Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

ברצוננו להודות למר פאולו מטוצ'י ולמר ג'ורג' סמית על שסיפקו רקמת מטופל. אנו גם מודים לגברת אמבר רוז סטפורד על סיוע באיסוף רקמות ובערעור דייזי על אספקת מתקני מעבדה.

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו מתארים שיטה ממוטבת להערכת סגירת פצעים בעור ex vivo אנושי באמצעות כתמי רקמות להרכבה מלאה. זהו משאב חשוב כדי לאפשר הערכה קריטית של טיפולים פצע פוטנציאלי, ולספק הבנה טובה יותר של התגובה לתיקון הפצע האנושי. פרסמנו הערכת ריפוי בפצעי עור ex vivo בעבר12,13, עדיין בדוחות אלה הגישה מכתימה הר כולו לא שימש למדידת סגירת פצע. כתמים בהרכבה מלאה קלים בהרבה ודורשים פחות ניסיון טכני מאשר היסתולוגיה סטנדרטית, הכוללת הטמעה של פרפין או OCT וחתך של דגימות. הליך ההרכבה כולה גם מפחית את השונות הניסיונית, ומאפשר כימות של הפצע כולו ולא רק מקטע רוחבי אחד במיקום מוגדר בתוך הרקמה (ראו איור 4B להמחשה השוואתית). אנו תומכים באופן מלא בחשיבות של כימות ריפוי של כל מבנה הפצע הלא סימטרי, כפי שמתואר בבירור על ידי ריאה ודאנוולד לפצעים חריפים מורינים14. מחברים אלה הראו את החשיבות של חתך סדרתי בפצעים מווסתים ויוו למדידות ניתנות לשחזור ומדויקות של מורפולוגיה הפצע. חתך סדרתי יכול להיות מיושם באותה מידה על פצעי ex vivo אנושיים; עם זאת, לכימות מדויק של סגירת פצעים ואפיתלציה מחדש, כתמים שלם תפוקה גבוהה צריך להיות השיטה המועדפת. אנו מציינים כי פרוטוקול הכתמה שלם זה צריך להיות תואם גם עם עיבוד עוקב (שעווה או OCT) לניתוח היסתולוגי מסורתי.
כתמים בהרכבה שלמה אינם נטולי חסרונות. אמנם הוא מאפשר רבייה גבוהה יותר בניסויים לריפוי פצעים, אך הוא דורש שימוש ביותר רקמות לניתוח מאשר טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות. זה עשוי להיות בעיה שבה הגישה לרקמות מוגבלת, במיוחד כאשר נוגדנים מרובים צריכים להיות מוערכים. גישה חלופית תהיה להשתמש בשיטת פציעה סינג'ית שבה רוחב הפצע אחיד יחסית והשונות מצטמצמת (כפי שמוצג בפצעי עכבר ואדם15,16). עם זאת, פצעים כריתה נשארים ישימים יותר לרוב סוגי הפצעים הפתולוגיים17.
במחקר זה, פצעי עובי חלקי 2 מ"מ נוצרו במרכז של 6 מ"מ עור explants. שיטה זו עשויה להיות מותאמת לפצעים כריתתיים אלטרנטיביים וגדלים מסבירים במעמקי עור שונים18. בנוסף, הכוח הנדרש ליצירת פצעים ישתנה בין תורמים, שם העור המזדקן ידרוש פחות כוח לביופסיה. כמו כן, נמנע משימוש בעור המציג סימני מתיחה בולטים או שינויים מבניים אחרים. אימתנו מגוון נוגדנים כדי לשקול היבטים שונים של תגובת הריפוי ex vivo. פרוטוקול זה עשוי לשמש גם עם נוגדנים אחרים הקשורים לעור, שבו ריכוזי נוגדנים זמני דגירה יהיה צורך אופטימיזציה. עם זאת, אנו מאמינים הפרוטוקול שלנו מתאים ביותר לכימות מוחלט של סגירת פצע מוחלט, ואחריו הערכה מרחבית של חלבונים ספציפיים של עניין. בעוד הר מלא מספק רזולוציה מופחתת של אימונולוקלization לעומת ניתוח היסתולוגי סטנדרטי של מקטעי רקמות, הוא מספק מידע תלת-ממדי נוסף שחסר בהצטולוגיה דו-ממדית סטנדרטית.
אזהרה אחת של הערכת ריפוי בעור ex vivo לעומת מודלים vivo היא כי הוא חסר תגובה מערכתית. היבט חשוב של תיקון הפצע הוא דלקת וגרגר רקמות לאחר מכן, אשר נגרמת על ידי זרם של תאים דלקתיים ותאי אנדותל מן vasculature19. למרות מגבלה זו, עור ex vivo עדיין מספק recapitulation טוב יותר של ריפוי קליני מאשר בדיקות פצע מבוססות תא. ניסויי במבחנה באופן כללי כוללים monolayers סוג תא יחיד או תרבויות משותפות גדל על פלסטיק תרבית רקמות, בעוד עור ex vivo מספק סביבה מקומית לחקור את התנהגות התא. לאחרונה, מספר מערכות שווה ערך לעור הופיעו, שם העור גדל בסביבת מעבדה מטריצה מלאכותית ותאי עור מבודדים20,21. למרות מודלים אלה לחקות עור אנושי טוב יותר מאשר רוב גישות במבחנה, הם עדיין לא לגמרי לדמות את סביבת הרקמה המקומית והם בדרך כלל שבירים מדי כדי לפגוע ברבייה. בנוסף, אנחנו (ואחרים) הוכחנו כי רקמת העור האנושית ex vivo שומרת על תאי מערכת החיסון המקומיים, אשר ללא ספק יתרום לתיקון22,23. עבודה עתידית צריכה כעת להתמקד בהרחבת הכדאיות והאימונו-כשירות של מודל ex vivo להערכת ריפוי בשלב מאוחר24. אפשרות אחת היא קידום נוסף של טכנולוגיות מבטיחות של איברים על שבב המסוגלות להאריך את הכדאיות של הרקמות ולשמור על ארכיטקטורת עור מקומית עד שבועיים בתרבות25. מודלים Ex vivo החלו גם לשקול את החשיבות של התגובה הדלקתית בעור על ידי שילוב מוצלח של תאים חיסוניים, כגון נויטרופילים, לתוך הרקמה המארחת26 או הזרקת רקמה מארחת עם נוגדנים כדי לעורר תגובה חיסונית27. אנו צופים כי ממצאים אלה יסללו את הדרך לפיתוח שיטות מעודנות ותרגום יותר בעתיד.
יתרון מרכזי בשימוש בעור ex vivo למדידת סגירת פצע הוא היכולת להשוות שיעורי ריפוי בריא (למשל, לא סוכרתי) לעומת פתולוגי (למשל, סוכרתי או מיושן) רקמה. כאן הראינו כי אפיתל מחדש היווצרות מחסום אכן לקויים בפצעי ex vivo סוכרתיים לעומת בריאים. ואכן, זה מספק מסלול להערכה פרה קלינית של תיקון פתולוגי, שבו הזדקנות וסוכרת הם גורמי סיכון עיקריים לפיתוח פצעים כרוניים1. בעוד מודלים פתולוגיים במבחנה קיימים, כגון תאים מבודדים מרקמה מיושנת וחולה סוכרת, או תאים בתרבית גלוקוז גבוהה כדי לחקות היפרגליקמיה28,29, תאים אלה יכולים לאבד במהירות את הפנוטיפ שלהם לאחר שהוסרו ממיקרו-סביבה in vivo. מרכיב חשוב בסביבת הריפוי הפתולוגית הקיצונית הוא מטריצת העור, אשר משתנה הן בהזדקנות והן בסוכרת30. ואכן, מטריצה מטרידה זו משפיעה על התנהגותם של פיברובלסטים מקומייםותמימים 31,32. לכן, לא ניתן להמעיט בחשיבות של לימוד תאים בסביבת הרקמה המארחת שלהם.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו מספק פלטפורמה חשובה לכמת מחדש אפיתל הפצע האנושי, לחקור גורמים רגולטוריים ולבחון את התוקף והיעילות של טיפולים פוטנציאליים12,13. בעוד שבדיקות פרה-קליניות עדיין דורשות גישות vivo, אסטרטגיה משולבת באמצעות רקמה אנושית ex vivo ופצעים ב- vivo murine צריכים לחדד את המסלול הטרום קליני, ובכך להפחית את השימוש בבעלי חיים תוך הגדלת יכולת התרגום בין המינים.

פצעים כרוניים, שאינם מרפאים, הנפוצים מאוד אצל קשישים וחולי סוכרת, הם תחום לא מוערך בעיקר של צורך קליני ללא מענה. פצעים אלה מהווים נטל פיזי ופסיכולוגי גדול למטופלים ועולים לספקי שירותי הבריאות מיליארדים מדי שנה לטיפולב - 1. למרות הבנה משופרת של ביולוגיה הפצע והתקדמות בטכנולוגיה, עד 40% מהפצעים הכרוניים עדיין לא מצליחים להחלים בעקבות הטיפול הסטנדרטי הטוב ביותר2. לכן, 14-26% מהחולים עם כיבים ברגל סוכרת לאחר מכן דורשים קטיעה3, בעוד שיעור התמותה לאחר כריתה של 5 שנים עומד על כ -70%4. כתוצאה מכך, קיימת דרישה דחופה לפתח טיפולים חדשים ויעילים לשיפור איכות החיים של המטופלים תוך הפחתת הנטל הבריאותי המשמעותי שהוטל על ידי פצעי ריפוי ירודים. מודלים פרה-קליניים בעלי חיזוי גרוע נותרים משוכה משמעותית לפיתוח טיפולים חדשים ויעילים.
תיקון פצעים הוא תהליך דינמי ורב פנים הכולל מגוון רחב של סוגי תאים, אינספור רמות תקשורת וסביבת רקמות שמשופצת זמנית. ריפוי העור מושתת על ארבעה שלבי תיקון עיקריים: המוסטזיס, דלקת, התפשטות ושיפוץ מטריצה. שלבים אלה פועלים בסופו של דבר כדי למנוע אובדן דם וזיהום, לסגור את פני השטח הפצע(תהליךהמכונה אפיתלציה מחדש) ולהחזיר את העור למצב לא נפגע 5 . פצעים כרוניים קשורים עם אטיולוגיה מגוונת ופגיעה נרחבת בתהליכיריפוי 6, מה שמסבך עוד יותר את זיהוי המטרות הטיפוליות. עם זאת, מגוון רחב של מודלים פותחו הן כדי ל ל להחיות את הנהגים המולקולריים והתאיים של פתולוגיית הפצע ולבדוק גישות טיפוליות חדשות7.
מודל תיקון הפצע הנפוץ ביותר הוא פצע חריף בעכבר. עכברים הם מאוד מתיחה למחקרים מכניים ולספק מודלים מאומתים של הזדקנות וסוכרת8. למרות הדמיון הכללי המוצג בין עכברים וריפוי אנושי, הבדלים בין המינים במבנה העור ובדינמיקת הריפוי נותרו. משמעות הדבר היא שרוב מחקר הפצעים המוריני אינו מתורגם בקלות למרפאה9. כתוצאה מכך, יש כבר דחיפה לעבר מערכות במבחנה אנושית ex vivo עם ישימות גבוהה ותרגום10,11.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מעמיק לביצוע פצעים כריתה בעובי חלקי בעור אנושי ex vivo. אנו גם מתארים את גישת הכתמים שלנו כולה כשיטה ניתנת לשחזור של ריפוי עור אנושי ex vivo. אנו מראים את המסלול של תיקון אפידרמיס (אפיתלציה מחדש) ואת היווצרות המחסום הבא, הערכת קצב סגירת הפצע בעור אנושי בריא לעומת סוכרתי. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ניתן להתאים כתמים שלם לשימוש עם מגוון נוגדנים כדי להעריך היבטים שונים של תגובת הריפוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

פצעים כרוניים שאינם מרפאים, המשפיעים בעיקר על קשישים וחולי סוכרת, הם תחום משמעותי של צורך קליני ללא מענה. למרבה הצער, הטיפולים הנוכחיים בפצעים כרוניים אינם מספקים, בעוד מודלים פרה קליניים זמינים מנבאים בצורה גרועה את היעילות הקלינית של טיפולים חדשים. כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה, מודל פרה קליני כדי להעריך היבטים מרובים של התגובה האנושית לתיקון העור. פצעי עובי חלקיים נוצרו בעור ex vivo אנושי ותרבית לאורך קורס זמן ריפוי. ביופסיות פצע עור נאספו קיבוע עבור הליך הכתמת הרכבה כולה. דגימות קבועות נחסמו ודגרו בנוגדנים ראשוניים, עם זיהוי שהושג באמצעות נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי. הפצעים היו מוכתמים וצוו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לפני חישוב אחוז סגירת פצעים (אפיתלציה מחדש) בכל ביופסיה. החלת פרוטוקול זה, אנו חושפים כי פצעים excisional 2 מ"מ שנוצרו בעור תורם בריא הם epithelialized מחדש באופן מלא על ידי יום 4-5 לאחר פציעה. להיפך, שיעורי הסגירה של פצעי עור סוכרתיים מופחתים באופן משמעותי, מלווים ברפורמציה של מכשולים מוטרדים. שילוב של פגיעה בעור אנושי עם גישת כתמים חדשנית של הרכבה מלאה מאפשר שיטה מהירה ורבייה לכמת תיקון פצעי ex vivo. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה אנושית בעלת ערך להערכת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים בפצעים, תוך שינוי בדיקות ואימות פרה-קליניים.

בדו"ח זה, אנו מציגים גישה חדשה של פציעת עור ex vivo וגישה מוכתמת שלם כדי להעריך גורמים המשפיעים על תגובת תיקון העור האנושי. איור 1A מציג שרטוט של הצינור הפרוצדורלי, שניתן לבצע תוך 3-10 ימים, בהתאם לזמני הדגירה של הפצע. פצעי העובי החלקיים מתורבתים על ערימות ממברנה באוויר : ממשק ממברנה וניתן לאסוף עבור כתמים הרכבה מלאה, מוטבע פרפין או OCT בינוני עבור היסתולוגיה כללית, או קפוא בחנקן נוזלי לניתוח ביוכימי (איור 1B). בדרך כלל אנו יוצרים פצעי עובי חלקיים 2 מ"מ במרכז של explants 6 מ"מ. עם זאת, גודל הפצע ואת explant שמסביב עשוי להשתנות בהתאם לדרישות. הליך ההרכבה כולה הותאם בהצלחה הן לשיטות ההכתמה של אימונופרוקסידאז והן לשיטות הכתמת אימונופלואורסצנטיות(איור 1C).
אימונופלואורסצנטיות מאפשרת לתחבול רקמות עם נוגדנים מרובים. בשביל זה, אנו ממליצים להשתמש בנוגדנים ראשוניים שגדלו במינים שונים, ונוגדנים משניים מצומדים בפלורסצנטריות כדי להגביל את התגובה בין המינים. ריכוזי נוגדנים ודקות יהיה צורך אופטימיזציה. אם נצפתה כתמי רקע, הפחיתו את ריכוזי הנוגדנים, הגבירו את שלבי הכביסה והוסיפו מאגר חסימה לנוגדן המשני. ניתן להעריך ישירות את הכדאיות של הרקמה הטרייה עם צבעי כדאיות מסחרית (ראה טבלת חומרים). אנו גם מראים כי רקמה עשויה להיות קבועה לאחר הכתמת הכדאיות ותמונה בהצלחה כאשר הוא מתאים כמעט (איור 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> איור 1: הגישה האנושית של פציעת אקס ויוו והכתמת הרכבה מלאה. (א)צינור המתאר את זרימת העבודה הפרוצדורלית מאיסוף עור וביצוע פצעי ex vivo, להכתמת רקמות וניתוח נתונים. (B)תרשים המדגים את מערכת תרבית פצעי העור של ex vivo האנושי עם ניתוחים המבוצעים באופן שגרתי על הרקמה. (C)ניתן להשתמש בהכתמה מלאה באמצעות טכניקות אימונופרוקסידאז ואימונופלואורסצנטיות. K14 = קרטין 14. (D)רקמה חיה עשויה להיות מוכתמת בצבעי כדאיות מסחרית ותמונה בהצלחה לאחר קיבעון. בר = 100 מיקרומטר. כתמים אלה בוצעו בעור שאינו סוכרתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
השימוש הנפוץ ביותר עבור הכתמת כל הרכבה של פצעים הוא לקבוע את שיעור סגירת הפצע באופן רב יותר מאשר ניתן לספק באמצעות חתך היסתולוגי. סגירת האחוזים כותמה כאחוזי אפיתל מחדש של משטח הפצע, כפי שהוכח באיור 2A. כיסוי אזור אחוז של סמנים ספציפיים ניתן למדוד מאזור הפצע הכולל או כאחוז של הפצע מחדש epithelialized. אפיינו ריפוי בעור בריא (לא סוכרתי) לעומת סוכרתי לאורך שבעה ימים, ואספנו פצעים בכל יום לאחר הפציעה (תמונות מייצגות, איור 2B). פצעי עור בריאים נסגרו לאורך זמן כצפוי, עם סגירה מלאה שנצפו ברוב הדגימות ביום 4-5. להיפך, פצעי עור סוכרתיים לא הצליחו להיסגר במלואם בתוך תקופת הניתוח בת שבעת הימים(איור 2C). עיכוב משמעותי בסגירת הפצע נצפה בין פצעי עור בריאים לחולי סוכרת כאשר משווים את שיעורי הריפוי בכל נקודת זמן לאחר הפציעה (P < 0.001 עד יום 6, P < 0.05 ביום 6 ו P < 0.05 ל P < 0.001 ביום 7).
לאחר הערכה של שיעורי סגירת הפצע הכוללים; מדדנו את אחוז כל אזור הפצע (האזור החיצוני באיור 2A)שבו ניתן היה לדמיין תאים חיוביים K14 (כתמים ירוקים באיור 2B). באופן מעניין, ראינו שבפצעי עור בריאים של ex vivo, כתמי K14 הגיעו לשיאם ביום 2 ואז ירדו במהירות (משמעות בכל נקודת זמן לעומת שיא היום 2, איור 2D). זה משקף ככל הנראה היווצרות מחדש של מחסום האפידרמיס המוקדם, למעט חדירת נוגדנים K14 דרך שכבות אפידרמיס מובחנות (ראו סכמטי איור 2E). במהלך תהליך האפיתל מחדש, שכבת בזאלי (K14+ve) קרטינוציטים נודדים פנימה מעל הפצע הפתוח, כך שהאפידרמיס קרוב יותר לקצה הפצע החיצוני נוצר מוקדם יותר מהאפידרמיס קרוב יותר לקצה הפצע הפנימי (חזית נודדת). בעוד הקצה הקדמי של האפידרמיס החדש שנוצר ממשיך לנדוד כדי לסגור את הפצע הפתוח הנותר, האפידרמיס החיצוני מתחיל להבדיל כדי לתקן את שכבות האפידרמיס האחרות. בריפוי מוקדם, היינו מצפים לראות את רוב האזור האפיתל מחדש מורכב מתאי בזאלי (K14+ve), ואילו בתיקון מאוחר יותר מכתים K14 הולך לאיבוד כמו האפידרמיס מבדיל מבחוץ פנימה (ראה תמונות הר שלם באיור 2E). לכן, הירידה בהכתמת K14 המוצגת באיור 2D (חצים כלפי מטה) תואמת עם הבחנה אפידרמית מוגברת. מעניין, כתמי K14 גלויים הגיעו לשיא מוקדם יותר בריא (יום 2) לעומת סוכרת (יום 4) פצעים, עוד יותר מדגים כי אפיתלציה מחדש בידול אפידרמיס לאחר מכן מתעכבים פצעי עור סוכרתיים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> איור 2: כתמים בהר שלם חושפים שיעורי ריפוי מדאיגים בעור סוכרתי לעומת בריא. (A)השיטה המשמשת לכימות סגירת פצעים ממדידות פצעים פנימיות וחיצוניות. תמונות ברייטפילד מראות קרטין 14 (K14) מכתים באדום. בר = 300 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של ריפוי לאורך זמן (יום לאחר פציעה) בעור בריא וחולי סוכרת. בר = 500 מיקרומטר. K14 = ירוק. DAPI = גרעינים כחולים. (C)כימות שיעורי סגירת הפצע (אחוזים מחדש epithelialization) מראה כי פצעי ex vivo מעור בריא לסגור באופן משמעותי מהר יותר מאשר פצעי ex vivo מעור סוכרתי. H = בריא. Db = סוכרת. (D)אחוז K14 מכתים פסגות מוקדם יותר בעור בריא לעומת סוכרתי ולאחר מכן יורד בקנה אחד עם בידול אפידרמיס מוגבר (חצים למטה). (ה)K14 (תא אפידרמיס בזאלי) מכתים הולך לאיבוד כמו האפידרמיס מבדיל. D = מובחן. ND = לא מובחן. קווים מנוקדים לבנים מתארים קצוות פצע פנימיים וחיכוניים. חצים לבנים = כיוון ההעברה. n = 6 פצעים לכל תורם, לנקודת זמן. ממוצע +/- SEM. * = P < 0.05, ** = P < 0.01 ו- *** = P < 0.001. בריא וחולי סוכרת בהשוואה בכל נקודת זמן ריפוי ב- C (ערך P להשוואה פחות משמעותית). שינוי זמני בהכתמת K14 בהשוואה לשיא עבור כל תורם ב- D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לאחר מכן השתמשנו בהכתמה מלאה כדי לחקור ביטוי רקמות ולוקליזציה של סמנים אחרים הקשורים לפצעים בעור שאינו סוכרתי (איור 3). כל הנוגדנים המשמשים וריכוז העבודה שלהם מסופקים בטבלת החומרים. כלי הדם בפצע הפתוח מוכתמים באופן חיובי בנוגדן שרירים חלק אלפא (a-SMA), המשמש בשילוב עם K14 כדי לתאר את הקצוות האפידרמליים בתמונות בהספק נמוך יותר (איור 3A). מטריצת העור הוכתמה בנוגדנים נגד סוג קולגן I (COL 1) ופיברונקטין (Fn). כאן נצפתה קולגן כשפע של סיבים עבים, בעוד סיבי פיברונקטין היו דלילים, גליים ודקים(איור 3A). גישת הכתמים שלנו בהרכבה כולה מסוגלת גם לספק רזולוציה ברמת התא של כתמים, כפי שהודגם עבור קרטינוציטים חיוביים K14(איור 3B).
לבסוף, אנו מראים כי פצעי ex vivo אנושיים יש תאי מערכת החיסון המקומיים, עם תאי Langerhans זוהו סביב אפידרמיס שנוצר לאחרונה ביום 3 לאחר פציעה (איור 3C). ואכן, תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש בהכתמה של הרכבה מלאה כדי לחקור תכונות מרכזיות של תגובת הריפוי, כולל דלקת, התפשטות, והמטריצה החוץ-תאית (איור 4A). יחד, הנתונים שלנו חושפים כי הליך הכתמת העור ex vivo המשולב והליך הכתמת הרכבה מלאה הוא שיטה תקפה להערכת היבטים שונים של תיקון עור אנושי בריא וחולה סוכרתי (פתולוגי).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> איור 3: אופטימיזציה של גישת הכתמים של הרכבה מלאה לשימוש עם נוגדנים אחרים. (A)כלי הדם הוכתמו באקטין שרירים חלק אלפא (α-SMA, ירוק) וקרטין 14 (K14, אדום), בעוד סיבי מטריצה היו מוכתמים בקולגן I (COL 1, אדום) ופיברונקטין (Fn, ירוק). (B)הליך ההרכבה כולה מספק רזולוציה של לוקליזציה ברמת התא עד לרמת התא (K14, ירוק; קיי-1, אדום). (C)CD1a + ve Langerhans תאים (ירוק) נצפו באפידרמיס שנוצר לאחרונה. DAPI = גרעינים כחולים. בר = 100 מיקרומטר. קווים מנוקדים לבנים מראים קצוות פצע פנימיים וחיציניים ופצע נפרד מאפידרמיס. כתמים אלה בוצעו בעור שאינו סוכרתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> איור 4: תוקף הליך הכתמת הרכבה מלאה להערכת ריפוי פצעים. (א)איור המתאר כיצד טכניקת הכתמת ההרכבה כולה יכולה להעריך תהליכים רלוונטיים לפצעים. נוגדנים בשימוש = טקסט אדום. K14 = קרטין 14. COL 1 = קולגן 1. Fn = פיברונקטין. (B)הליך הכתמת הרכבה מלאה (חצים כחולים) מציג פחות שונות למדידות סגירת פצעים מאשר ניתוח היסתולוגי סטנדרטי (חצים אדומים). S1 = סעיף 1. אנחנו = קצה הפצע. בר = 300 מיקרומטר. כתמים אלה בוצעו בעור שאינו סוכרתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

כאן אנו מדגימים טכניקה ממוטבת להערכת תיקון פצעים באמצעות עור אנושי ex vivo בשילוב עם גישה מוכתמת שלם. מתודולוגיה זו מספקת פלטפורמה פרה-קלינית להערכת טיפולים פוטנציאליים לפצעים.

מודל פצע Ex vivo אנושי וגישה מוכתמת בהר שלם להערכה מדויקת של תיקון העור

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול פציעת עור אנושי ex vivo ממוטב שיכול לספק נתוני יעילות חשובים כחלק מצינור תרגום קליני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה מדויקת תפוקה גבוהה של תיקון פצע בעור אנושי חי. מדגים את ההליך יהיו אליזבת רוברטס, חוקרת פוסט דוקטורט, ואלכסנדריה קיד, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו.כדי להכין דגימת רקמת עור לפצע, מניחים את צד העור למטה בצלחת פטרי 90 מ"מ ולהשתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את רקמת השומן. כאשר כל השומן הוסר, מניחים את העור ב 25 מיליליטר של HBSS בתוספת אנטיביוטיקה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד לסירוגין כדי להסיר כל דם שיורית ברקמת השומן. לאחר 10 דקות, לשטוף את העור ב 25 מיליליטר של DPBS.לאחר 10 דקות, חזור על שטיפת HBSS ללא אנטיביוטיקה, ולאחר מכן בצע שטיפה סופית ב 25 מיליליטר של DPBS. לאחר מכן מניחים קרום מסנן ניילון סטרילי על ערימת כרית סופגת ולייבש את הצד העורי של העור על גזה סטרילית בצלחת פטרי 90 מ"מ כדי להסיר DPBS שיורית. מניחים את צד הדרמיס של העור היבש על מכסה צלחת פטרי 90 מ"מ נקי כדי להסיר כל שאריות DPBS ולטבול את האפידרמיס יבש עם גזה סטרילית טרייה.כדי ליצור פצע, לחץ על אגרוף ביופסיה של שני מילימטר על העור תוך החזקת העור הדוק ומתפתל בעדינות. בעזרת מלקחיים מעוקלים של רקמה מעוקלת, הרימו כל צד של הפצע בקוטר של כשני מילימטר וחיבור מספריים מעוקלות של איריס מתחת לפצע. השתמש במכה ביופסיה של שישה מילימטר לביופסיה סביב הפצע המרכזי של שני מילימטר כדי ליצור מסלק שישה מילימטר עם פצע חלקי של שני מילימטר במרכז.לאחר מכן מניחים את צד האפידרמיס המהולל על ערימת ממברנות מסנן הניילון לדגירה של יום עד שבעה ימים ב-32 עד 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. עבור כתמים פלואורסצנטיים, לאסוף את explants הפצע ב 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות המכילים 500 microliters של עור קבוע לכל צינור ודגורת explants לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להחליף את הקיבוץ עם מיליליטר אחד של חוצץ לשטוף כתמים.לאחר הכביסה, לכסות כל מדגם עם כ 150 microliters של חסימת חוצץ ודגורה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת חיץ החסימה, להוסיף 150 microliters של נוגדן ראשוני מדולל בחסימת חוצץ לכל צינור ודגורת explants הפצע לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם 500 microliters של מכתים לשטוף חוצץ המכיל 0.2% נתרן אזיד ואחריו שלוש שטיפות במאגר כביסה רגיל.לאחר הכביסה, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של נוגדן משני מתאים מצומד בפלורסנס מדוללים במאגר כביסה מכתים לכל באר לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את explant שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 500 microliters של מכתים לשטוף חוצף לכל לשטוף לפני נגד מכתים כל explant עם 150 microliters של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, לשטוף את explant פעמיים במשך 30 דקות עם 500 microliters של חוצץ כביסה לכל לשטוף.להדמיה מסבירה, הניחו צלחת פטרי 60 מ"מ על פלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי והוסיפו שכבה של כמיליליטר של DPBS לצלחת. השתמש במלקחיים כדי להעביר את פצע explants לצלחת. לאחר הגדרת תוכנת ההדמיה בהתאם לניסוי, מקם את הפצע במרכז מישור ההדמיה ורכוש תמונות של ביופסיות הפצע.כדי לבצע הדמיית מיקרוסקופ דיגיטלי אלחוטי כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה באופן חסכוני, חבר טלפון או מחשב נייד למיקרוסקופ דיגיטלי אלחוטי. מניחים את explants בסופו של דבר על פיסת רקמת מעבדה ולהסיר כל חוצץ לשטוף שיורית מן המדגם. לאחר מכן מקם את המסלק במרכז שדה הראייה של המיקרוסקופ ורכוש תמונות באמצעות המצלמה המחוברת.אימונופרוקסידאז ואימונופלואורסצנטיות יכולים לשמש להכתמת רקמת הר שלם. בנוסף, כתמים חיים/מתים יכולים להתבצע על רקמה טרייה ותמונה לפני או לאחר קיבעון. ניתן להשתמש בהכתמת הר שלם של פצעים כדי לקבוע את שיעורי סגירת הפצע באופן לשחזור.בניתוח מייצג זה, סגירה בריאה של פצעי עור נצפתה לאחר ארבעה עד חמישה ימים, בעוד פצעי עור סוכרתיים לא הצליחו להיסגר באופן מלא בתוך תקופת הניתוח של שבעה ימים. ביטוי K14 הגיע לשיאו ביום השני בפצעי עור בריאים לפני שדעך במהירות עם הבחנה אפידרמית מוגברת. אפיתל מחדש זה ובידול אפידרמיס לאחר מכן התעכבו בפצעי העור הסוכרתיים.הרפורמציה של מחסום האפידרמיס המוקדם אינה כוללת חדירת נוגדנים K14 בתוך שכבות האפידרמיס המובחנות. בשלב מוקדם של תהליך האפיתל מחדש, K14 קרטינוציטים חיוביים של שכבת בזאלי נודדים פנימה מעל הפצע הפתוח, כך שהאפידרמיס קרוב יותר לקצה הפצע החיצוני נוצר מוקדם יותר מהאפידרמיס הקרוב יותר לקצה הפצע הפנימי. בהמשך שלב התיקון, כתמי K14 הולכים לאיבוד כאשר האפידרמיס מבדיל מבחוץ פנימה.כתמי הר שלם יכולים לשמש גם כדי ללמוד את הביטוי ואת לוקליזציה של סמנים רלוונטיים פצע אחרים בעור, כמו גם את נוכחותם של תאים חיסוניים של עניין באתר הפצע בשלבים שונים של ריפוי. יצירת פצעים כריתה לשחזור יכול להיות מאתגר בהתחלה. אנו ממליצים לתרגל את הליך הפצע באמצעות עור עודף.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...