Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Wir danken Herrn Paolo Matteuci und Herrn George Smith für die Bereitstellung von Patientengewebe. Wir danken auch Miss Amber Rose Stafford für die Unterstützung bei der Gewebeentnahme und dem Daisy Appeal für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen.

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir eine optimierte Methode zur Bewertung des Wundverschlusses in menschlicher Ex-vivo-Haut mittels Ganzkörpergewebefärbung. Dies ist eine wichtige Ressource, um eine kritische Bewertung potenzieller Wundbehandlungen zu ermöglichen und ein besseres Verständnis der menschlichen Wundreparaturreaktion zu ermöglichen. Wir haben eine Heilungsbewertung bei Ex-vivo-Hautwunden veröffentlicht, die zuvor12,13, aber in diesen Berichten wurde der Whole-Mount-Färbeansatz nicht zur Messung des Wundverschlusses verwendet. Die Färbung auf ganzer Montage ist viel einfacher und erfordert weniger technische Erfahrung als die Standardhistologie, bei der Paraffin oder OCT eingebettet und Proben zerschnitten werden. Das Whole-Mount-Verfahren reduziert auch die experimentelle Variabilität und ermöglicht die Quantifizierung der gesamten Wunde und nicht nur eines einzelnen Querabschnitts an einer definierten Position innerhalb des Gewebes (siehe Abbildung 4B zur vergleichenden Veranschaulichung). Wir unterstützen voll und ganz die Bedeutung der Quantifizierung der Heilung der gesamten nicht-symmetrischen Wundstruktur, wie von Rhea und Dunnwald für akutemurine Wundenklar umrissen 14 . Diese Autoren zeigten, wie wichtig die serielle Schnittung von In-vivo-Exzisionswunden für reproduzierbare und präzise Messungen der Wundmorphologie ist. Serielle Schnitte könnten auch auf menschliche Ex-vivo-Wunden angewendet werden; Für eine genaue Quantifizierung des Wundverschlusses und der Reepithelisierung sollte jedoch die Hochdurchsatz-Ganzmontagefärbung die bevorzugte Methode sein. Wir weisen darauf hin, dass dieses Whole-Mount-Färbeprotokoll auch mit der anschließenden Verarbeitung (Wachs oder OCT) für die traditionelle histologische Analyse kompatibel sein sollte.
Ganzmontage ist nicht ohne Nachteile. Während es eine höhere Reproduzierbarkeit in Wundheilungsexperimenten bietet, erfordert es die Verwendung von mehr Gewebe für die Analyse als Standard-histologische Techniken. Dies kann ein Problem sein, wenn der Zugang zu Gewebe eingeschränkt ist, insbesondere wenn mehrere Antikörper bewertet werden müssen. Ein alternativer Ansatz wäre die Anwendung einer Schnittwundenmethode, bei der die Wundbreite relativ gleichmäßig ist und die Variabilität reduziert ist (wie in Maus- und menschliche Wunden15,16gezeigt). Exzisionswunden bleiben jedoch für die meisten pathologischen Wundtypen anwendbar17.
In dieser Studie wurden 2 mm teildicke Wunden in der Mitte von 6 mm Hauterregungen erzeugt. Diese Methode kann für alternative Exzisionswunde und Explantionsgrößen in verschiedenen Hauttiefen optimiert werden18. Darüber hinaus variiert die Kraft, die erforderlich ist, um Wunden zu erzeugen, zwischen den Spendern, wobei gealterte Haut weniger Kraft zur Biopsie benötigt. Wir würden auch vermeiden, Haut zu verwenden, die auffällige Dehnungsstreifen oder andere strukturelle Veränderungen aufweist. Wir haben eine Reihe von Antikörpern validiert, um verschiedene Aspekte der Ex-vivo-Heilungsreaktion zu berücksichtigen. Dieses Protokoll kann auch mit anderen hautrelevanten Antikörpern verwendet werden, bei denen Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten optimiert werden müssen. Dennoch glauben wir, dass unser Protokoll am besten für die absolute Quantifizierung des gesamten Wundverschlusses geeignet ist, gefolgt von einer räumlichen Bewertung spezifischer Proteine von Interesse. Während Whole-Mount eine reduzierte Auflösung der Immunlokalisierung im Vergleich zur histologischen Standardanalyse von Gewebeschnitten bietet, liefert es zusätzliche 3D-Informationen, die in der Standard-2D-Histologie fehlen.
Ein Vorbehalt bei der Beurteilung der Heilung in Ex-vivo-Haut im Vergleich zu In-vivo-Modellen ist, dass es keine systemische Reaktion gibt. Ein wichtiger Aspekt der Wundreparatur ist die Entzündung und anschließende Gewebegranulation, die durch einen Zustrom von Entzündungszellen und Endothelzellen aus dem Gefäß verursacht wird19. Trotz dieser Einschränkung bietet ex vivo Haut immer noch eine bessere Rekapitulation der klinischen Heilung als zellbasierte Wundtests. In-vitro-Experimente beinhalten im Allgemeinen Einzelzell-Monoschichten oder Co-Kulturen, die auf Gewebekulturkunststoff gezüchtet wurden, während ex vivo Haut eine native Umgebung bietet, um das Zellverhalten zu erforschen. In jüngerer Zeit sind eine Reihe von hautäquivalenten Systemen entstanden, bei denen die Haut in einer Laborumgebung aus künstlicher Matrix und isolierten Hautzellen gezüchtet wird20,21. Obwohl diese Modelle die menschliche Haut besser nachahmen als die meisten In-vitro-Ansätze, simulieren sie immer noch nicht vollständig die native Gewebeumgebung und sind im Allgemeinen zu zerbrechlich, um reproduzierbar zu verletzen. Darüber hinaus haben wir (und andere) gezeigt, dass ex vivo menschliches Hautgewebe ansässige Immunzellen behält, was zweifellos zur Reparatur beitragen wird22,23. Zukünftige Arbeiten sollten sich nun darauf konzentrieren, die Lebensfähigkeit und Immunkompetenz des Ex-vivo-Modells für die Heilungsbewertung im Spätstadium zu erweitern24. Eine Option ist die Weiterentwicklung vielversprechender Organ-on-a-Chip-Technologien, die in der Lage sind, die Lebensfähigkeit des Gewebes zu verlängern und die native Hautarchitektur für bis zu zwei Wochen in Kulturaufrechtzuerhalten 25. Ex-vivo-Modelle haben auch begonnen, die Bedeutung der Entzündungsreaktion der Haut zu berücksichtigen, indem sie erfolgreich Immunzellen wie Neutrophile in das Wirtsgewebeeinbauen 26 oder Wirtsgewebe mit Antikörpern injizieren, um eine Immunreaktionauszulösen 27. Wir gehen davon aus, dass diese Erkenntnisse den Weg für die Entwicklung verfeinerter und übersetzbarer Methoden in der Zukunft ebnen werden.
Ein großer Vorteil der Verwendung von Ex-vivo-Haut zur Messung des Wundverschlusses ist die Fähigkeit, Heilungsraten in gesundem (z. B. nicht-diabetischem) und pathologischem (z. B. diabetischem oder gealtertem) Gewebe zu vergleichen. Hier haben wir gezeigt, dass Re-Epithelisierung und Barrierebildung bei diabetischen versus gesunden Ex-vivo-Wunden tatsächlich beeinträchtigt sind. In der Tat bietet dies einen Weg für die präklinische Bewertung der pathologischen Reparatur, wo Alterung und Diabetes Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung chronischer Wunden sind1. Während in vitro pathologische Modelle existieren, wie Zellen, die aus gealtertem und diabetischem Gewebe isoliert wurden, oder Zellen, die in hoher Glukose kultiviertwurden,um Hyperglykämie nachzuahmen28,29, können diese Zellen schnell ihren Phänotyp verlieren, sobald sie aus der In-vivo-Mikroumgebung entfernt wurden. Ein wichtiger Bestandteil der extrinsischen pathologischen Heilungsumgebung ist die dermale Matrix, die sowohl beim Altern als auch bei Diabetes30verändert wird. Tatsächlich beeinflusst diese gestörte Matrix das Verhalten der ansässigen und naiven Fibroblasten31,32. Daher ist die Bedeutung der Untersuchung von Zellen in ihrer Wirtsgewebeumgebung nicht zu unterschätzen.
Zusammenfassend bietet unser Protokoll eine wichtige Plattform, um die Reepithelisierung menschlicher Wunden zu quantifizieren, regulatorische Faktoren zu erforschen und die Validität und Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu testen12,13. Während präklinische Tests immer noch In-vivo-Ansätze erfordern, sollte eine kombinierte Strategie, bei der ex vivo menschliches Gewebe und in vivo murine Verwundungen verwendet werden, den präklinischen Weg verfeinern, den Tiereinsatz reduzieren und gleichzeitig die artübergreifende Übersetzbarkeit erhöhen.

Chronische, nicht heilende Wunden, die bei älteren Menschen und Diabetikern weit verbreitet sind, sind ein stark ungeschätzter Bereich des klinischen ungedeckten Bedarfs. Diese Wunden stellen eine große physische und psychische Belastung für die Patienten dar und kosten Gesundheitsdienstleister jedes Jahr Milliarden, um1zu behandeln. Trotz eines verbesserten Verständnisses der Wundbiologie und Fortschritten in der Technologie können bis zu 40% der chronischen Wunden nach bester Standardversorgung immer noch nicht heilen2. So benötigen 14-26% der Patienten mit diabetischen Fußgeschwüren anschließend eine Amputation3,während die 5-Jahres-Sterblichkeitsrate nach der Amputation bei etwa 70%liegt 4. Infolgedessen besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung wirksamer neuer Therapien, um die Lebensqualität der Patienten zu verbessern und gleichzeitig die erhebliche Gesundheitsbelastung durch schlecht heilende Wunden zu reduzieren. Schlecht prädiktive präklinische Modelle bleiben eine erhebliche Hürde für die Entwicklung wirksamer neuer Therapien.
Die Wundreparatur ist ein dynamischer und facettenreicher Prozess, der eine Vielzahl von Zelltypen, unzählige Kommunikationsebenen und eine Gewebeumgebung umfasst, die zeitlich umgestaltet wird. Die Hautheilung wird durch vier haupt reparative Stadien untermauert: Hämostase, Entzündung, Proliferation und Matrixumbau. Diese Stadien wirken letztendlich, um Blutverlust und Infektionen zu verhindern, die Wundoberfläche zu schließen (ein Prozess, der als Reepithelisierung bezeichnet wird) und die Haut in einen unverletzten Zustandzurückvergeben 5. Chronische Wunden sind mit einer vielfältigen Ätiologie und einer weit verbreiteten Störung der Heilungsprozesse verbunden6, was die Identifizierung therapeutischer Ziele weiter erschwert. Dennoch wurde eine breite Palette von Modellen entwickelt, um sowohl die molekularen und zellulären Treiber der Wundpathologie aufzuklären als auch neue therapeutische Ansätze zu testen7.
Das am häufigsten verwendete Wundreparaturmodell ist die akute Wunde in der Maus. Mäuse sind für mechanistische Studien in hohem Maße beherrschbar und liefern validierte Modelle des Alterns und Diabetes8. Trotz der allgemeinen Ähnlichkeiten zwischen der Heilung von Maus und Mensch bleiben Unterschiede zwischen den Arten in der Hautstruktur und der Heilungsdynamik bestehen. Dies bedeutet, dass die meisten murinen Wunduntersuchungen nicht leicht auf die Klinik übertragen werdenkönnen 9. Folglich gab es einen Schub in Richtung menschlicher in vitro und ex vivo Systeme mit hoher Anwendbarkeit und Übersetzbarkeit10,11.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von Exzisionswunden mit teildicker Dicke in ex vivo menschlicher Haut. Wir skizzieren auch unseren Whole-Mount-Färbeansatz als eine hochgradig reproduzierbare Methode zur Bewertung der Ex-vivo-Heilung menschlicher Haut. Wir zeigen den Verlauf der epidermalen Reparatur (Re-Epithelisierung) und der anschließenden Barrierebildung und bewerten die Rate des Wundverschlusses bei gesunder und diabetischer menschlicher Haut. Schließlich zeigen wir, wie die Ganzkörperfärbung für die Verwendung mit einer Reihe von Antikörpern angepasst werden kann, um verschiedene Aspekte der Heilungsreaktion zu beurteilen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Chronische nicht heilende Wunden, die vor allem ältere Menschen und Diabetiker betreffen, sind ein bedeutender Bereich des klinisch ungedeckten Bedarfs. Leider sind die derzeitigen chronischen Wundbehandlungen unzureichend, während die verfügbaren präklinischen Modelle die klinische Wirksamkeit neuer Therapien schlecht vorhersagen. Hier beschreiben wir ein präklines Modell mit hohem Durchsatz, um mehrere Aspekte der menschlichen Hautreparaturreaktion zu bewerten. Wunden mit partieller Dicke wurden in der menschlichen Ex-vivo-Haut erzeugt und über einen Heilungszeitverlauf kultiviert. Hautwundbiopsien wurden als Fixiermittel für das Ganzfärbeverfahren gesammelt. Fixierte Proben wurden blockiert und in primären Antikörpern inkubiert, wobei der Nachweis über fluoreszierend konjugierte sekundäre Antikörper erfolgen sollte. Die Wunden wurden gegengefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, bevor der prozentuale Wundverschluss (Reepithelisierung) in jeder Biopsie berechnet wurde. Unter Anwendung dieses Protokolls zeigen wir, dass 2 mm Exzisionswunden, die in gesunder Spenderhaut entstehen, bis zum Tag 4-5 nach der Verwundung vollständig reepithelialisiert werden. Im Gegenteil, die Verschlussraten von diabetischen Hautwunden sind signifikant reduziert, begleitet von einer gestörten Barrierereformation. Die Kombination von menschlichen Hautwunden mit einem neuartigen Whole-Mount-Färbeansatz ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Ex-vivo-Wundreparatur. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine wertvolle menschliche Plattform, um die Wirksamkeit potenzieller Wundtherapien zu bewerten und präklinische Tests und Validierungen zu transformieren.

In diesem Bericht stellen wir einen neuartigen Ex-vivo-Ansatz zur Hautverwundung und ganzer Färbung vor, um Faktoren zu bewerten, die die menschliche Hautreparaturreaktion beeinflussen. Abbildung 1A zeigt ein Schema der Prozedurleitung, die je nach Wundinkubationszeiten in 3-10 Tagen durchgeführt werden kann. Die teildicken Wunden werden auf Membranstapeln an der Luft: Membranschnittstelle kultiviert und können für die Färbung auf ganzer Montage gesammelt, in Paraffin oder OCT-Medium für die allgemeine Histologie eingebettet oder für die biochemische Analyse in flüssigem Stickstoff eingefroren werden (Abbildung 1B). Wir erzeugen in der Regel 2 mm teildicke Wunden in der Mitte von 6 mm Explantierungen. Die Größe der Wunde und der umgebenden Explant kann jedoch je nach Anforderung verändert werden. Das Whole-Mount-Verfahren wurde sowohl für immunperoxidase- als auch für Immunfluoreszenz-Färbemethoden erfolgreich angepasst (Abbildung 1C).
Die Immunfluoreszenz ermöglicht die Untersuchung von Gewebe mit mehreren Antikörpern. Dazu empfehlen wir, primäre Antikörper zu verwenden, die in verschiedenen Spezies gezüchtet wurden, und spezies-abgestimmte fluoreszierende fluoreszierende sekundäre Antikörper, um die reaktivität über verschiedene Spezies zu begrenzen. Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten müssen optimiert werden. Wenn eine Hintergrundfärbung beobachtet wird, reduzieren Sie die Antikörperkonzentrationen, erhöhen Sie die Waschschritte und fügen Sie dem sekundären Antikörper einen Blockierungspuffer hinzu. Die Lebensfähigkeit von Frischem Gewebe kann direkt mit handelsüblichen Lebensfähigkeitsfarbstoffen beurteilt werden (siehe Materialtabelle). Wir zeigen auch, dass Gewebe nach der Lebensfähigkeitsfärbung fixiert und erfolgreich abgebildet werden kann, wenn es praktisch geeignet ist (Abbildung 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Abbildung 1: Der Ansatz der menschlichen Ex-vivo-Verwundung und der Färbung auf ganzer Montierung. (A) Pipeline, die den verfahrenstechnischen Arbeitsablauf von der Hauterfassung und der Durchführung von Ex-vivo-Wunden bis hin zur Färbung von Gewebe und der Analyse von Daten darstellt. (B) Diagramm zur Demonstration des menschlichen Ex-vivo-Hautwundkultursystems mit routinemäßig durchgeführten Analysen am Gewebe. (C) Die Ganzmontagefärbung kann sowohl mit Immunperoxidase- als auch mit Immunfluoreszenztechniken eingesetzt werden. K14 = Keratin 14. (D) Lebendes Gewebe kann mit handelsüblichen Lebensfähigkeitsfarbstoffen gefärbt und nach der Fixierung erfolgreich abgebildet werden. Bar = 100 μm. Diese Färbung wurde bei nicht-diabetischer Haut durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die am weitesten verbreitete Anwendung für die Ganzfärbung von Wunden besteht darin, die Wundverschlussrate reproduzierbarer zu bestimmen, als dies durch histologische Schnitte möglich ist. Der prozentuale Verschluss wurde als prozentuale Reepithelisierung der Wundoberfläche quantifiziert, wie in Abbildung 2Agezeigt. Die prozentuale Flächenabdeckung bestimmter Marker kann aus der gesamten Wundfläche oder als Prozentsatz der reepithelialisierten Wunde gemessen werden. Wir charakterisierten die Heilung bei gesunder (nicht diabetischer) versus diabetischer Haut über einen Zeitraum von sieben Tagen und sammelten Wunden an jedem Tag nach der Verwundung (repräsentative Bilder, Abbildung 2B). Gesunde Hautwunden schlossen sich im Laufe der Zeit wie erwartet, wobei in den meisten Proben bis zum Tag 4-5 ein vollständiger Verschluss beobachtet wurde. Im Gegenteil, diabetische Hautwunden konnten sich innerhalb des siebentägigen Analysezeitraums nicht vollständig schließen (Abbildung 2C). Eine signifikante Verzögerung des Wundverschlusses wurde zwischen gesunden und diabetischen Hautwunden beobachtet, wenn die Heilungsraten zu jedem Zeitpunkt nach der Verletzung verglichen wurden(P < 0,001 bis Tag 6, P < 0,05 an Tag 6 und P < 0,05 bis P < 0,001 an Tag 7).
Nach Bewertung der Gesamtverschlussraten der Wunde; Wir haben den Prozentsatz der gesamten Wundfläche (äußerer Bereich in Abbildung 2A)gemessen, in dem K14-positive Zellen sichtbar gemacht werden konnten (grüne Färbung in Abbildung 2B). Interessanterweise beobachteten wir, dass bei gesunden Ex-vivo-Hautwunden die K14-Färbung am Tag 2 ihren Höhepunkt erreichte und dann schnell abnahm (Signifikanz zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zum Tag 2-Peak, Abbildung 2D). Dies spiegelt wahrscheinlich eine Neubildung der frühen epidermalen Barriere wider, mit Ausnahme der K14-Antikörperpenetration durch differenzierte epidermale Schichten (siehe Abbildung 2E schematisch). Während des Re-Epithelisierungsprozesses wandern Basalschicht-Keratinozyten (K14+ve) über die offene Wunde nach innen, so dass sich die Epidermis näher am äußeren Wundrand früher bildet als die Epidermis näher am inneren Wundrand (wandernde Vorderseite). Während die Vorderkante der neu gebildeten Epidermis weiter wandert, um die verbleibende offene Wunde zu schließen, beginnt sich die äußere Randepidermis zu differenzieren, um die anderen epidermalen Schichten zu reformieren. In der frühen Heilung würden wir daher erwarten, dass der größte Teil des reepithelialisierten Bereichs aus Basalzellen (K14 + ve) besteht, während bei späterer Reparatur die K14-Färbung verloren geht, da sich die Epidermis von außen nach innen unterscheidet (siehe Ganzbildbilder in Abbildung 2E). Daher korreliert der in Abbildung 2D gezeigte Rückgang der K14-Färbung (Abwärtspfeile) mit einer erhöhten epidermalen Differenzierung. Interessanterweise erreichte die sichtbare K14-Färbung früher ihren Höhepunkt bei gesunden (Tag 2) im Vergleich zu diabetischen (Tag 4) Wunden, was weiter zeigt, dass die Reepithelisierung und die anschließende epidermale Differenzierung bei diabetischen Hautwunden verzögert sind.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Färbung auf ganzer Montierung zeigt gestörte Heilungsraten bei diabetischer und gesunder Haut. (A) Die Methode zur Quantifizierung des Wundverschlusses aus äußeren und inneren Wundmessungen. Hellfeldbilder zeigen Keratin 14 (K14) Färbung in Rot. Balken = 300 μm. (B) Repräsentative Bilder der Heilung im Laufe der Zeit (Tag nach der Verwundung) in gesunder und diabetischer Haut. Bar = 500 μm. K14 = grün. DAPI = blaue Kerne. (C) Quantifizierung der Wundverschlussraten (prozentuale Reepithelisierung), die zeigt, dass ex vivo Wunden von gesunder Haut signifikant schneller schließen als ex vivo Wunden von diabetischer Haut. H = gesund. Db = Diabetiker. (D) Die prozentuale K14-Färbung erreicht bei gesunder und diabetischer Haut früher ihren Höhepunkt und nimmt dann im Einklang mit einer erhöhten epidermalen Differenzierung ab (Pfeile nach unten). (E) K14 (basale epidermale Zelle) Färbung geht verloren, wenn sich die Epidermis differenziert. D = differenziert. ND = nicht differenziert. Weiß gepunktete Linien zeigen innere und äußere Wundränder. Weiße Pfeile = Richtung der Migration. n = 6 Wunden pro Spender, pro Zeitpunkt. Mittelwert +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 und *** = P < 0,001. Gesund und diabetisch im Vergleich zu jedem Heilungszeitpunkt in C (P-Wert für den geringsten signifikanten Vergleich). Zeitliche Veränderung der K14-Färbung im Vergleich zum Peak für jeden Spender in D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Als nächstes verwendeten wir die Ganzkörperfärbung, um die Gewebeexpression und Lokalisation anderer wundrelevanter Marker in nicht-diabetischer Haut zu untersuchen (Abbildung 3). Alle verwendeten Antikörper und ihre Arbeitskonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Blutgefäße in der offenen Wunde waren positiv mit einem Alpha-Glattmuskel-Aktin -Antikörper (a-SMA) gefärbt, der in Kombination mit K14 zur Abgrenzung der epidermalen Ränder in Bildern mit geringerer Leistung verwendet wurde (Abbildung 3A). Die dermale Matrix wurde mit Antikörpern gegen Kollagen Typ I (COL 1) und Fibronektin (Fn) gefärbt. Hier wurde Kollagen als reichlich dicke Fasern beobachtet, während Fibronektinfasern spärlich, wellig und dünn waren (Abbildung 3A). Unser Whole-Mount-Färbeansatz ist auch in der Lage, eine Auflösung der Färbung auf Zellebene zu erreichen, wie für K14-positive Keratinozyten gezeigt wurde (Abbildung 3B).
Schließlich zeigen wir, dass menschliche Ex-vivo-Wunden residente Immunzellen besitzen, wobei Langerhans-Zellen am Tag 3 nach der Verwundung um die neu gebildete Epidermis herum nachgewiesen wurden (Abbildung 3C). Tatsächlich deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Färbung des ganzen Mounts verwendet werden kann, um Schlüsselmerkmale der Heilungsreaktion einschließlich Entzündung, Proliferation und der extrazellulären Matrix zu untersuchen (Abbildung 4A). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass das kombinierte Ex-vivo-Verfahren zur Hautverwundung und zur Färbung ganzer Montierung eine gültige Methode zur Beurteilung verschiedener Aspekte der gesunden und diabetischen (pathologischen) menschlichen Hautreparatur ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Abbildung 3: Optimierung des Whole-Mount-Färbeansatzes für die Verwendung mit anderen Antikörpern. (A) Blutgefäße wurden mit Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA, grün) und Keratin 14 (K14, rot) gefärbt, während Matrixfasern mit Kollagen I (COL 1, rot) und Fibronektin (Fn, grün) gefärbt wurden. (B) Das Whole-Mount-Verfahren bietet eine Auflösung der Lokalisierung auf Zellebene (K14, grün; K1, rot). (C) CD1a+ve Langerhans-Zellen (grün) beobachtet in neu gebildeter Epidermis. DAPI = blaue Kerne. Bar = 100 μm. Weiße gepunktete Linien zeigen innere und äußere Wundränder und trennen die Wunde von der Epidermis. Diese Färbung wurde bei nicht-diabetischer Haut durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Abbildung 4: Validität des Whole-Mount-Färbeverfahrens zur Beurteilung der Wundheilung. (A) Illustration, wie die Whole-Mount-Färbetechnik wundrelevante Prozesse bewerten kann. Verwendete Antikörper = roter Text. K14 = Keratin 14. COL 1 = Kollagen 1. Fn = Fibronektin. (B) Das Färbungsverfahren auf ganzer Montierung (blaue Pfeile) führt zu einer geringeren Variabilität der Wundverschlussmessungen als die histologische Standardanalyse (rote Pfeile). S1 = Abschnitt 1. WE = Wundkante. Bar = 300 μm. Diese Färbung wurde bei nicht-diabetischer Haut durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Hier demonstrieren wir eine optimierte Technik zur Beurteilung der Wundreparatur mit ex vivo menschlicher Haut in Kombination mit einem Whole-Mount-Färbeansatz. Diese Methodik bietet eine präklinische Plattform für die Bewertung potenzieller Wundtherapien.

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

In diesem Artikel stellen wir ein optimiertes Ex-vivo-Protokoll für die Verwundung menschlicher Haut vor, das wichtige Wirksamkeitsdaten als Teil einer klinischen translationalen Pipeline liefern kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue Beurteilung der Wundreparatur in lebender menschlicher Haut mit hohem Durchsatz ermöglicht. Elizabeth Roberts, eine Postdoktorandin, und Alexandria Kidd, eine Forschungsassistentin aus unserem Labor, demonstrieren das Verfahren.Um eine Hautgewebeprobe auf die Verwundung vorzubereiten, legen Sie die Hautdermis mit der Seite nach unten in eine 90 Millimeter Petrischale und entfernen Sie mit einer sterilen Schere das Fettgewebe. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, legen Sie die Haut in 25 Milliliter HBSS, die mit Antibiotika für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit intermittierendem Schütteln ergänzt werden, um Restblut im Fettgewebe zu entfernen. Nach 10 Minuten die Haut in 25 Millilitern DPBS ausspülen.Wiederholen Sie nach 10 Minuten die HBSS-Spülung ohne Antibiotika und führen Sie dann eine abschließende Spülung in 25 Millilitern DPBS durch. Legen Sie dann eine sterile Nylonfiltermembran auf den absorbierenden Pad-Stapel und trocknen Sie die Hautseite auf steriler Gaze in einer 90-Millimeter-Petrischale, um verbleibende DPBS zu entfernen. Legen Sie die getrocknete Hautdermis mit der Seite nach unten auf einen sauberen 90-Millimeter-Petrischalendeckel, um eventuelle DPBS-Reste zu entfernen, und tupfen Sie die Epidermis mit frischer steriler Gaze trocken.Um eine Wunde zu erzeugen, drücken Sie einen zwei Millimeter großen Biopsiestempel gegen die Haut, während Sie die Haut fest halten und sanft verdrehen. Nehmen Sie mit einer gekrümmten Zahngewebezette jede Seite der etwa zwei Millimeter großen Wunde auf und haken Sie die gekrümmte Irisschere unter die Wunde. Verwenden Sie einen Sechs-Millimeter-Biopsiestempel, um die zentrale Zwei-Millimeter-Wunde zu biopsieren, um eine Sechs-Millimeter-Explantierung mit einer Teildicke von zwei Millimetern in der Mitte zu erzeugen.Legen Sie dann die Wundentstehungsepidermis mit der Seite nach oben auf den Nylonfiltermembranstapel für eine ein- bis siebentägige Inkubation bei 32 bis 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Für die fluoreszierende Färbung die Wundexplants in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Hautfixiermittel pro Röhrchen sammeln und die Explanten über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel durch einen Milliliter Färbewaschpuffer.Nach dem Waschen jede Probe mit ca. 150 Mikrolitern Sperrpuffer abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Entfernen des Blockierenden Puffers 150 Mikroliter primärer Antikörper, verdünnt in Blockierpuffer pro Röhrchen, und die Wundentnahmen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen spülen Sie die Proben mit 500 Mikrolitern Färbewaschpuffer mit 0,2% Natriumazid, gefolgt von drei Spülungen im regulären Waschpuffer.Nach dem Waschen werden 150 Mikroliter eines geeigneten floreszenzkonjugierten sekundären Antikörpers, der in Färbewaschpuffer verdünnt ist, für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in jede Vertiefung gegeben. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Explantation dreimal für 30 Minuten in 500 Mikrolitern Färbewaschpuffer pro Waschgang ab, bevor Sie jede Explantation mit 150 Mikrolitern DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur gegenfärben. Zum Schluss die Explant zwei Mal für 30 Minuten mit 500 Mikrolitern Waschpuffer pro Waschgang waschen.Für die Explant-Bildgebung legen Sie eine 60-Millimeter-Petrischale auf die Bildgebungsplattform eines konfokalen Mikroskops und fügen Sie der Schüssel eine etwa einen Milliliter große DpBS-Schicht hinzu. Verwenden Sie eine Zette, um die Wunderregungen in die Schüssel zu übertragen. Nachdem Sie die Bildgebungssoftware entsprechend dem Experiment eingerichtet haben, positionieren Sie die Wunde in der Mitte der Bildgebungsebene und erfassen Sie Bilder der Wundbiopsien.Um eine drahtlose digitale Mikroskopbildgebung durchzuführen, um qualitativ hochwertige Bilder auf kostengünstige Weise zu erhalten, schließen Sie ein Telefon oder einen Laptop an ein drahtloses Digitalmikroskop an. Legen Sie die mit der Seite nach oben aufgezogenen Explanten auf ein Stück Laborgewebe und entfernen Sie den verbleibenden Waschpuffer aus der Probe. Positionieren Sie dann die Explant in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops und erfassen Sie Bilder mit der angeschlossenen Kamera.Immunperoxidase und Immunfluoreszenz können für die Färbung des gesamten Mount-Gewebes verwendet werden. Darüber hinaus können lebende / tote Flecken auf frischem Gewebe durchgeführt und vor oder nach der Fixierung abgebildet werden. Die Ganzkornfärbung von Wunden kann verwendet werden, um die Wundverschlussraten reproduzierbar zu bestimmen.In dieser repräsentativen Analyse wurde ein gesunder Hautwundverschluss nach vier bis fünf Tagen beobachtet, während diabetische Hautwunden innerhalb des siebentägigen Analysezeitraums nicht vollständig geschlossen wurden. Die K14-Expression erreichte am zweiten Tag in gesunden Hautwunden ihren Höhepunkt, bevor sie mit erhöhter epidermaler Differenzierung schnell abnahm. Diese Reepithelisierung und anschließende epidermale Differenzierung verzögerte sich in den diabetischen Hautwunden.Die Reformation der frühen epidermalen Barriere schließt die Durchdringung von K14-Antikörpern innerhalb der differenzierten epidermalen Schichten aus. Zu Beginn des Reepithelisierungsprozesses wandern K14-positive Basalschichtkeratinozyten über die offene Wunde nach innen, so dass sich die Epidermis näher am äußeren Wundrand bildet als die Epidermis näher am inneren Wundrand. Später in der Reparaturphase geht die K14-Färbung verloren, da sich die Epidermis nach innen von außen unterscheidet.Die Färbung des gesamten Mounts kann auch verwendet werden, um die Expression und Lokalisation anderer wundrelevanter Marker in der Haut sowie das Vorhandensein von Immunzellen von Interesse an der Wundstelle in verschiedenen Stadien der Heilung zu untersuchen. Die Erzeugung reproduzierbarer Exzisionswunden kann zunächst eine Herausforderung sein. Wir empfehlen, das Wundverfahren mit überschüssiger Haut zu üben.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

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Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

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