Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Ringraziamo paolo Matteuci e George Smith per aver fornito il tessuto dei pazienti. Siamo anche grati a Miss Amber Rose Stafford per l'assistenza nella raccolta dei tessuti e al Daisy Appeal per la fornitura di strutture di laboratorio.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

In questo protocollo sperimentale, descriviamo un metodo ottimizzato per valutare la chiusura della ferita nella pelle umana ex vivo utilizzando la colorazione del tessuto a montaggio intero. Questa è una risorsa importante per consentire la valutazione critica dei potenziali trattamenti delle ferite e per fornire una migliore comprensione della risposta alla riparazione della ferita umana. Abbiamo pubblicato la valutazione di guarigione nelle ferite cutanee ex vivo in precedenza12,13, ma in questi rapporti l'approccio di colorazione a monte intero non è stato utilizzato per misurare la chiusura della ferita. La colorazione a montaggio intero è molto più semplice e richiede meno esperienza tecnica rispetto all'istologia standard, che comporta l'incorporamento di paraffina o OCT e il sezionamento dei campioni. La procedura a montaggio intero riduce anche la variabilità sperimentale, consentendo la quantificazione dell'intera ferita e non solo di una singola sezione trasversale in una posizione definita all'interno del tessuto (vedere la Figura 4B per l'illustrazione comparativa). Sosteniamo pienamente l'importanza di quantificare la guarigione dell'intera struttura della ferita non simmetrica, come chiaramente delineato da Rhea e Dunnwald per le ferite acute murine14. Questi autori hanno mostrato l'importanza del sezionamento seriale di ferite escissionali in vivo per misurazioni riproducibili e precise della morfologia della ferita. Il sezionamento seriale potrebbe essere applicato anche alle ferite umane ex vivo; tuttavia, per una quantificazione accurata della chiusura della ferita e della riepitelizzazione, la colorazione a montaggio intero ad alta produttività dovrebbe essere il metodo preferito. Notiamo che questo protocollo di colorazione a montaggio intero dovrebbe essere compatibile anche con la successiva lavorazione (cera o OCT) per l'analisi istologica tradizionale.
La colorazione a montaggio intero non è priva di svantaggi. Mentre offre una maggiore riproducibilità negli esperimenti di guarigione delle ferite, richiede l'uso di più tessuto per l'analisi rispetto alle tecniche istologiche standard. Questo può essere un problema in cui l'accesso ai tessuti è limitato, in particolare quando è necessario valutare più anticorpi. Un approccio alternativo sarebbe quello di impiegare un metodo di avsizione incisionale in cui la larghezza della ferita è relativamente uniforme e la variabilità è ridotta (come mostrato nelle ferite di topo e umane15,16). Tuttavia, le ferite escissionali rimangono più applicabili alla maggior parte dei tipi di ferite patologiche17.
In questo studio, sono state create ferite di spessore parziale di 2 mm all'interno del centro di espianti cutanei da 6 mm. Questo metodo può essere ottimizzato per ferite escissionali alternative e dimensioni di espianto a diverse profondità cutanee18. Inoltre, la forza necessaria per generare ferite varierà tra i donatori, dove la pelle invecchiata richiederà meno forza per la biopsia. Eviteremmo anche di usare la pelle che mostra smagliature prominenti o altre alterazioni strutturali. Abbiamo convalidato una serie di anticorpi per considerare diversi aspetti della risposta di guarigione ex vivo. Questo protocollo può anche essere utilizzato con altri anticorpi rilevanti per la pelle, in cui le concentrazioni di anticorpi e i tempi di incubazione dovranno essere ottimizzati. Tuttavia, riteniamo che il nostro protocollo sia più adatto alla quantificazione assoluta della chiusura totale della ferita, seguita dalla valutazione spaziale di specifiche proteine di interesse. Mentre l'intero montaggio fornisce una risoluzione ridotta dell'immunolocalizzazione rispetto all'analisi istologica standard delle sezioni tissutali, fornisce ulteriori informazioni 3D che mancano nell'istologia 2D standard.
Un avvertimento per valutare la guarigione nella pelle ex vivo rispetto ai modelli in vivo è che manca una risposta sistemica. Un aspetto importante della riparazione della ferita è l'infiammazione e la successiva granulazione dei tessuti, che è causata da un afflusso di cellule infiammatorie e cellule endoteliali dallavascolarizzazione 19. Nonostante questa limitazione, la pelle ex vivo fornisce ancora una migliore ricapitolazione della guarigione clinica rispetto ai saggi delle ferite basati sulle cellule. Gli esperimenti in vitro in generale coinvolgono monostrati o co-colture di tipo cellulare singolo coltivate su coltura tissutale plastica, mentre la pelle ex vivo fornisce un ambiente nativo per esplorare il comportamento cellulare. Più recentemente, sono emersi un certo numero di sistemi equivalenti della pelle, in cui la pelle viene coltivata in un ambiente di laboratorio da matrice artificiale e cellule cutanee isolate20,21. Sebbene questi modelli imitino la pelle umana meglio della maggior parte degli approcci in vitro, non simulano ancora completamente l'ambiente tissutale nativo e sono generalmente troppo fragili per ferire in modo riproducibile. Inoltre, noi (e altri) abbiamo dimostrato che il tessuto cutaneo umano ex vivo conserva le cellule immunitarie residenti, che senza dubbio contribuiranno alla riparazione22,23. Il lavoro futuro dovrebbe ora concentrarsi sull'estensione della vitalità e dell'immunocompetenza del modello ex vivo per la valutazione della guarigione in fase avanzata24. Un'opzione è l'ulteriore avanzamento delle promettenti tecnologie organ-on-a-chip in grado di prolungare la vitalità dei tessuti e mantenere l'architettura cutanea nativa per un massimo di due settimane incoltura 25. I modelli ex vivo hanno anche iniziato a considerare l'importanza della risposta infiammatoria cutanea incorporando con successo cellule immunitarie, come i neutrofili, nel tessuto ospite26 o iniettando tessuto ospite con anticorpi per suscitare una reazione immunitaria27. Ci aspettiamo che questi risultati apriranno la strada allo sviluppo di metodi più raffinati e traducibili in futuro.
Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo della pelle ex vivo per misurare la chiusura della ferita è la capacità di confrontare i tassi di guarigione in tessuto sano (ad esempio, non diabetico) rispetto a quello patologico (ad esempio, diabetico o invecchiato). Qui abbiamo dimostrato che la riepitelizzazione e la formazione di barriere sono effettivamente compromesse nelle ferite diabetiche rispetto a quelle sane ex vivo. In effetti, questo fornisce un percorso per la valutazione pre-clinica della riparazione patologica, in cui l'invecchiamento e il diabete sono i principali fattori di rischio per lo sviluppo di ferite croniche1. Mentre esistono modelli patologici in vitro, come cellule isolate da tessuto invecchiato e diabetico, o cellule coltivate in glucosio alto per imitare l'iperglicemia28,29, queste cellule possono rapidamente perdere il loro fenotipo una volta rimosse dal microambiente in vivo. Una componente importante dell'ambiente di guarigione patologica estrinseca è la matrice dermica, che viene alterata sia nell'invecchiamento che nel diabete30. Infatti, questa matrice perturbata influenza il comportamento dei fibroblasti residenti e ingenui31,32. Pertanto, l'importanza di studiare le cellule nel loro ambiente di tessuto ospite non può essere sottovalutata.
In sintesi, il nostro protocollo fornisce un'importante piattaforma per quantificare la riepitelizzazione della ferita umana, esplorare i fattori regolatori e testare la validità e l'efficacia delle potenziali terapie12,13. Mentre i test pre-clinici richiedono ancora approcci in vivo, una strategia combinata che utilizza tessuto umano ex vivo e ferite murine in vivo dovrebbe perfezionare il percorso pre-clinico, riducendo l'uso di animali e aumentando la traducibilità tra specie.

Le ferite croniche e non cicatrizzanti, che sono molto diffuse negli anziani e nei diabetici, sono un'area molto poco apprezzata del bisogno clinico insoddisfatto. Queste ferite rappresentano un importante onere fisico e psicologico per i pazienti e costano miliardi agli operatori sanitari ogni anno per il trattamentodi 1. Nonostante una migliore comprensione della biologia delle ferite e dei progressi tecnologici, fino al 40% delle ferite croniche non riesce ancora a guarire seguendo le migliori cure standard2. Pertanto, il 14-26% dei pazienti con ulcere del piede diabetico richiede successivamente l'amputazione3, mentre il tasso di mortalità post-amputazione a 5 anni si attesta a circa il 70%4. Di conseguenza, vi è l'urgente necessità di sviluppare nuove terapie efficaci per migliorare la qualità della vita dei pazienti, riducendo al contempo il notevole onere sanitario imposto dalle ferite di scarsa guarigione. Modelli pre-clinici scarsamente predittivi rimangono un ostacolo significativo allo sviluppo di nuove terapie efficaci.
La riparazione delle ferite è un processo dinamico e sfaccettato che coinvolge una vasta gamma di tipi di cellule, innumerevoli livelli di comunicazione e un ambiente tissutale che viene temporaneamente rimodellato. La guarigione della pelle è sostenuta da quattro principali fasi riparative: emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento della matrice. Queste fasi agiscono in definitiva per prevenire la perdita di sangue e l'infezione, chiudere la superficie della ferita (un processo chiamato riepitelizzazione) e riportare la pelle a uno stato illeso5. Le ferite croniche sono associate a diverse eziologia e diffusa perturbazione dei processi di guarigione6, complicando ulteriormente l'identificazione di bersagli terapeutici. Tuttavia, è stata sviluppata un'ampia gamma di modelli per chiarire i driver molecolari e cellulari della patologia della ferita e testare nuovi approcci terapeutici7.
Il modello di riparazione della ferita più utilizzato è la ferita acuta nel topo. I topi sono altamente trattabili per studi meccanicistici e forniscono modelli convalidati di invecchiamento e diabete8. Nonostante le somiglianze generali mostrate tra la guarigione del topo e dell'uomo, le differenze tra le specie nella struttura della pelle e nelle dinamiche di guarigione rimangono. Ciò significa che la maggior parte della ricerca sulle ferite murine non si traduce facilmente nella clinica9. Di conseguenza, c'è stata una spinta verso sistemi umani in vitro ed ex vivo con elevata applicabilità e traducibilità10,11.
Qui forniamo un protocollo approfondito per l'esecuzione di ferite escissionali a spessore parziale in pelle umana ex vivo. Descriviamo anche il nostro approccio di colorazione a tutto monte come un metodo altamente riproducibile per valutare ex vivo la guarigione della pelle umana. Mostriamo la traiettoria della riparazione epidermica (riepitelizzazione) e la successiva formazione della barriera, valutando il tasso di chiusura della ferita nella pelle umana sana rispetto a quella diabetica. Infine, dimostriamo come la colorazione a tutto monte può essere adattata per l'uso con una gamma di anticorpi per valutare vari aspetti della risposta di guarigione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Le ferite croniche non cicatrizzanti, che colpiscono principalmente gli anziani e i diabetici, sono un'area significativa di bisogni clinici insoddisfatti. Sfortunatamente, gli attuali trattamenti delle ferite croniche sono inadeguati, mentre i modelli pre-clinici disponibili predicono male l'efficacia clinica delle nuove terapie. Qui descriviamo un modello pre-clinico ad alto rendimento per valutare molteplici aspetti della risposta alla riparazione della pelle umana. Le ferite a spessore parziale sono state create nella pelle umana ex vivo e coltivate attraverso un corso di tempo di guarigione. Le biopsie delle ferite cutanee sono state raccolte in fissativo per la procedura di colorazione a tutto monte. I campioni fissi sono stati bloccati e incubati nell'anticorpo primario, con rilevamento ottenuto tramite anticorpo secondario coniugato fluorescentemente. Le ferite sono state controbattete e riprese tramite microscopia confocale prima di calcolare la percentuale di chiusura della ferita (riepitelizzazione) in ogni biopsia. Applicando questo protocollo, riveliamo che le ferite escissionali di 2 mm create nella pelle sana del donatore sono completamente riepitelizzate entro il giorno 4-5 post-ferimento. Al contrario, i tassi di chiusura delle ferite cutanee diabetiche sono significativamente ridotti, accompagnati da una riforma della barriera perturbata. La combinazione di ferite cutanee umane con un nuovo approccio di colorazione a montaggio intero consente un metodo rapido e riproducibile per quantificare ex vivo la riparazione della ferita. Collettivamente, questo protocollo fornisce una preziosa piattaforma umana per valutare l'efficacia di potenziali terapie delle ferite, trasformando i test e la convalida pre-clinici.

In questo rapporto, presentiamo un nuovo approccio ex vivo per le ferite cutanee e la colorazione a tutto monte per valutare i fattori che influenzano la risposta alla riparazione della pelle umana. La Figura 1A mostra uno schema della pipeline procedurale, che può essere eseguito in 3-10 giorni, a seconda dei tempi di incubazione della ferita. Le ferite a spessore parziale vengono coltivate su pile di membrana all'aria: interfaccia a membrana e possono essere raccolte per la colorazione a montaggio intero, incorporate in paraffina o mezzo OCT per l'istologia generale o congelate in azoto liquido per analisi biochimiche (Figura 1B). Generalmente creiamo ferite a spessore parziale di 2 mm all'interno del centro di espianti da 6 mm. Tuttavia, la dimensione della ferita e dell'espianto circostante può essere modificata a seconda delle esigenze. La procedura a montaggio intero è stata adattata con successo sia per l'immunoperossidasi che per i metodi di colorazione a immunofluorescenza (Figura 1C).
L'immunofluorescenza consente il sondaggio del tessuto con anticorpi multipli. Per questo, consigliamo di utilizzare anticorpi primari allevati in specie diverse e anticorpi secondari coniugati fluorescenti abbinati a specie per limitare la reattività tra specie. Le concentrazioni di anticorpi e i tempi di incubazione dovranno essere ottimizzati. Se si osserva una colorazione di fondo, ridurre le concentrazioni di anticorpi, aumentare le fasi di lavaggio e aggiungere tampone bloccante all'anticorpo secondario. La vitalità dei tessuti freschi può essere valutata direttamente con coloranti di redditività commerciale (vedi Tabella dei materiali). Mostriamo anche che il tessuto può essere riparato dopo la colorazione di vitalità e ripreso con successo quando è praticamente adatto (Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figura 1: L'approccio umano ex vivo per la ferita e la colorazione a montaggio intero. (A) Pipeline che illustra il flusso di lavoro procedurale dalla raccolta della pelle e dall'esecuzione di ferite ex vivo, alla colorazione dei tessuti e all'analisi dei dati. (B) Diagramma che illustra il sistema di coltura delle ferite cutanee umane ex vivo con analisi eseguite di routine sul tessuto. (C) La colorazione integrale può essere impiegata utilizzando sia l'immunoperossidasi che l'immunofluorescenza. K14 = cheratina 14. (D) Il tessuto vivo può essere colorato con coloranti di vitalità commerciale e ripreso con successo dopo la fissazione. Barra = 100 μm. Questa colorazione è stata eseguita nella pelle non diabetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'uso più ampiamente applicabile per la colorazione a montaggio intero delle ferite è quello di determinare il tasso di chiusura della ferita in un modo più riproducibile di quello che può essere fornito tramite il sezionamento istologico. La percentuale di chiusura è stata quantificata come riepitelizzazione percentuale della superficie della ferita, come dimostrato nella Figura 2A. La copertura percentuale dell'area di marcatori specifici può essere misurata dall'area totale della ferita o come percentuale della ferita riepitelizzata. Abbiamo caratterizzato la guarigione in pelle sana (non diabetica) rispetto a quella diabetica per un periodo di tempo di sette giorni, raccogliendo ferite ogni giorno dopo la ferita (immagini rappresentative, Figura 2B). Le ferite cutanee sane si sono chiuse nel tempo come previsto, con chiusura completa osservata nella maggior parte dei campioni entro il giorno 4-5. Al contrario, le ferite cutanee diabetiche non sono riuscite a chiudersi completamente entro il periodo di analisi di sette giorni (Figura 2C). Un ritardo significativo nella chiusura della ferita è stato osservato tra ferite cutanee sane e diabetiche quando si confrontano i tassi di guarigione a ciascun punto temporale post-lesione(P < 0,001 al giorno 6, P < 0,05 al giorno 6 e P < 0,05 a P < 0,001 al giorno 7).
A seguito della valutazione dei tassi complessivi di chiusura della ferita; abbiamo misurato la percentuale dell'intera area della ferita (area esterna in Figura 2A)in cui è possibile visualizzare le cellule K14 positive (colorazione verde in Figura 2B). È interessante notare che abbiamo osservato che nelle ferite cutanee ex vivo sane, la colorazione K14 ha raggiunto il picco al giorno 2 e poi è diminuita rapidamente (significato in ogni punto temporale rispetto al picco del giorno 2, Figura 2D). Ciò riflette probabilmente la ri-formazione della barriera epidermica precoce, escludendo la penetrazione dell'anticorpo K14 attraverso strati epidermici differenziati (vedere schema Figura 2E). Durante il processo di riepitelizzazione, i cheratinociti dello strato basale (K14 + ve) migrano verso l'interno sopra la ferita aperta in modo tale che l'epidermide più vicina al bordo esterno della ferita si formi prima dell'epidermide più vicina al bordo interno della ferita (fronte migrante). Mentre il bordo anteriore dell'epidermide appena formata continua a migrare per chiudere la ferita aperta rimanente, l'epidermide del bordo esterno inizia a differenziarsi per riformare gli altri strati epidermici. Nella guarigione precoce, ci aspetteremmo quindi di vedere la maggior parte dell'area riepitelizzata costituita da cellule basali (K14 + ve), mentre nella riparazione successiva la colorazione K14 viene persa poiché l'epidermide si differenzia dall'esterno verso l'interno (vedi immagini a montaggio intero in Figura 2E). Pertanto, il declino della colorazione K14 mostrato nella Figura 2D (frecce verso il basso) è correlato con un aumento della differenziazione epidermica. È interessante notare che la colorazione K14 visibile ha raggiunto il picco prima nelle ferite sane (giorno 2) rispetto a quelle diabetiche (giorno 4), dimostrando ulteriormente che la riepitelizzazione e la successiva differenziazione epidermica sono ritardate nelle ferite cutanee diabetiche.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figura 2: La colorazione a tutto monte rivela tassi di guarigione perturbati nella pelle diabetica rispetto a quella sana. (A) Il metodo utilizzato per quantificare la chiusura della ferita dalle misurazioni della ferita esterna ed interna. Le immagini Di Brightfield mostrano cheratina 14 (K14) si colora di rosso. Bar = 300 μm. (B) Immagini rappresentative della guarigione nel tempo (giorno post-ferimento) in pelle sana e diabetica. Barra = 500 μm. K14 = verde. DAPI = nuclei blu. (C) Quantificazione dei tassi di chiusura della ferita (percentuale di riepitelizzazione) che mostra che le ferite ex vivo da pelle sana si chiudono significativamente più velocemente delle ferite ex vivo da pelle diabetica. H = sano. Db = diabetico. (D) Percentuale di colorazione K14 raggiunge il picco prima nella pelle sana rispetto a quella diabetica e poi diminuisce in linea con l'aumento della differenziazione epidermica (frecce verso il basso). (E) K14 (cellule epidermiche basali) la colorazione viene persa man mano che l'epidermide si differenzia. D = differenziato. ND = non differenziato. Le linee tratteggiate bianche raffigurano i bordi interni ed esterni della ferita. Frecce bianche = direzione della migrazione. n = 6 ferite per donatore, per punto temporale. Media +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 e *** = P < 0,001. Sano e diabetico confrontati in ogni punto del tempo di guarigione in C (valoreP per il confronto meno significativo). Variazione temporale della colorazione K14 rispetto al picco per ciascun donatore in D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Successivamente abbiamo utilizzato la colorazione a montaggio intero per esplorare l'espressione tissutale e la localizzazione di altri marcatori rilevanti per la ferita nella pelle non diabetica (Figura 3). Tutti gli anticorpi utilizzati e le loro concentrazioni di lavoro sono forniti nella Tabella dei materiali. I vasi sanguigni nella ferita aperta sono stati colorati positivamente con l'anticorpo alfa dell'actina della muscolatura liscia (a-SMA), utilizzato in combinazione con K14 per delineare i bordi epidermici in immagini a bassa potenza (Figura 3A). La matrice dermica è stata colorata con anticorpi contro il collagene di tipo I (COL 1) e la fibronectina (Fn). Qui il collagene è stato osservato come abbondanti fibre spesse mentre le fibre di fibronectina erano sparse, ondulate e sottili (Figura 3A). Il nostro approccio di colorazione a montaggio intero è anche in grado di fornire la risoluzione della colorazione a livello cellulare, come dimostrato per i cheratinociti K14-positivi (Figura 3B).
Infine, mostriamo che le ferite umane ex vivo possiedono cellule immunitarie residenti, con cellule di Langerhans rilevate intorno all'epidermide appena formata al giorno 3 post-ferimento (Figura 3C). In effetti, questi risultati suggeriscono che la colorazione a tutto monte può essere utilizzata per studiare le caratteristiche chiave della risposta di guarigione tra cui l'infiammazione, la proliferazione e la matrice extracellulare(Figura 4A). Nel loro insieme, i nostri dati rivelano che la procedura combinata ex vivo di ferite cutanee e colorazione a montaggio intero è un metodo valido per valutare vari aspetti della riparazione della pelle umana sana e diabetica (patologica).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figura 3: Ottimizzazione dell'approccio di colorazione a tutto monte per l'uso con altri anticorpi. (A) I vasi sanguigni sono stati colorati con alfa actina muscolare liscia (α-SMA, verde) e cheratina 14 (K14, rosso), mentre le fibre della matrice sono state colorate con collagene I (COL 1, rosso) e fibronectina (Fn, verde). (B) La procedura a montaggio intero fornisce una risoluzione di localizzazione fino al livello cellulare (K14, verde; K1, rosso). (C) Cellule di Langerhans CD1a+ve (verdi) osservate nell'epidermide di nuova formazione. DAPI = nuclei blu. Barra = 100 μm. Le linee tratteggiate bianche mostrano i bordi interni ed esterni della ferita e separano la ferita dall'epidermide. Questa colorazione è stata eseguita nella pelle non diabetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figura 4: Validità della procedura di colorazione a montaggio intero per valutare la guarigione delle ferite. (A) Illustrazione che illustra come la tecnica di colorazione a montaggio intero può valutare i processi rilevanti per la ferita. Anticorpi usati = testo rosso. K14 = cheratina 14. COL 1 = collagene 1. Fn = fibronectina. (B) La procedura di colorazione a montaggio intero (frecce blu) introduce una minore variabilità nelle misurazioni di chiusura della ferita rispetto all'analisi istologica standard (frecce rosse). S1 = sezione 1. WE = bordo della ferita. Barra = 300 μm. Questa colorazione è stata eseguita nella pelle non diabetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Qui dimostriamo una tecnica ottimizzata per valutare la riparazione delle ferite utilizzando la pelle umana ex vivo combinata con un approccio di colorazione a montaggio intero. Questa metodologia fornisce una piattaforma pre-clinica per la valutazione di potenziali terapie delle ferite.

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

In questo articolo, presentiamo un protocollo di ferita della pelle umana ex vivo ottimizzato che può fornire importanti dati di efficacia come parte di una pipeline traslazionale clinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una valutazione accurata ad alto rendimento della riparazione delle ferite nella pelle umana vivente. A dimostrare la procedura saranno Elizabeth Roberts, ricercatrice post-dottorato, e Alexandria Kidd, assistente di ricerca del nostro laboratorio.Per preparare un campione di tessuto cutaneo per la ferita, posizionare il derma cutaneo con il lato verso il basso in una capsula di Petri da 90 millimetri e utilizzare forbici sterili per rimuovere il tessuto adiposo. Quando tutto il grasso è stato rimosso, posizionare la pelle in 25 millilitri di HBSS integrati con antibiotici per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione intermittente per rimuovere qualsiasi residuo di sangue nel tessuto adiposo. Dopo 10 minuti, risciacquare la pelle in 25 millilitri di DPBS.Dopo 10 minuti, ripetere il risciacquo HBSS senza antibiotici, quindi eseguire un risciacquo finale in 25 millilitri di DPBS. Quindi posizionare una membrana filtrante in nylon sterile sulla pila assorbente e asciugare il lato dermico della pelle su una garza sterile in una capsula di Petri da 90 millimetri per rimuovere il DPBS residuo. Posizionare il derma della pelle secca a lato verso il basso su un coperchio pulito da 90 millimetri della capsula di Petri per rimuovere eventuali DPBS residui e tamponare l'epidermide asciutta con una garza sterile fresca.Per creare una ferita, premere un pugno biopsia di due millimetri contro la pelle tenendo la pelle stretta e torcendo delicatamente. Usando una pinza di tessuto dentato curvo, raccogli ciascun lato della ferita di circa due millimetri di diametro e aggancia le forbici dell'iride curve sotto la ferita. Utilizzare un pugno da biopsia da sei millimetri per la biopsia attorno alla ferita centrale di due millimetri per creare un impianto di sei millimetri con una ferita di due millimetri di spessore parziale al centro.Quindi posizionare l'epidermide dell'espianto della ferita lateralmente verso l'alto sulla pila di membrana del filtro in nylon per un'incubazione da uno a sette giorni a 32-37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per la colorazione fluorescente, raccogliere gli espianti della ferita in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di fissativo cutaneo per tubo e incubare gli espianti durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il fissativo con un millilitro di tampone di lavaggio colorante.Dopo il lavaggio, coprire ogni campione con circa 150 microlitri di tampone bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il tampone di blocco, aggiungere 150 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone di blocco per tubo e incubare gli espianti della ferita durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, sciacquare i campioni con 500 microlitri di tampone di lavaggio colorante contenente 0,2% di azide di sodio seguito da tre risciacqui in tampone di lavaggio normale.Dopo il lavaggio, aggiungere 150 microlitri di un appropriato anticorpo secondario coniugato a florescenza diluito in tampone di lavaggio colorante a ciascun pozzetaggio per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sciacquare l'espianto tre volte per 30 minuti in 500 microlitri di tampone di lavaggio colorante per lavaggio prima di contro-macchiare ogni espianto con 150 microlitri di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare l'espianto due volte per 30 minuti con 500 microlitri di tampone di lavaggio per lavaggio.Per l'imaging di espianto, posizionare una capsula di Petri da 60 millimetri sulla piattaforma di imaging di un microscopio confocale e aggiungere uno strato di circa un millilitro di DPBS alla parabola. Utilizzare una pinna per trasferire gli espianti della ferita al piatto. Dopo aver impostato il software di imaging appropriato per l'esperimento, posizionare la ferita al centro del piano di imaging e acquisire le immagini delle biopsie della ferita.Per eseguire l'imaging al microscopio digitale wireless per ottenere immagini di alta qualità in modo economico, collegare un telefono o un laptop a un microscopio digitale wireless. Posizionare gli espianti avvolti lateralmente su un pezzo di tessuto di laboratorio e rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dal campione. Quindi posizionare l'espianto al centro del campo visivo del microscopio e acquisire immagini utilizzando la fotocamera collegata.L'immunoperossidasi e l'immunofluorescenza possono essere utilizzate per la colorazione del tessuto dell'intero monte. Inoltre, la colorazione viva / morta può essere eseguita su tessuto fresco e immaginata pre o post-fissazione. La colorazione dell'intero supporto delle ferite può essere utilizzata per determinare i tassi di chiusura della ferita in modo riproducibile.In questa analisi rappresentativa, la chiusura della ferita cutanea sana è stata osservata dopo quattro o cinque giorni, mentre le ferite cutanee diabetiche non sono riuscite a chiudersi completamente entro il periodo di analisi di sette giorni. L'espressione di K14 ha raggiunto il picco il secondo giorno nelle ferite cutanee sane prima di diminuire rapidamente con un aumento della differenziazione epidermica. Questa riepitelizzazione e la successiva differenziazione epidermica sono state ritardate nelle ferite cutanee diabetiche.La riforma della barriera epidermica precoce esclude la penetrazione dell'anticorpo K14 all'interno degli strati epidermici differenziati. All'inizio del processo di riepitelizzazione, i cheratinociti dello strato basale K14 positivo migrano verso l'interno sopra la ferita aperta, in modo tale che l'epidermide più vicina al bordo esterno della ferita si formi prima dell'epidermide più vicina al bordo interno della ferita. Più tardi nella fase di riparazione, la colorazione K14 viene persa poiché l'epidermide si differenzia dall'esterno verso l'interno.La colorazione dell'intero monte può anche essere utilizzata per studiare l'espressione e la localizzazione di altri marcatori rilevanti della ferita nella pelle, nonché la presenza di cellule immunitarie di interesse nel sito della ferita in diverse fasi di guarigione. Generare ferite escissionali riproducibili può essere difficile all'inizio. Consigliamo di praticare la procedura di ferimento utilizzando la pelle in eccesso.

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