvendes på humane ex vivo-sår; For nøjagtig kvantificering af sårlukning og re-epitelisering bør høj gennemløb af helmonteringsbejdning dog være den foretrukne metode. Vi bemærker, at denne helmonterede farvningsprotokol også bør være kompatibel med efterfølgende forarbejdning (voks eller OLT) til traditionel histologisk analyse.
Helmontering farvning er ikke uden ulemper. Selv om det giver højere reproducerbarhed i sårheling eksperimenter, det kræver brug af mere væv til analyse end standard histologiske teknikker. Dette kan være et problem, hvor vævsadgangen er begrænset, især hvor flere antistoffer skal vurderes. En alternativ fremgangsmåde ville være at anvende en indsnitssårmetode, hvor sårbredden er relativt ensartet, og variationen reduceres (som vist i mus og menneskelige sår15,16). Ekscisionale sår gælder dog stadig mere for de fleste patologiske sårtyper17.
I denne undersøgelse blev der skabt 2 mm sår med delvis tykkelse i midten af 6 mm hud explants. Denne metode kan optimeres til alternative excisional sår og explant størrelser på forskellige huddybder18. Derudover vil den kraft, der kræves for at generere sår variere mellem donorer, hvor alderen hud vil kræve mindre kraft til biopsi. Vi ville også undgå at bruge huden viser fremtrædende strækmærker eller andre strukturelle ændringer. Vi har valideret en række antistoffer til at overveje forskellige aspekter af ex vivo healing respons. Denne protokol kan også anvendes sammen med andre hudrelevante antistoffer, hvor antistofkoncentrationer og inkubationstider skal optimeres. Ikke desto mindre mener vi, at vores protokol er bedst egnet til absolut kvantificering af total sårlukning efterfulgt af rumlig vurdering af specifikke proteiner af interesse. Mens hele mount giver reduceret opløsning af immunolocalization versus standard histologiske analyse af væv sektioner, det giver yderligere 3D-oplysninger, der mangler fra standard 2D histologi.
En advarsel for at vurdere heling i ex vivo hud versus in vivo modeller er, at det mangler en systemisk reaktion. Et vigtigt aspekt af sårreparation er betændelse og efterfølgende vævsgranulering, som er forårsaget af en tilstrømning af inflammatoriske celler og endotelceller fra vaskulaturen19. På trods af denne begrænsning giver ex vivo-huden stadig en bedre rekapitulation af klinisk helbredelse end cellebaserede såranalyser. In vitro-eksperimenter involverer generelt monolag af enkeltcelletypen eller samkulturer, der dyrkes på vævskulturens plast, mens ex vivo-hud giver et indfødt miljø til at udforske celleadfærd. For nylig er der opstået en række hudækvivalentsystemer, hvor huden dyrkes i et laboratorium fra kunstig matrix og isolerede hudceller20,21. Selv om disse modeller efterligner menneskelig hud bedre end de fleste in vitro tilgange, de stadig ikke fuldt ud simulere det indfødte væv miljø og er generelt for skrøbelige til at skade reproducerbart. Derudover har vi (og andre) vist, at ex vivo humant hudvæv bevarer bosiddende immunceller, hvilket uden tvivl vil bidrage til reparation22,23. Det fremtidige arbejde bør nu fokusere på at udvide ex vivo-modellens levedygtighed og immunokompetence med henblik på senhelbredelsesvurdering 24. En mulighed er yderligere fremme af lovende organ-on-a-chip teknologier i stand til at forlænge væv levedygtighed og opretholde indfødte hud arkitektur i op til to uger i kultur25. Ex vivo-modeller er også begyndt at overveje vigtigheden af hudens inflammatoriske respons ved med succes at inkorporere immunceller, såsom neutrofiler, i værtsvævet26 eller injicere værtsvæv med antistoffer for at fremkalde en immunreaktion27. Vi forventer, at disse resultater vil bane vejen for udvikling af mere raffinerede og omsættelige metoder i fremtiden.
En væsentlig fordel ved at bruge ex vivo-hud til at måle sårlukning er evnen til at sammenligne helingsrater i sundt (f.eks. ikke-diabetisk) versus patologisk (f.eks. diabetiker eller alderen) væv. Her viste vi, at re-epitelisering og barriere dannelse er faktisk nedsat i diabetiker versus sunde ex vivo sår. Dette giver faktisk en vej til præklinisk vurdering af patologisk reparation, hvor aldring og diabetes er vigtige risikofaktorer for udvikling af kroniske sår1. Mens in vitro patologiske modeller findes, såsom celler isoleret fra alderen og diabetisk væv, eller celler dyrket i høj glukose til at efterligne hyperglykæmi28,29, disse celler kan hurtigt miste deres fænotype, når fjernet fra in vivo mikromiljø. En vigtig del af det ydre patologiske helbredende miljø er den dermale matrix, som ændres i både aldring og diabetes30. Faktisk påvirker denne forstyrrede matrix adfærden hos bosiddende og naive fibroblaster31,32. Således kan vigtigheden af at studere celler i deres værtsvævsmiljø ikke undervurderes.
Sammenfattende giver vores protokol en vigtig platform til at kvantificere human sår re-epitelisering, udforske regulatoriske faktorer og teste gyldigheden og effekten af potentielle terapier12,13. Selv om præklinisk testning stadig kræver in vivo-tilgange, bør en kombineret strategi, der anvender ex vivo humant væv og in vivo-skumle sår, forfine den prækliniske vej, hvilket reducerer brugen af dyr og samtidig øger overførbarheden på tværs af arter.

Kroniske, ikke-helbredende sår, som er meget udbredt hos ældre og diabetikere, er et stort uanvendeligt område af klinisk uopfyldte behov. Disse sår udgør en stor fysisk og psykologisk byrde for patienterne og koster sundhedsudbydere milliarder hvert år at behandle1. På trods af forbedret forståelse af sårbiologi og fremskridt inden for teknologi, op til 40% af kroniske sår stadig ikke helbrede efter bedste standard pleje2. Således kræver 14-26% af patienter med diabetiske fodsår efterfølgende amputation3, mens den 5-årige post-amputationsdødelighed ligger på ca. 70%4. Som følge heraf er der et presserende behov for at udvikle effektive nye behandlingsformer for at forbedre patienternes livskvalitet og samtidig reducere den betydelige sundhedsbyrde, der pålægges af dårlige helbredende sår. Dårligt prækliniske modeller er fortsat en betydelig hindring for udviklingen af effektive nye behandlingsformer.
Sårreparation er en dynamisk og mangefacetteret proces, der involverer en bred vifte af celletyper, utallige niveauer af kommunikation og et vævsmiljø, der er temporalt ombygget. Hudheling understøttes af fire store reparative stadier: hemostase, inflammation, spredning og matrix remodeling. Disse stadier virker i sidste ende for at forhindre blodtab og infektion, lukker sårets overflade (en proces betegnelse re-epitelisering) og returnerer huden til en uskadt tilstand5. Kroniske sår er forbundet med forskellige ætiologi og udbredt forstyrrer til helbredende processer6, hvilket yderligere komplicerer identifikationen af terapeutiske mål. Ikke desto mindre er der udviklet en bred vifte af modeller til både at belyse de molekylære og cellulære drivkræfter bag sårpatologi og teste nye terapeutiske tilgange7.
Den mest anvendte sårreparationsmodel er akut sår i musen. Mus er meget tractable for mekanistiske undersøgelser og giver validerede modeller for aldring og diabetes8. På trods af de generelle ligheder, der er vist blandt mus og menneskelig helbredelse, er der stadig forskelle mellem arter i hudstruktur og helbredende dynamik. Det betyder, at de fleste murine sår forskning ikke let oversætte til klinikken9. Der har derfor været et fremstød i retning af menneskelige in vitro - og ex vivo-systemer med høj anvendelighed og omsættelighed10,11.
Her giver vi en dybdegående protokol for udførelse af delvis tykkelse excisional sår i ex vivo menneskelig hud. Vi skitserer også vores helmonterede farvningsmetode som en meget reproducerbar metode til evaluering af ex vivo menneskelig hudheling. Vi viser bane epidermal reparation (re-epitelialization) og efterfølgende barriere dannelse, evaluere hastigheden af sår lukning i sund versus diabetisk menneskelig hud. Endelig demonstrerer vi, hvordan helmonteringsbejdning kan tilpasses til brug med en række antistoffer for at vurdere forskellige aspekter af den helbredende reaktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Kroniske ikke-helbredende sår, som primært påvirker ældre og diabetikere, er et betydeligt område af klinisk uopfyldte behov. Desværre, nuværende kroniske sår behandlinger er utilstrækkelige, mens tilgængelige prækliniske modeller dårligt forudsige den kliniske effekt af nye behandlinger. Her beskriver vi en høj gennemløb, præklinisk model til at vurdere flere aspekter af den menneskelige hud reparation svar. Delvis tykkelse sår blev skabt i human ex vivo hud og dyrket på tværs af en helbredende tid kursus. Hud sår biopsier blev indsamlet i fiksativ for hele mount farvning procedure. Faste prøver blev blokeret og inkuberet i primært antistof, med detektion opnået via fluorescerende konjugeret sekundært antistof. Sår blev kontrastellet og afbildet via konfokal mikroskopi, før de beregnede procentvis sårlukning (re-epitelisering) i hver biopsi. Ved anvendelse af denne protokol afslører vi, at 2 mm ekscisionssår skabt i sund donorhud er fuldt epiteliseret af dag 4-5 post-sår. Tværtimod reduceres lukningsraten for diabetiske hudsår betydeligt, ledsaget af forstyrret barrierereformation. Ved at kombinere menneskelige hud sår med en ny hel-mount farvning tilgang giver en hurtig og reproducerbar metode til at kvantificere ex vivo sår reparation. Samlet set giver denne protokol en værdifuld menneskelig platform til at evaluere effektiviteten af potentielle sårbehandlinger, omdanne prækliniske test og validering.

I denne rapport præsenterer vi en ny ex vivo hud sår og hele mount farvning tilgang til at vurdere faktorer, der påvirker den menneskelige hud reparation svar. Figur 1A viser et skema over procedurepipelinen, som kan udføres på 3-10 dage, afhængigt af sårinkubationstider. Sårene med delvis tykkelse dyrkes på membranstakke i luften : membrangrænseflade og kan opsamles til helmonteringsbegæring, indlejret i paraffin eller OLT-medium til generel histologi eller frosset i flydende nitrogen til biokemisk analyse (Figur 1B). Vi skaber generelt 2 mm sår i delvis tykkelse i midten af 6 mm explants. Sårets størrelse og den omgivende eksplant kan dog ændres afhængigt af kravene. Hele monteringsproceduren er blevet tilpasset med succes for både immunoperoxidase og immunfluorescens farvningsmetoder (Figur 1C).
Immunfluorescens giver mulighed for sondering af væv med flere antistoffer. Til dette anbefaler vi at bruge primære antistoffer opdrættet i forskellige arter og artsmatchede fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer for at begrænse reaktivitet på tværs af arter. Antistofkoncentrationer og inkubationstider skal optimeres. Hvis baggrundspletter observeres, reduceres antistofkoncentrationerne, vaskes trinene, og der tilsættes blokeringsbuffer til det sekundære antistof. Frisk vævs levedygtighed kan vurderes direkte med kommercielle levedygtighedsfarvningsmidler (se materialetabel). Vi viser også, at væv kan være fast post levedygtighed farvning og med succes afbildet, når det er praktisk egnet (Figur 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figur 1: Den menneskelige ex vivo-sår- og helmonteringspletmetode. (B) Diagram, der viser det humane ex vivo-system for sår i huden med analyser, der rutinemæssigt udføres på vævet. (C) Helmonteringsbejdning kan anvendes ved hjælp af både immunoperoxidase- og immunfluorescensteknikker. K14 = keratin 14. (D) Levende væv kan farves med kommercielle levedygtighed farvestoffer og afbildet med succes efter fiksering. Bar = 100 μm. Denne farvning blev udført i ikke-diabetisk hud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Den mest anvendelige anvendelse til helmontering af sår er at bestemme sårlukningshastigheden på en mere reproducerbar måde, end der kan leveres via histologisk sektion. Procentvis lukning blev kvantificeret som procentvis re-epitelisering af såroverfladen, som det fremgår af figur 2A. Dækningen af specifikke markører i procent kan måles fra det samlede sårareal eller som en procentdel af det re-epiteliserede sår. Vi karakteriserede helbredelse i sund (ikke-diabetisk) versus diabetisk hud på tværs af et tidsforløb på syv dage, indsamle sår på hver dag efter sår (repræsentative billeder, Figur 2B). Sunde hudsår lukket over tid som forventet, med fuld lukning observeret i de fleste prøver af dag 4-5. Tværtimod lukkede diabetiske hudsår ikke helt inden for den syvdages analyseperiode (Figur 2C). Der blev observeret en betydelig forsinkelse i sårlukningen mellem sunde og diabetiske hudsår ved sammenligning af helingshastigheder på hvert tidspunkt efter skaden (P < 0,001 til dag 6, P < 0,05 på dag 6 og P < 0,05 til P < 0,001 på dag 7).
Efter vurdering af de samlede sårlukningsrater; vi målte procentdelen af hele sårområdet (ydre område i figur 2A),hvor K14-positive celler kunne visualiseres (grøn farvning i figur 2B). Interessant, vi observerede, at i sunde ex vivo hud sår, K14 farvning toppede på dag 2 og derefter hurtigt faldt (betydning på hvert tidspunkt versus dag 2 peak, Figur 2D). Dette afspejler sandsynligvis gendannelsen af den tidlige epidermale barriere, bortset fra K14 antistofindtrængning gennem differentierede epidermale lag (se figur 2E skematisk). Under re-epithelialiseringsprocessen migrerer basallag (K14+ve) keratinocytter indad over det åbne sår, således at epidermis tættere på den ydre sårkant dannes tidligere end epidermis tættere på den indre sårkant (migrerende front). Mens den forreste kant af den nydannede epidermis fortsætter med at migrere for at lukke de resterende åbne sår, begynder den ydre kant epidermis at differentiere sig for at reformere de andre epidermale lag. I tidlig helbredelse, ville vi således forvente at se det meste af re-epiteliseret område består af basale (K14 + ve) celler, mens der i senere reparation K14 farvning er tabt som epidermis adskiller sig fra ydersiden indad (se hele mount billeder i figur 2E). Faldet i K14-farvningen i figur 2D (nedadgående pile) korrelerer derfor med øget epidermal differentiering. Interessant, synlige K14 farvning toppede tidligere i raske (dag 2) versus diabetiker (dag 4) sår, yderligere viser, at re-epithelialization og efterfølgende epidermal differentiering er forsinket i diabetisk hud sår.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figur 2: Helmonteringsbegæring afslører forstyrrede helingsrater hos diabetiker versus sund hud. Brightfield billeder viser keratin 14 (K14) farvning i rødt. Bar = 300 μm. (B) Repræsentative billeder af helbredelse over tid (dag efter sår) i sund og diabetisk hud. Bar = 500 μm. K14 = grøn. DAPI = blå kerner. (C) Kvantificering af sårlukningshastigheder (procentvis re-epitelialisering), der viser, at ex vivo-sår fra sund hud lukker betydeligt hurtigere end ex vivo-sår fra diabetisk hud. H = sund. Db = diabetiker. (D) Procent K14 farvning toppe tidligere i sund versus diabetisk hud og derefter falder i overensstemmelse med øget epidermal differentiering (pil ned). (E) K14 (basal epidermal celle) farvning går tabt som epidermis differentierer. D = differentieret. ND = ikke differentieret. Hvide syrede linjer viser indvendige og ydre sårkanter. Hvide pile = overflytningsretning. n = 6 sår pr. donor pr. tidspunkt. Middelværdi +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 og *** = P < 0,001. Sund og diabetiker sammenlignet på hvert helbredende tidspunkt i C (P værdi for mindst signifikant sammenligning). Tidsmæssig ændring i K14 farvning i forhold til peak for hver donor i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Vi brugte næste gang helmontering farvning til at udforske vævsudtryk og lokalisering af andre sårrelevante markører i ikke-diabetisk hud(Figur 3). Alle anvendte antistoffer og deres arbejdskoncentrationer findes i materialetabellen. Blodkar i det åbne sår farves positivt med alfa glat muskel actin (a-SMA) antistof, der anvendes i kombination med K14 til at afgrænse de epidermale kanter i lavere effekt billeder (Figur 3A). Den dermale matrix var plettet med antistoffer mod kollagen type I (COL 1) og fibronectin (Fn). Her kollagen blev observeret som rigelige tykke fibre, mens fibronectin fibre var sparsomme, bølget, og tynde(Figur 3A). Vores helmontering farvning tilgang er også i stand til at give celle niveau opløsning af farvning, som det fremgår for K14-positive keratinocytter(Figur 3B).
Endelig viser vi, at humane ex vivo sår besidder hjemmehørende immunceller, med Langerhans celler opdaget omkring nydannede epidermis på dag 3 post-sår (Figur 3C). Faktisk tyder disse resultater på, at helmonteringspletter kan bruges til at undersøge nøgleelementer i den helbredende reaktion, herunder betændelse, spredning og den ekstracellulære matrix (Figur 4A). Samlet set viser vores data, at den kombinerede ex vivo hud sår og hele montere farvning procedure er en gyldig metode til at vurdere forskellige aspekter af sunde og diabetiske (patologiske) menneskelige hud reparation.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figur 3: Optimering af hele monteret farvningsmetode til brug sammen med andre antistoffer. (A) Blodkar blev plettet med alfa glat muskel actin (α-SMA, grøn) og keratin 14 (K14, rød), mens matrixfibre blev farvet med kollagen I (COL 1, rød) og fibronectin (Fn, grøn). (B) Hele monteringsproceduren giver op til celleniveau opløsning af lokalisering (K14, grøn; K1, rød). (C) CD1a+ve Langerhans celler (grøn) observeret i nydannede epidermis. DAPI = blå kerner. Bar = 100 μm. Hvide syede linjer viser indvendige og ydre sårkanter og adskiller sår fra epidermis. Denne farvning blev udført i ikke-diabetisk hud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figur 4: Gyldigheden af hele monteringsbejdningsproceduren til vurdering af sårheling. (A) Illustration, der viser, hvordan hele monteringsbejdningsteknikken kan evaluere sårrelevante processer. Anvendte antistoffer = rød tekst. K14 = keratin 14. COL 1 = kollagen 1. Fn = fibronectin. (B) Helmonteringsbegævningsproceduren (blå pile) medfører mindre variation i målinger af sårlukning end standard histologiske analyser (røde pile). S1 = afsnit 1. VI = sårkant. Bar = 300 μm. Denne farvning blev udført i ikke-diabetisk hud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Her demonstrerer vi en optimeret teknik til vurdering af sårreparation ved hjælp af ex vivo menneskelig hud kombineret med en helmonteret farvningsmetode. Denne metode giver en præklinisk platform til vurdering af potentielle sårbehandlinger.

Human Ex vivo Sår Model og Whole-Mount farvning tilgang til præcist evaluere hudreparation

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

I denne artikel præsenterer vi en optimeret ex vivo-protokol til sår i huden, der kan give vigtige effektivitetsdata som en del af en klinisk translationel rørledning. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en høj gennemstrømning nøjagtig vurdering af sår reparation i levende menneskelig hud. Demonstrere proceduren vil blive Elizabeth Roberts, en postdoc forsker, og Alexandria Kidd, en forskningsassistent fra vores laboratorium.For at forberede en hudvævsprøve til sår, skal du placere huden dermis side ned i en 90 millimeter petriskål og bruge steril saks til at fjerne fedtvævet. Når alt fedtet er fjernet, skal huden anbringes i 25 milliliter HBSS suppleret med antibiotika i 10 minutter ved stuetemperatur med periodisk rysten for at fjerne restblod i fedtvæv. Efter 10 minutter skylles huden i 25 milliliter DPBS.Efter 10 minutter skal du gentage HBSS-skylningen uden antibiotika og derefter udføre en endelig skylning i 25 milliliter DPBS. Placer derefter en steril nylonfiltermembran på den absorberende padstak og tør hudens dermale side på steril gaze i en 90 millimeter petriskål for at fjerne resterende DPBS. Placer den tørrede hud dermis side ned på en ren 90 millimeter Petri parabol låg for at fjerne eventuelle resterende DPBS og duppe epidermis tør med frisk steril gaze.For at skabe et sår skal du trykke en to millimeter biopsi punch mod huden, mens du holder huden stram og vride forsigtigt. Brug en buet tandvæv pincet, afhente hver side af de cirka to millimeter diameter sår og krog buet Iris saks under såret. Brug en seks millimeter biopsi punch til biopsi omkring den centrale to millimeter sår til at skabe en seks millimeter explant med en delvis tykkelse to millimeter sår i midten.Placer derefter såret explant epidermis side op på nylonfilterets membranstak til en 1 til syv-dages inkubation ved 32 til 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Til fluorescerende farvning opsamles sårfuderne i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, der indeholder 500 mikroliter hudfikseringsmiddel pr. rør, og explanterne inkuberes natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag skal du udskifte fikseringsmærket med en milliliter farvningsvaskbuffer.Efter vasken skal hver prøve dækkes med ca. 150 mikroliter blokerende buffer og inkuberes i en time ved stuetemperatur. Efter fjernelse af blokeringsbufferen tilsættes 150 mikroliter primærantistof fortyndet i blokeringsbuffer pr. rør og inkuber såret explants natten over ved fire grader Celsius. Næste morgen skylles prøverne med 500 mikroliter farvningsvaskbuffer, der indeholder 0,2% natriumsanzid efterfulgt af tre skylninger i almindelig vaskebuffer.Efter vask, tilsæt 150 mikroliter af en passende florescence-konjugeret sekundært antistof fortyndet i farvning vask buffer til hver brønd for en time inkubation ved stuetemperatur. Ved afslutningen af inkubationen skylles explanten tre gange i 30 minutter i 500 mikroliter farvningsvaskbuffer pr. vask, før hver explant tilsmudses med 150 mikroliter DAPI i 10 minutter ved stuetemperatur. Til sidst vaskes explant to gange i 30 minutter med 500 mikroliter vaskebuffer pr. Vask.For explant imaging, placere en 60 millimeter Petri parabol på billedbehandling platform af en confocal mikroskop og tilføje en cirka en milliliter lag af DPBS til fadet. Brug pincet til at overføre såret explants til fadet. Når du har konfigureret billedbehandlingssoftwaren efter behov for eksperimentet, skal du placere såret i midten af billedplanet og hente billeder af sårbiopsierne.Hvis du vil udføre trådløs digital mikroskopafbildning for at få billeder i høj kvalitet på en omkostningseffektiv måde, skal du slutte en telefon eller bærbar computer til et trådløst digitalt mikroskop. Placer explants afviklet side op på et stykke laboratorievæv og fjerne eventuelle resterende vask buffer fra prøven. Placer derefter explanten i midten af mikroskopets synsfelt og anskaffe billeder ved hjælp af det tilsluttede kamera.Immunoperoxidase og immunfluorescens kan bruges til hele mount væv farvning. Derudover kan levende / død farvning udføres på frisk væv og afbildet før eller efter fiksering. Hele mount farvning af sår kan bruges til at bestemme sår lukning satser i en reproducerbar måde.I denne repræsentative analyse blev der observeret en sund lukning af hudsår efter fire til fem dage, mens diabetiske hudsår ikke kunne lukkes helt inden for den syv dage lange analyseperiode. K14 udtryk toppede på dag to i sunde hud sår før hurtigt faldende med øget epidermal differentiering. Denne re-epitelialisering og efterfølgende epidermal differentiering blev forsinket i diabetisk hud sår.Reformationen af den tidlige epidermale barriere udelukker K14 antistofindtrængning inden for de differentierede epidermale lag. Tidligt i re-epithelialiseringsprocessen migrerer K14 positive basallag keratinocytter indad over det åbne sår, således at epidermis tættere på den ydre sårkant dannes tidligere end epidermis tættere på den indre sårkant. Senere i reparationsfasen går K14-farvningen tabt, da epidermis adskiller sig fra ydersiden indad.Hele mount farvning kan også bruges til at studere udtryk og lokalisering af andre sår relevante markører i huden, samt tilstedeværelsen af immunceller af interesse på såret stedet på forskellige stadier af heling. Generering af reproducerbare ekscisionssår kan være udfordrende i starten. Vi vil anbefale at praktisere sårproceduren ved hjælp af overskydende hud.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering af en klinisk relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Model for Undersøgelse Epithelial Wound Reparation i en Native mikromiljø

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Dyrkning af retinale Pigment epitel celler på en Ex Vivo Model af alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hele-mount Konfokal mikroskopi for voksne øre hud: et modelsystem til at studere Neuro-kar forgrening morfogenese og immun celle Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescens og follikel kvantificering af kulturperler mus æggestokke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...