Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

パオロ・マッテウチ氏とジョージ・スミス氏が患者組織を提供してくれたことに感謝します。また、アンバー・ローズ・スタッフォードさんが組織収集を支援し、ラボ施設を提供してくれたデイジー・アピールにも感謝しています。

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

本実験プロトコルでは、全実装組織染色を用いてヒトex vivo皮膚における創傷閉鎖を評価するための最適化された方法について述べている。これは、潜在的な創傷治療の批判的評価を可能にし、ヒト創傷修復応答のより良い理解を提供するための重要な資源である。我々は、以前に12、13のex vivo皮膚創傷における治癒評価を発表しましたが、これらの報告書では、全マウント染色アプローチは創傷閉鎖を測定するために使用されませんでした。全体実装染色ははるかに簡単で、パラフィンやOCTのサンプルの埋め込みと切除を伴う標準的な占星術よりも技術的な経験が少なくて済みます。また、全体実装手順は実験のばらつきを低減し、組織内の定義された位置で単一の横断セクションだけでなく、創傷全体を定量化することができます(比較例については図4Bを参照)。我々は、マウス急性創傷14に対するRheaとDunnwaldによって明確に概説されているように、非対称創傷構造全体の治癒を定量化することの重要性を完全に支持する。これらの著者らは、創傷形態の再現性と正確な測定のために生体内切除創傷を連続的に切除することの重要性を示した。連続断面化は、ヒトのex vivo創傷にも同様に適用できます。しかし、創傷閉鎖と再上皮化を正確に定量するためには、高スループットの全マウント染色が好ましい方法であるべきである。我々は、この全マウント染色プロトコルは、従来の組織学的分析のための後続の処理(waxまたはOCT)とも互換性を持つべきであることに注意してください。
全体マウント染色は欠点がないわけではありません。創傷治癒実験でより高い再現性を与えるが、標準的な組織学的技術よりも分析のためのより多くの組織の使用を必要とする。これは、特に複数の抗体を評価する必要がある場合に、組織アクセスが制限される問題である可能性があります。別のアプローチは、創傷の幅が比較的均一で変動性が低下する切開創傷法を採用することであろう(マウスおよびヒト創傷15,16に示すように)。しかし、切除創傷は、ほとんどの病理学的創傷タイプ17に適用可能なままである。
本研究では、6mmの皮膚外植の中心内に2mmの部分的な厚さの創傷が作成された。この方法は、異なる皮膚深さ18で代替切除創傷および外植サイズに最適化され得る。さらに、創傷を発生させるために必要な力はドナーによって異なり、老化した皮膚は生検に対してより少ない力を必要とする。また、皮膚を使用して、目立つストレッチマークやその他の構造変更を表示しないようにします。我々は、ex vivo治癒応答の異なる側面を考慮するために、様々な抗体を検証した。このプロトコルは、抗体濃度およびインキュベーション時間を最適化する必要がある他の皮膚関連抗体と共に使用される場合もあります。それにもかかわらず、我々のプロトコルは、全創傷閉鎖の絶対的定量化に最も適していると考えており、その後、関心のある特定のタンパク質の空間的評価が行われる。全体実装は、組織切片の標準的な組織学的分析に対して免疫局在化の分解能を低減する一方で、標準の2D組織学に欠けている追加の3D情報を提供します。
ex vivo皮膚とin vivoモデルの治癒を評価する1つの注意点は、全身的な応答が欠けているということです。創傷修復の重要な側面は、炎症およびその後の組織造粒であり、血管系19からの炎症細胞および内皮細胞の流入によって引き起こされる。この制限にもかかわらず、ex vivo皮膚は、細胞ベースの創傷アッセイよりも臨床的治癒のより良い要約を提供する。一般に、インビトロ実験では、単一細胞型の単層または組織培養プラスチック上で増殖した共培養が含まれ、一方、ex vivo skinは細胞の挙動を探索するネイティブ環境を提供する。最近では、多くの皮膚等価系が出現し、人工マトリックスおよび単離された皮膚細胞20,21から実験室で皮膚が成長する。これらのモデルは、ほとんどのインビトロアプローチよりも人間の皮膚を模倣するが、彼らはまだ完全にネイティブ組織環境をシミュレートしていないし、一般的に再現性を傷つけるには壊れやすい。さらに、我々(および他)は、ex vivoヒト皮膚組織が存在する免疫細胞を保持することを実証しており、これは間違いなく22,23の修復に寄与するであろう。今後の作業は、後期治癒評価24のためのex vivoモデルの生存率と免疫能力の拡張に焦点を当てるべきである。1つの選択肢は、組織の生存率を延長し、培養25で最大2週間のネイティブ皮膚アーキテクチャを維持することができる有望な臓器オンチップ技術のさらなる進歩である。Ex vivoモデルはまた、好中球などの免疫細胞を宿主組織26に組み込むことや、宿主組織に免疫反応27を惹起する抗体を注入することで、皮膚炎症反応の重要性を考慮し始めている。これらの知見は、将来的にはより洗練された翻訳可能な方法の開発への道を開くことを期待しています。
創傷閉鎖を測定するためにex vivo皮膚を使用することの大きな利点は、健康(例えば、非糖尿病)と病理学的(例えば、糖尿病または老化)組織における治癒率を比較する能力である。ここでは、再表皮化とバリア形成が糖尿病と健康なex vivo創傷で実際に損なわれることを示した。実際、これは、老化および糖尿病が慢性創傷を発症するための主要な危険因子である病理学的修復の前臨床評価のための経路を提供する1.体外病理モデルは、老化および糖尿病組織から分離された細胞、または高血糖症28,29を模倣するために高グルコースで培養された細胞など存在するが、これらの細胞は生体内微小環境から除去されると、すぐにその表現型を失うことがある。外因性病理学的治癒環境の重要な構成要素は、老化および糖尿病30の両方で変化する真皮マトリックスである。実際、この摂動マトリックスは、居住者およびナイーブ線維芽細胞31、32の行動に影響を与える。したがって、宿主組織環境における細胞の研究の重要性を過小評価することはできません。
要約すると、我々のプロトコルは、ヒト創傷再上皮化を定量化し、調節因子を探索し、潜在的な治療の有効性および有効性を試験するための重要なプラットフォームを提供する12,13。前臨床試験はまだインビボアプローチを必要としますが、ex vivoヒト組織とインビボマウス創傷を使用した組み合わせ戦略は、動物の使用を改善しながら、種間の翻訳可能性を高めながら、前臨床経路を改善する必要があります。

高齢者や糖尿病患者に非常に蔓延している慢性的で治癒しない創傷は、臨床的な満たされていない必要性の大部分が評価されていない領域である。これらの傷は、患者に大きな身体的および心理的負担を提示し、1を治療するために毎年数十億ドルの医療提供者に費用がかかります。創傷生物学の理解が向上し、技術の進歩にもかかわらず、慢性創傷の最大40%はまだ最高の標準的なケア2に続いて治癒することができない。したがって、糖尿病性足潰瘍患者の14〜26%は、その後切断3を必要とし、5年間の切断後の死亡率は約70%4である。その結果、治癒の傷の低下によって引き起される実質的な医療負担を軽減しながら、患者の生活の質を向上させるための効果的な新しい治療法を開発することが緊急の要件です。予測が不十分な前臨床モデルは、効果的な新しい治療法の開発に依然として大きなハードルを持っています。
創傷修復は、多様な細胞タイプ、無数のレベルのコミュニケーション、および時間的に改造された組織環境を含む動的で多面的なプロセスです。皮膚の治癒は、止まり止め、炎症、増殖、およびマトリックスリモデリングの4つの主要な修復段階によって支えられています。これらの段階は最終的に失血や感染を防ぐために作用し、創傷表面を閉じ(再上皮化と呼ぶプロセス)、皮膚を傷つけていない状態に戻す5。慢性創傷は、治癒過程に対する多様な病因および広範な摂動と関連しており、治療標的の同定をさらに複雑にする。それにもかかわらず、創傷病理の分子および細胞の促進要因を解明し、新しい治療アプローチ7をテストするために、幅広いモデルが開発されてきた。
最も使用される創傷修復モデルは、マウスの急性創傷である。マウスは、機械学的研究のために非常に難解であり、老化と糖尿病の検証されたモデルを提供します 8.マウスと人間の治癒の間で示される一般的な類似点にもかかわらず、皮膚構造と治癒ダイナミクスの種間の違いは残っている。これは、ほとんどのマウス創傷研究が簡単にクリニック9に翻訳しないことを意味します。その結果、高い適用性と翻訳性10、11を持つヒトin vitroおよびex vivoシステムに向けてプッシュがありました。
ここでは、ヒトの皮膚の外来で部分的な厚さの切除傷を行うための詳細なプロトコルを提供する。また、エキビボヒトの皮膚治癒を評価する非常に再現性の高い方法として、全マウント染色アプローチの概要を説明します。表皮修復(再上皮化)とその後のバリア形成の軌跡を示し、健康なヒト皮膚と糖尿病患者の皮膚における創傷閉鎖率を評価する。最後に、さまざまな抗体を用いて全体実装染色を適応し、治癒反応の様々な側面を評価する方法を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

主に高齢者や糖尿病に影響を与える慢性的な非治癒創傷は、臨床アンメットニーズの重要な領域である。残念ながら、現在の慢性創傷治療は不十分ですが、利用可能な前臨床モデルは新しい治療法の臨床的有効性を十分に予測しません。ここでは、ヒトの皮膚修復応答の複数の側面を評価するための高スループット、前臨床モデルについて説明する。部分的な厚さの創傷は、ヒトのex vivo皮膚で作成され、治癒時間コース全体で培養された。皮膚創傷生検は、全マウント染色手順のための固定剤で収集した。固定サンプルを一次抗体でブロックしてインキュベートし、蛍光結合二次抗体を介して検出を行った。創傷は、各生検における創傷閉鎖率(再上皮化)を計算する前に、共焦点顕微鏡を介して対数化され、画像化された。このプロトコルを適用すると、健康なドナー皮膚で作成された2mmの切除創傷が4-5日目の創傷後までに完全に再表皮化されることを明らかにした。逆に、糖尿病性皮膚創傷の閉鎖率は著しく低下し、障害性の改変を伴う。人間の皮膚創傷と新しい全マウント染色アプローチを組み合わせることで、迅速かつ再現可能な方法で元生体内創傷修復を定量化することができます。総称して、このプロトコルは、潜在的な創傷療法の有効性を評価するための貴重なヒトプラットフォームを提供し、前臨床検査と検証を変革する。

本報告では、ヒトの皮膚修復反応に影響を与える因子を評価するための新しいex vivo皮膚創傷および全マウント染色法を提示する。図1Aは、創傷インキュベーション時間に応じて3〜10日で行うことができる手続き型パイプラインの概略を示す。部分的な厚さの創傷は空気の膜積み重ねで培養される:膜界面および全マウント染色のために集めることができる、パラフィンまたはOCT培地に埋め込んで一般の神学のために、または生化学的分析のために液体窒素で凍結する(図1B)。我々は一般的に6ミリメートルの外植の中心内に2ミリメートルの部分的な厚さの傷を作成します。しかし、創傷および周囲の外植の大きさは、要件に応じて変更される可能性があります。全実装手順は、免疫性ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光染色法の両方に対してうまく適応されている(図1C)。
免疫蛍光は、複数の抗体を用いた組織の調査を可能にする。このために、我々は、異なる種で育てられた一次抗体と、種間反応性を制限するために蛍光結合二次抗体を一致させた種を使用することをお勧めします。抗体濃度とインキュベーション時間を最適化する必要があります。バックグラウンド染色が観察された場合、抗体濃度を下げ、洗浄工程を増加させ、二次抗体にブロッキングバッファーを追加します。新鮮な組織の生存率は、商業用生存性染料で直接評価することができます(材料表を参照)。また、組織が生存後染色を固定し、それが実用的に適している場合に正常に画像化され得ることも示した(図1D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> 図1:ヒトのエキビボ創傷と全マウント染色アプローチ(A)皮膚の採取からエクスビボ創傷の実行から、組織の染色とデータの分析に関する手続きワークフローを描いたパイプライン。(B) ヒトのex vivo皮膚創傷培養システムを示す図を、組織上で日常的に行う分析を行う。(C)全実装染色法は、免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光技術の両方を用いて使用することができる。K14 = ケラチン 14.(D)生組織は、商業的生存性染料で染色され、正常に後固定後に画像化され得る。バー = 100 μm。この染色は、非糖尿病の皮膚で行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
創傷の全体の取り付け染色に最も広く適用される用途は、組織学的切除を介して提供できるよりも再現可能な方法で創傷閉鎖率を決定することです。閉包率は、図2Aに示すように、創傷表面の再上皮化率として定量化された。特定のマーカーのパーセンテージ面積カバレッジは、全創傷領域から、または再上皮化創傷の割合として測定することができる。我々は、7日間の時間経過にわたって健康(非糖尿病)対糖尿病皮膚の治癒を特徴付け、創傷後の毎日で創傷を収集した(代表的な画像、図2B)。健康な皮膚創傷は予想通り時間の経過とともに閉じられ、4-5日目までにほとんどのサンプルで完全閉鎖が観察された。逆に、糖尿病の皮膚創傷は、7日間の分析期間内に完全に閉じることができませんでした(図2C)。各時点の傷害後の治癒率を比較すると、健康な皮膚創傷と糖尿病性皮膚創傷の間で創傷閉鎖の有意な遅延が観察された(P <0.001から6日目、P<6日目に0.05、P<0.05からP<0.001日目7日目)。 
全体的な創傷閉鎖率の評価に続いて;K14陽性細胞を可視化できる創傷領域全体( 図2Aの外側領域)の割合を測定した( 図2Bの緑色染色)。興味深いことに、健康なex vivo皮膚創傷では、K14染色が2日目にピークを迎え、その後急速に減少したことを観察した(各時点での有意性と2日目のピーク、 図2D)。これは、分化された表皮層を介したK14抗体の浸透を除いた、初期の表皮バリアの再形成を反映している可能性が高い( 図2E 図表を参照)。再表皮化プロセス中、基底層(K14+ve)ケラチノサイトは、外側の創傷縁に近い表皮が内側の創傷縁に近い表皮よりも早く形成するように開いた創傷の上に内側に移動する(前部移動)。新たに形成された表皮の前縁が残りの開いた創傷を閉じるように移行し続ける一方で、外縁表皮は他の表皮層を改心するように区別し始める。早期治癒では、再表皮化領域のほとんどが基底(K14+ve)細胞で構成され、後の修復では表皮が外側の内側に分かれるにつれてK14染色が失われると予想されます( 図2Eの全マウント画像を参照)。したがって、 図2D に示すK14染色の減少(下向き矢印)は、表皮分化の増加と相関する。興味深いことに、目に見えるK14染色は、健康(2日目)対糖尿病(4日目)の創傷に対して早期にピークに達し、糖尿病性皮膚創傷において再上皮化とその後の表皮分化が遅れることをさらに実証した。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> 図2:全身取り付け染色は、糖尿病と健康な皮膚における摂動治癒率を明らかにする。 ブライトフィールド画像は、ケラチン14(K14)が赤で染色されている。Bar = 300 μm(B) 健康で糖尿病の皮膚における時間経過による治癒(日の創傷後)の代表的な画像。バー = 500 μm. K14 = 緑。DAPI = 青核。(C)創傷閉鎖率の定量化(再上皮化率)は、健康な皮膚からの元生体創傷が糖尿病皮膚からの元生体創傷よりも有意に速く近いことを示す。H = 正常です。Db = 糖尿病。(D) 健康な皮膚と糖尿病の皮膚で早くピークを染色し、表皮分化の増加(下向き矢印)に沿って減少する割合K14。(E)K14 (基底表皮細胞) 染色は、表皮が分化するにつれて失われる。D = 区別されます。ND = 区別されません。白い点線は、内側と外側の巻線を表します。白い矢印 = 移行方向。n = ドナーあたり6つの創傷、1ポイント当たり。平均 +/- SEM. * = P < 0.05、 ** = P < 0.01 および *** = P 0.001 <。Cの各治癒時点での健康および糖尿病性の比較(P値は最も有意でない比較のため)。Dの各ドナーのピークと比較してK14染色の時間変化.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
次に、全マウント染色を用いて、非糖尿病皮膚における他の創傷関連マーカーの組織発現と局在化を調べる(図3)。使用されるすべての抗体とその作用濃度は、材料表に提供されています。開いた創傷の血管はα平滑筋アクチン(a-SMA)抗体で陽性に染色され、下力画像で表皮縁を線引するためにK14と組み合わせて使用される(図3A)。真皮マトリックスを、コラーゲンI型(COL1)およびフィブロネクチン(Fn)に対する抗体で染色した。ここでコラーゲンは、フィブロネクチン繊維がまばらで、波状で、薄い間に豊富な厚繊維として観察された(図3A)。当社の全マウント染色法は、K14陽性角化細胞に示されるように、染色の細胞レベルの分解能を提供することもできる(図3B)。
最後に、ヒトの元生体創傷は、3日目の創傷後に新たに形成された表皮の周りに検出されたランゲルハンス細胞を有する存在性免疫細胞を有することを示す(図3C)。実際、これらの結果は、全マウント染色が炎症、増殖、および細胞外マトリックスを含む治癒応答の主要な特徴を調査するために使用され得ることを示唆している(図4A)。まとめると、我々のデータは、組み合わされたex vivo皮膚創傷と全マウント染色手順が健康で糖尿病(病理学的)ヒト皮膚修復の様々な側面を評価するための有効な方法であることを明らかにした。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> 図3:他の抗体で使用するための全実装染色法の最適化(A)血管はアルファ平滑筋アクチン(α-SMA、緑色)とケラチン14(K14、赤)で染色され、マトリックス繊維はコラーゲンI(COL1、赤色)およびフィブロネクチン(Fn,緑色)で染色された。(B) 全マウント手順は、ローカリゼーションのセルレベルの分解能 (K14, 緑) まで提供します。K1、赤)。(C)CD1a+ve ランゲルハンス細胞(緑色)新たに形成された表皮で観察される。DAPI = 青核。バー = 100 μm。白い点線は、内側と外側の傷の縁と表皮から別々の創傷を示しています。この染色は、非糖尿病の皮膚で行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> 図4:創傷治癒を評価するための全マウント染色手順の妥当性(A)全体の取り付け染色技術が創傷関連のプロセスを評価する方法を示す図。使用される抗体 = 赤いテキスト。K14 = ケラチン 14.COL1=コラーゲン1。Fn = フィブロネクチン。(B)全マウント染色法(青矢印)は、標準的な組織学的分析(赤い矢印)よりも創傷閉鎖測定のばらつきが少ない。S1 = セクション 1。WE = 巻きエッジ。バー = 300 μm。この染色は、非糖尿病の皮膚で行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

ここでは、全マウント染色アプローチと組み合わせたex vivoヒト皮膚を用いた創傷修復を評価するための最適化された技術を実証する。この方法論は潜在的な創傷療法の評価のための前臨床プラットホームを提供する。

皮膚修復を正確に評価するヒトEx vivo創傷モデルと全山染色法

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

本稿では、臨床翻訳パイプラインの一部として重要な有効性データを提供できる最適化されたex vivoヒト皮膚創傷プロトコルを提示する。この技術の主な利点は、生きている人間の皮膚における創傷修復の高スループットの正確な評価を可能にすることです。この手順を実証するのは、博士研究員のエリザベス・ロバーツと、私たちの研究室の研究助手であるアレクサンドリア・キッドです。創傷のための皮膚組織サンプルを準備するには、皮膚真皮側を90ミリメートルのペトリ皿に下に置き、脂肪組織を取り除くために滅菌ハサミを使用します。すべての脂肪が取り除かれたら、脂肪組織の残留血液を除去するために断続的な揺れと室温で10分間抗生物質を補ったHBSSの25ミリリットルに皮膚を置く。10分後、25ミリリットルのDPBSで皮膚をすすいだ。10分後、抗生物質を使わずにHBSSリンスを繰り返し、25ミリリットルのDPBSで最後のリンスを行います。その後、吸収性パッドスタックに滅菌ナイロンフィルター膜を置き、残留DPBSを除去するために90ミリメートルペトリ皿で滅菌ガーゼの皮膚の真皮側を乾燥させます。乾燥した皮膚真皮側を清潔な90ミリメートルのペトリ皿蓋の上に下に置き、残留DPBSを取り除き、新鮮な滅菌ガーゼで表皮を乾燥させます。傷を作成するには、皮膚をしっかりと保持し、穏やかにねじりながら、皮膚に対して2ミリメートルの生検パンチを押してください。湾曲した歯付き組織鉗子を使用して、直径約2ミリメートルの傷口の両側を拾い、傷口の下に湾曲したアイリスはさみを引っ掛けます。6ミリメートルの生検パンチを使用して、中央の2ミリメートルの創傷の周りの生検を行い、中央に部分的な厚さ2ミリメートルの傷を負った6ミリメートルの外植を作成します。その後、創傷外植表皮側をナイロンフィルター膜スタックの上に置き、摂氏32〜37度、炭酸ガス5%で1〜7日間のインキュベーションを行います。蛍光染色の場合は、1管あたり500マイクロリットルの皮膚固定剤を含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで創傷外植を収集し、4°Cで一晩植木物をインキュベートします。翌日、固定液を1ミリリットルの洗浄バッファーに交換します。洗浄後、各サンプルを約150マイクロリットルのブロッキングバッファーで覆い、室温で1時間インキュベートします。ブロッキングバッファーを取り外した後、チューブ当たりのブロッキングバッファーで希釈した一次抗体の150マイクロリットルを加え、創傷外植を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、0.2%のアジドナトリウムを含む500マイクロリットルの染色洗浄バッファーでサンプルをリンスし、続いて通常の洗浄バッファーに3リンスを入れます。洗浄後、洗浄バッファーを染色洗浄バッファーで希釈した適切な蛍光結合二次抗体の 150 マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で 1 時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、室温で150マイクロリットルのDAPIで各外植を反染色する前に、洗浄バッファーを洗浄ごとに500マイクロリットルで30分間30分間外植を洗い流します。最後に、1回の洗浄バッファー500マイクロリットルで30分間、外植を2回洗浄します。外植イメージングの場合は、60ミリメートルのペトリ皿を共焦点顕微鏡のイメージングプラットフォームに配置し、約1ミリリットルのDPBS層を皿に加えます。鉗子を使用して、傷ついた外植物を皿に移します。実験に適したイメージングソフトウェアを設定した後、創傷を撮像平面の中央に配置し、創傷生検の画像を取得する。ワイヤレスデジタル顕微鏡イメージングを実行して、費用対効果の高い方法で高品質の画像を取得するには、携帯電話またはラップトップをワイヤレスデジタル顕微鏡に接続します。外植をラボ組織の一部に上に置き、残りの洗浄バッファーをサンプルから取り除きます。次に、顕微鏡の視野の中央に外植を配置し、接続されたカメラを使用して画像を取得します。免疫性ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光は、全ての実装組織染色に使用することができる。さらに、生きた/死んだ染色は、新鮮な組織に対して行われ、予めまたは後の固定をイメージすることができます。創傷の全体のマウント染色は、再現可能な方法で創傷閉鎖率を決定するために使用することができる。この代表的な分析では、健康な皮膚創傷閉鎖は4〜5日後に観察され、糖尿病性皮膚創傷は7日間の分析期間内に完全に閉じることができなかった。K14発現は、表皮分化の増加に伴って急速に減少する前に、健康な皮膚創傷で2日目にピークを迎えた。この再表皮化とその後の表皮分化は、糖尿病性皮膚創傷において遅れた。初期表皮バリアの改変は、区別された表皮層内のK14抗体の浸透を排除する。再表皮化プロセスの初期に、K14陽性基底層角化細胞は開いた創傷の上に内側に移動し、外側の創傷端に近い表皮が内側の創傷端に近い表皮よりも早く形成される。修復段階の後半では、表皮が外側の内側から区別するので、K14染色は失われます。全体のマウント染色はまた、皮膚の他の創傷関連マーカーの発現および局在化、ならびに治癒の異なる段階における創傷部位における目的の免疫細胞の存在を研究するために使用することができる。再現性の切除傷を発生させることは、最初は困難です。余剰肌を使って傷の手順を実践することをお勧めします。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...