Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Vi vil takke Mr Paolo Matteuci og Mr George Smith for å gi pasientvev. Vi er også takknemlige til Miss Amber Rose Stafford for å bistå med vevsinnsamling og Daisy Appeal for å tilby laboratoriefasiliteter.

Menneskelig hud ble hentet fra pasienter som gjennomgikk rekonstruktiv kirurgi ved Castle Hill Hospital og Hull Royal Infirmary (Hull, UK) under fullt informert, skriftlig pasientsamtykke, institusjonelle retningslinjer og etisk godkjenning (LRECs: 17/SC/0220 og 19/NE/0150). Ikke-diabetiker hud ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår rutinemessig kirurgi (gjennomsnittsalder = 68). Diabetisk hud ble valgt ut fra donorer som hadde etablert diabetes type II og en historie med sårdannelse (gjennomsnittsalder = 81). Prøver fra kirurgi ble transportert i holdingmedier og behandlet umiddelbart ved ankomst til laboratoriet. Alle eksperimentelle trinn ved bruk av uløst humant vev ble utført på Biosafety Level-2 (BSL-2) i et klasse II laminært strømningsbiosikkerhetsskap.
1. Fremstilling av hudkulturmedier og farging av reagenser
MERK: Alle reagens- og forbruksdetaljer finnes i materiallisten. Sørg for at alle reagenser og utstyr som brukes til behandling og kultur av menneskelig vev er sterile. Steriliser instrumenter før bruk og dekontaminer med desinfeksjonsmiddel etter kontakt med vevet. Dekontaminer avfallsprodukter i 1% desinfeksjonsmiddel før avhending.
<ol><li>Holde medier: Supplere høy glukose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 2 mM L-glutamin og 4% (v / v) antibiotika-antimykotisk løsning.</li>
	<li>Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) med antibiotika: Tilsett 4% (v/v) antibiotika-antimykotisk løsning på HBSS. Oppbevars ved 4 °C til bruk.</li>
	<li>Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS): Forbered DPBS ved å oppløse 9,6 g DPBS pulver per liter destillert vann (dH2O). Autoklaver for sterilisering og oppbevaring ved 4 °C til bruk.</li>
	<li>Vekstmedier for mennesker: Tilsuppler høy glukose DMEM med 2 mM L-glutamin, 1% (v / v) antibiotika-antimykotisk løsning og 10% (v / v) foster bovint serum. Oppbevars ved 4 °C til bruk.</li>
	<li>Hudfiksiv: Til 450 ml dH2O, tilsett 40 ml formaldehydoppløsning, 10 ml issyre, 4,5 g natriumklorid og 0,25 g alkyltrimetylammoniumbromid. Oppbevars ved romtemperatur (RT) og brukes i løpet av få dager. FORSIKTIG: Fixative er farlig (irriterende og brannfarlig). Håndter med forsiktighet og kast det via en passende rute.</li>
	<li>Fosfatbufret saltvann (PBS): Klargjør PBS for helmontert farging ved å tilsette 6 g natriumklorid til 100 ml fosfatbufferløsning og 900 ml dH2O.</li>
	<li>Fargevaskbuffer: Løs opp 0,5 % (v/v) Triton X-100 i PBS.</li>
	<li>Blokkeringsbuffer: Tilsett 0,2 % (w/v) natriumazid og 2 % (v/v) dyreserum til fargevaskbufferen. Oppbevars ved 4 °C i opptil to uker. MERK: Blokker i serumet til de sekundære antistoffvertsartene. Natriumazid vil forhindre bakterievekst under inkubasjon.</li>
	<li>DAPI arbeidsløsning: Forbered en 5 mg /ml bestand på 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i dimetylsulfoksid. Fortynn lageret 1:1,000 i farging vaskebuffer for å gi en 5 μg / ml DAPI arbeidsløsning.</li>
	<li>Peroksidaseblokk: Tilsett 0,3 % (v/v) hydrogenperoksid i fargevaskbufferen. Oppbevars ved 4 °C til bruk. Hold deg i mørket for å forhindre nedbrytning.</li>
	<li>ABC-HRP-sett:<ol>
<li>HRP-konjugert sekundært antistoff: 1 dråpe biotinylert kanin anti-geit IgG i 5 ml fargebuffer. Oppbevars ved 4 °C i opptil to uker. MERK: Settet/sekundært brukt vil avhenge av vertsartene til det primære antistoffet.</li>
		<li>Avidin-biotin kompleks (ABC) reagens: 2 dråper reagens A og 2 dråper reagens B i 5 ml farging vaskebuffer. ABC reagens bør fremstilles minst 30 min før bruk. Oppbevars ved 4 °C i opptil to uker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peroksidase substrat: 3 dråper reagens 1, 2 dråper reagens 2, 2 dråper reagens 3 og 2 dråper hydrogenperoksid i 5 ml dH2O. Peroksidase substrat skal tilberedes ferskt umiddelbart før bruk og kan ikke lagres.</li>
</ol>2. Forberedelse av hud for såring
MERK: Disse trinnene skal utføres i et biosikkerhetsskap i klasse II laminær strømning.
<ol><li>Samle huden i å holde medier og transport til BSL-2 kabinettet.</li>
	<li>Plasser hudens dermis side ned i en 90 mm steril Petri-tallerken og fjern fettvev med steril saks.</li>
	<li>Legg huden i et 50 ml rør som inneholder 25 ml HBSS med antibiotika i 10 min ved RT. Rist periodisk for å fjerne restblod og fettvev.</li>
	<li>Gjenta trinn 2.3 ved hjelp av et nytt 50 ml rør.</li>
	<li>Legg huden i et friskt 50 ml rør som inneholder 25 ml HBSS, denne gangen uten antibiotika i 10 min på RT. Rist som i trinn 2.3.</li>
	<li>Utfør en siste hudskylling ved å plassere huden i et nytt rør med 25 ml DPBS. Huden er nå klar til å såre.</li>
</ol>3. Opprette ex vivo menneskelige hudsår
MERK: Disse trinnene skal utføres i et biosikkerhetsskap i klasse II laminær strømning.
<ol><li>Forbered hudkulturrettene før du sårer. I en 60 mm Petri-tallerken stabler du to sterile absorberende pads og tilsetter 4 ml menneskelige hudmedier via siden av parabolen. Plasser en steril nylonfiltermembran på den absorberende putebunken. MERK: Hudmedier kan endres avhengig av de nødvendige behandlingsforholdene. Opptil tre sårutløp kan dyrkes på hver stabel.</li>
	<li>Tørk den dermale siden av huden på steril gasbind i en 90 mm Petri-tallerken for å fjerne gjenværende DPBS. MERK: Dette forhindrer at huden glir rundt når den sårer.</li>
	<li>Plasser huden dermis side ned på en ren 90 mm Petri parabolen lokket og dab epidermis tørr med frisk steril gasbind. MERK: Det er lettere å såre huden i et Petri-kjøkkenlokk enn basen. Etterfølgende arbeid bør utføres raskt for å forhindre at huden tørker ut.</li>
	<li>Hold huden stram, trykk en 2 mm biopsi slag mot huden og vri forsiktig. Ikke slå helt gjennom huden. MERK: Delvise tykkelsessår er designet for å slå gjennom epidermis og delvis inn i dermis. Det kan være donor-til-donor og sted-til-sted variasjon i kraften som kreves for å skape delvis tykkelse sår.</li>
	<li>Bruk buede tannvevs tang for å plukke opp hver side av 2 mm sår og krok buet iris saks under 2 mm såret for å kutte den ut jevnt.</li>
	<li>Biopsi rundt det sentrale 2 mm såret ved hjelp av en 6 mm biopsi punch for å skape en 6 mm utvisning med en delvis tykkelse 2 mm sår i midten. MERK: En 6 mm biopsistans kan brukes til å skåre huden for å markere hvor hvert 2 mm sår skal være. Pass på at du ikke pierce gjennom vevet helt. Lag sårutløp i et honningkakemønster for å redusere svisk.</li>
	<li>Plasser sårutvirkninger epidermis side opp på nylonfiltermembranbunken (fremstilt i trinn 3.1). MERK: Når du håndterer sårutløp, må du passe på at du ikke skader det sentrale såret. Bruk små tang og plukk opp hver utvisning på motsatte sider.</li>
	<li>Inkuber sår ved 32-37 °C og 5 % CO2 i en fuktig atmosfære (90-95 %) i 1-7 dager. Bytt ut mediet hver 2-3 dager.</li>
</ol>4. Helmontert farging av eks vivo sår
MERK: Denne delen beskriver immunfluorescens og immunoperoxidase fargingsmetoder. Bland alle reagenser godt før bruk.
<ol><li>Fluorescerende fargingsmetode<ol>
<li>Samle sår utviser i 1,5 ml mikrosenterifuge rør som inneholder 500 μL hudfikserende og inkubere ved 4 °C over natten. MERK: Fixativet som brukes i denne protokollen fungerer bra for de beskrevne antistoffene. Optimalisering vil være nødvendig for andre antistoffer. Vevsfiksering lenger enn 24 timer kan føre til overfiksering.</li>
		<li>Neste dag fjerner du fikseringsmiddelet og erstatter det med 1 ml fargevaskbuffer. Biopsier kan oppbevares i fargevaskbuffer ved 4 °C opptil 2 uker før farging. MERK: For alle vaskebuffertrinn, bruk en serologisk pipette eller pipettespiss, pass på at du ikke skader såret.</li>
		<li>Aspirer fargevaskbufferen og utfør en skyll til med 1 ml fargevaskbuffer.</li>
		<li>Beregn mengden blokkeringsbuffer som kreves for trinn 4.1.5-4.1.6 (antall prøver x 300 μL = mengde blokkeringsbuffer i μL). Lag ekstra buffer om nødvendig.</li>
		<li>Tilsett 150 μL blokkeringsbuffer i hver prøve og inkuber i 1 time ved RT. For alle fargingstrinn må du sørge for at hver prøve er tilstrekkelig dekket og at det ikke er noen bobler som dekker biopsi såroverflaten. MERK: Dette trinnet og fremover kan utføres i 1,5 ml mikrosenterrør eller i en 48 brønnplate. Hvis du bruker en 48 brønnplate, inkuber sårene med ansiktet ned i hver brønn.</li>
		<li>Fortynn det primære antistoffet i den gjenværende blokkeringsbufferen. MERK: Antimus keratin 14 (K14) fortynnet 1:1000 i blokkering buffer fungerer bra. Optimaliser dette trinnet for bruk med andre antistoffer eller flere sonder.</li>
		<li>Aspirer blokkeringsbufferen og tilsett 150 μL primært antistoff per brønn/mikrosentrifugerør. Inkubere sår utvises i primærantistoff ved 4 °C over natten.</li>
		<li>Neste dag aspirerer du det primære antistoffet og skyller i fargevaskbuffer som inneholder 0,2% natriumazid i 1 time ved RT (500 μL per prøve).</li>
		<li>Utfør ytterligere tre skylletrinn ved hjelp av fargevaskbuffer (30 min per vask, 500 μL per prøve).</li>
		<li>Fortynn det fluorescerende konjugede sekundære antistoffet i fargevaskbufferen (f.eks. geit antimus 488 ved 1:400 fortynning).</li>
		<li>Beregn den nødvendige mengden sekundært antistoff (antall prøver x 150 μL = mengde i μL).</li>
		<li>Tilsett 150 μL sekundært antistoff til hvert brønn-/mikrocentrifugerør. Inkuber i 1 time ved RT. Utfør inkubasjonstrinn 4.1.10 - 4.1.16 i mørket, da det sekundære antistoffet er lysfølsomt. MERK: Dette trinnet kan utføres ved 4 °C over natten om nødvendig. Optimaliser konsentrasjonen av sekundært antistoff som kreves for tilstrekkelig signal og begrenset bakgrunnsfarging.</li>
		<li>Fjern det sekundære antistoffet og utfør 3 x 30 min skylling med fargevaskbuffer (500 μL per prøve).</li>
		<li>Kast den gjenværende vaskebufferen og beregn mengden DAPI-arbeidsløsning som kreves (i henhold til trinn 4.1.11).</li>
		<li>Motvirke hver utvisning med 150 μL DAPI arbeidsløsning i 10 min ved RT. MERK: DAPI vil flekke cellekjerner blå. Hoechst fargestoff kan brukes som et alternativ til DAPI.</li>
		<li>Utfør to siste 30 min vasker med fargevaskbuffer (500 μL per prøve). Biopsier kan oppbevares i fargevaskbuffer ved 4 °C i mørket opptil to uker før avbildning.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield farging metode.<ol>
<li>Utfør trinn 4.1.1 - 4.1.3.</li>
		<li>Slukke endogen peroksidaseaktivitet med peroksidaseblokk ved 4 °C over natten. MERK: Dette trinnet er viktig når du bruker et HRP-konjugert antistoff for å redusere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging fra vevet. Svært vaskulært vev vil inneholde mer endogen peroksidaseaktivitet.</li>
		<li>Kast peroksidaseblokken og skyll to ganger i 30 minutter i fargevaskbufferen.</li>
		<li>Utfør trinn 4.1.4 - 4.1.8. MERK: Vasker etter trinn 4.1.7 er spesielt viktig for å fjerne natriumazid fra prøvene. Hvis natriumazid ikke fjernes tilstrekkelig, vil det inaktivere HRP og forstyrre fargedeteksjon.</li>
		<li>Tilsett 150 μL HRP-konjugert sekundært antistoff til hvert brønn-/mikrosenterrør og inkuber over natten ved 4 °C eller 1 time ved RT.</li>
		<li>Fjern det sekundære antistoffet og utfør 3 x 30 min vasker i farging vaskebuffer.</li>
		<li>Tilsett 150 μL ABC-reagens til hvert brønn/mikrosenterrør og inkuber over natten ved 4 °C eller 1 time ved RT.</li>
		<li>Aspirer ABC-reagenset og utfør 3 x 30 min vask i fargevaskbuffer.</li>
		<li>Tilsett 150 μL peroksidasesubstrat i en utvisning og bestem tiden det tar å oppdage en merkbar fargeendring. MERK: Velg en prøve der det forventes sterk farging. I dette tilfellet en rød ring for å vise migrerende epidermis (K14). 3,3'-diaminobenzidin-4, eller et annet passende kromogent substrat, kan brukes som erstatning for dette peroksidase substratet.</li>
		<li>Når en fargeendring er observert, fjern peroksidasesubstratet og erstatt med 1 ml dH2O.</li>
		<li>Gjenta peroksidase-substratdeteksjonen for de andre uttrengningene, og inkuber for tiden som er bestemt i trinn 4.2.11.</li>
		<li>Skyll alle uttrengninger med 1 ml dH2O for å fjerne rester av peroksidasesubstrat. Selv om explants kan lagres opptil en uke ved 4 °C før avbildning, er det bedre å avbilde dem så snart som mulig for å forhindre utvasking av peroksidaseunderlaget i dH2O over tid.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Avbildning og kvantifisering
<ol><li>Fluorescerende avbildning MERK: Fluorescerende avbildning utføres ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Et invertert fluorescerende mikroskop kan imidlertid være tilstrekkelig til å anskaffe 2D-bilder for å kvantifisere sårlukkingshastigheter. Når du velger sekundære antistoffer, må du sørge for at de valgte fluorokromene er kompatible med eksitasjons- og utslippsspektraet til det tilgjengelige mikroskopiutstyret.<ol>
<li>Bruk et konfokalt laserskanningsmikroskop utstyrt med en 2,5x, 10x og 20x objektiv, x-y-z motorisert scene, digitalt kamera og oppkjøpsprogramvare. Slå på den overførte lysdetektoren (TPMT) for å muliggjøre enkel visualisering av hver biopsi og for å muliggjøre måling av total sårlukking. Alternativt kan du måle hvert sår via brightfieldmikroskopi etter fluorescensavbildning.</li>
		<li>Plasser en 60 mm Petri-tallerkenbase på bildeplattformen og tilsett et tynt lag (rundt 1 ml) DPBS. MERK: Hvis for mye DPBS brukes, vil biopsien bevege seg rundt under avbildning. Alternativt kan du bruke en 48 brønnplate hvis en plateholder er tilgjengelig.</li>
		<li>Bruk små vevs tang til å overføre sårutløp fra brønner / mikrocentrifuge rør til Petri parabolen som inneholder DPBS. Plasser den biopsiske sårsiden ned i Petri-parabolen.</li>
		<li>Bruk okularet og fluorescerende lampe for å finne og fokusere på såret. Hvis bobler er fanget under prøven i synsfeltet, plukk opp såret med vevs tang og omplassering.</li>
		<li>Konfigurer bildebehandlingsprogramvaren, og sikre lik pinhole-størrelse mellom kanaler for optimal kontrokalitet. For dette, sjekk verdien av en luftig enhet for hver kanal og velg den største verdien. Velg skannehastighet, bildekvalitet og gjennomsnitt. MERK: Fluorokromene til de konjugerte sekundære antistoffene og den valgte telleren (f.eks. DAPI) vil diktere de nødvendige kanalene.</li>
		<li>Slå på live acquisition-programvaren og juster lasereffekten og forsterkningen av hver kanal til nivåene som kreves for å visualisere farging. Reduser bakgrunnsstøyen ved å øke den digitale forskyvningen.</li>
		<li>Plasser såret i midten av bildeplanet. MERK: Hvis såret ikke fyller hele bildet på grunn av å bruke et mindre mål eller skape et større sår, ta et panel med bilder og sy dem sammen (manuelt eller med en flisfunksjon i den aktuelle bildebehandlingsprogramvaren).</li>
		<li>Skaff bilder av sårbiopsiene. Bruk de samme bildeinnstillingene mellom uttjeninger. MERK: Høyere effektbilder vil tillate vurdering av vevsstrukturer og cellulært markøruttrykk og plassering.</li>
		<li>Samle serielle Z-stabler gjennom såret, spesielt der vevet ikke er helt flatt mot Petri-parabolen. Bruk analyseprogramvare til å skjule Z-stakken til et enkelt bilde med maksimal intensitetsprojeksjon.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield-bildebehandling MERK: Brightfield-avbildning av immunoperoksidasefargede biopsier kan utføres på flere måter.<ol>
<li>Invertert mikroskopavbildning: Forbered sårutvirkning for avbildning ved å plassere dem i en Petri-tallerken/brønn som beskrevet i trinn 5.1.2-5.1.3. Få digitale bilder under brightfield-belysning på et invertert mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Sy sammen flere bilder om nødvendig.</li>
		<li>Trådløs digital mikroskopavbildning: Bruk et trådløst digitalt mikroskop koblet til en telefon eller bærbar PC for å få bilder av høy kvalitet på en kostnadseffektiv måte. Plasser utspringene på sårsiden opp på noe vev og fjern eventuell gjenværende dH2O (eller fargevaskbuffer) fra prøvelagring. Plasser såret utplantet i midten av mikroskopets synsfelt. Hent bilder ved hjelp av det tilkoblede kameraet.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifisering MERK: Prosentvis sårlukking kan kvantifiseres i all programvare som gjør at frihåndsformer kan tegnes og måles. ImageJ kan brukes til å utføre kvantifisering som følger:<ol>
<li>Åpne bildet som skal kvantifiseres i ImageJ-programvare.</li>
		<li>Bruk frihåndsformverktøyet til å tegne rundt utsiden av det re-epitelialiserte såret der det møter den normale huden. Trykk M (eller Analyser | Mål) for å oppnå en "ytre" områdemåling. MERK: Den re-epitelialiserte sårvevsteksturen er forskjellig fra normal hud. Bildene trenger ikke skaleres før denne typen analyse.</li>
		<li>Bruk frihåndsformverktøyet til å tegne rundt det åpne sårområdet. Det er her det åpne såret møter den indre kanten av det re-epithelialiserende vevet. Trykk M (eller Analyser | Mål) for å oppnå en "indre" arealmåling.</li>
		<li>Bruk følgende formel for å utlede prosentandel sår re-epitelialisering / lukking: % Lukking = (Ytre sårområde - Indre sårområde) / (Ytre sårområde) x 100 MERK: Prosentvis arealdekning av antistoffer kan utledes på samme måte (f.eks. K14) eller som en prosentandel av det totale sårområdet. Prosentintensitet kan også gi semi-kvantitativ informasjon om vevsnivåuttrykk for markører av interesse, mens høyeffektsavbildning presenterer uttrykksdata på cellenivå.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

I denne eksperimentelle protokollen beskriver vi en optimalisert metode for evaluering av sårlukking i human eks vivo-hud ved hjelp av helmontert vevsfarging. Dette er en viktig ressurs for å tillate kritisk evaluering av potensielle sårbehandlinger, og for å gi bedre forståelse av den menneskelige sårreparasjonsresponsen. Vi har publisert helbredende vurdering i ex vivo hud sår tidligere12,13, men i disse rapportene ble hele mount farging tilnærming ikke brukt til å måle sårlukking. Helmontert farging er langt enklere og krever mindre teknisk erfaring enn standard histologi, som innebærer parafin- eller OCT-innebygging og seksjonering av prøver. Hele monteringsprosedyren reduserer også eksperimentell variasjon, noe som gjør det mulig å kvantifisere hele såret og ikke bare en enkelt tverrsnitt i en definert posisjon i vevet (se figur 4B for komparativ illustrasjon). Vi støtter fullt ut viktigheten av å kvantifisere helbredelse av hele ikke-symmetrisk sårstruktur, som tydelig skissert av Rhea og Dunnwald for murine akutte sår14. Disse forfatterne viste viktigheten av seriell seksjonering i vivo eksisjonelle sår for reproduserbare og presise målinger av sårmorfologi. Seriell seksjonering kan likeledes brukes på menneskelige ex vivo sår; Men for nøyaktig kvantifisering av sårlukking og re-epitelialisering, bør høy gjennomstrømning helmontert farging være den foretrukne metoden. Vi merker at denne helmonterte fargingsprotokollen også skal være kompatibel med etterfølgende behandling (voks eller OCT) for tradisjonell histologisk analyse.
Helmontert farging er ikke uten ulemper. Selv om det gir høyere reproduserbarhet i sårhelingsforsøk, krever det bruk av mer vev til analyse enn standard histologiske teknikker. Dette kan være et problem der vevstilgangen er begrenset, spesielt der flere antistoffer må vurderes. En alternativ tilnærming vil være å bruke en snittsårmetode der sårbredden er relativt jevn og variasjonen reduseres (som vist i mus og menneskelige sår15,16). Eksisjonssår forblir imidlertid mer anvendelige for de fleste patologiske sårtyper17.
I denne studien ble 2 mm delvis tykkelse sår opprettet i midten av 6 mm hudutløp. Denne metoden kan optimaliseres for alternative eksisjonssår og utvisningsstørrelser ved forskjellige huddybder18. I tillegg vil kraften som kreves for å generere sår variere mellom donorer, hvor alderen hud vil kreve mindre kraft til biopsi. Vi vil også unngå å bruke hud som viser fremtredende strekkmerker eller andre strukturelle endringer. Vi har validert en rekke antistoffer for å vurdere ulike aspekter av ex vivo healing respons. Denne protokollen kan også brukes med andre hudrelevante antistoffer, der antistoffkonsentrasjoner og inkubasjonstider må optimaliseres. Likevel mener vi at vår protokoll er mest egnet til absolutt kvantifisering av total sårlukking, etterfulgt av romlig vurdering av spesifikke proteiner av interesse. Mens helfestet gir redusert oppløsning av immunokalisering versus standard histologisk analyse av vevsseksjoner, gir den ytterligere 3D-informasjon som mangler fra standard 2D-histologi.
En advarsel om å vurdere helbredelse i ex vivo hud versus in vivo modeller er at det mangler en systemisk respons. Et viktig aspekt ved sårreparasjon er betennelse og etterfølgende vevgranulering, som skyldes en tilstrømning av inflammatoriske celler og endotelceller fra vaskulaturen19. Til tross for denne begrensningen gir ex vivo hud fortsatt en bedre recapitulation av klinisk helbredelse enn cellebaserte såranalyser. In vitro eksperimenter generelt involverer single cell type monolayers eller co-kulturer dyrket på vev kultur plast, mens ex vivo hud gir et innfødt miljø for å utforske celle atferd. Mer nylig har en rekke hudekvivalente systemer dukket opp, hvor huden dyrkes i et laboratorium fra kunstig matrise og isolerte hudceller20,21. Selv om disse modellene etterligner menneskelig hud bedre enn de fleste in vitro-tilnærminger, simulerer de fortsatt ikke det opprinnelige vevsmiljøet fullt ut og er generelt for skjøre til å skade reprodusert. I tillegg har vi (og andre) vist at ex vivo menneskelig hudvev beholder bosatte immunceller, noe som uten tvil vil bidra til å reparere22,23. Fremtidig arbeid bør nå fokusere på å utvide levedyktigheten og immunokogeniteten til ex vivo-modellen for senfasehelingsvurdering24. Et alternativ er videreutvikling av lovende organ-on-a-chip-teknologier som er i stand til å forlenge vevs levedyktighet og opprettholde innfødt hudarkitektur i opptil to uker i kultur25. Ex vivo-modeller har også begynt å vurdere viktigheten av hudinflammatorisk respons ved å lykkes med å inkorporere immunceller, som nøytrofiler, i vertsvevet26 eller injisere vertsvev med antistoffer for å fremkalle en immunreaksjon27. Vi forventer at disse funnene vil bane vei for utvikling av mer raffinerte og overførbare metoder i fremtiden.
En stor fordel med å bruke ex vivo hud for å måle sårlukking er evnen til å sammenligne helbredende rater i sunt (f.eks. ikke-diabetiker) versus patologisk (f.eks. diabetiker eller alderen) vev. Her viste vi at re-epithelialisering og barrieredannelse faktisk er svekket i diabetiker versus sunne ex vivo sår. Faktisk gir dette en rute for preklinisk vurdering av patologisk reparasjon, hvor aldring og diabetes er viktige risikofaktorer for å utvikle kroniske sår1. Mens in vitro patologiske modeller eksisterer, for eksempel celler isolert fra alderen og diabetisk vev, eller celler dyrket i høy glukose for å etterligne hyperglykemi28,29, kan disse cellene raskt miste sin fenotype når de er fjernet fra in vivo mikromiljøet. En viktig komponent i det ekstrinsiske patologiske helbredende miljøet er dermal matrise, som endres i både aldring og diabetes30. Faktisk påvirker denne perturberte matrisen oppførselen til bosatte og naive fibroblaster31,32. Dermed kan viktigheten av å studere celler i vertsvevsmiljøet ikke undervurderes.
Oppsummert gir vår protokoll en viktig plattform for å kvantifisere menneskelig sårre-epitelialisering, utforske regulatoriske faktorer og for å teste gyldigheten og effekten av potensielle terapeutiskestoffer 12,13. Mens preklinisk testing fortsatt krever in vivo-tilnærminger, bør en kombinert strategi ved hjelp av ex vivo humant vev og in vivo murine wounding foredle den prekliniske banen, redusere dyrebruken samtidig som kryssartene oversettes.

Kroniske, ikke-helbredende sår, som er svært utbredt hos eldre og diabetikere, er et stort uoppnåelig område med klinisk udekket behov. Disse sårene utgjør en stor fysisk og psykologisk byrde for pasienter og koster helsepersonell milliarder hvert år for å behandle1. Til tross for forbedret forståelse av sårbiologi og fremskritt innen teknologi, klarer opptil 40% av kroniske sår fortsatt ikke å helbrede etter beste standard omsorg2. Dermed krever 14-26% av pasienter med diabetiske fotsår deretter amputasjon3, mens 5-års post-amputasjonsdødelighet ligger på ca. 70%4. Som et resultat er det et presserende krav om å utvikle effektive nye terapier for å forbedre pasientens livskvalitet samtidig som den betydelige helsebyrden som pålegges av dårlige helbredende sår, reduseres. Dårlig prediktive prekliniske modeller er fortsatt et betydelig hinder for utviklingen av effektive nye terapier.
Sårreparasjon er en dynamisk og mangesidig prosess som involverer et mangfoldig utvalg av celletyper, utallige kommunikasjonsnivåer og et vevsmiljø som er temporally ombygd. Hudheling understøttes av fire store reparative stadier: hemostase, betennelse, spredning og matriseoppussing. Disse stadiene virker til slutt for å forhindre blodtap og infeksjon, lukk såroverflaten (en prosess som kalles re-epithelialisering) og returner huden til en uskadet tilstand5. Kroniske sår er forbundet med variert etiologi og utbredt perturbasjon til helbredelsesprosesser6, noe som ytterligere kompliserer identifiseringen av terapeutiske mål. Likevel er et bredt spekter av modeller utviklet for både å belyse molekylære og cellulære drivere av sårpatologi og teste nye terapeutiske tilnærminger7.
Den mest brukte sårreparasjonsmodellen er akutt såring i musen. Mus er svært gjennomførbare for mekanistiske studier og gir validerte modeller for aldring og diabetes8. Til tross for de generelle likhetene som vises blant mus og menneskelig helbredelse, forblir forskjeller mellom arter i hudstruktur og helbredende dynamikk. Dette betyr at de fleste murine sårforskning ikke lett oversettes til klinikken9. Følgelig har det vært et press mot menneskelige in vitro- og ex vivo-systemer med høy anvendbarhet og overførbarhet10,11.
Her gir vi en grundig protokoll for å utføre delvis tykkelse eksisjonelle sår i ex vivo menneskelig hud. Vi skisserer også vår helmonterte fargingstilnærming som en svært reproduserbar metode for å evaluere ex vivo menneskelig hudheling. Vi viser banen for epidermal reparasjon (re-epitelialisering) og påfølgende barrieredannelse, og evaluerer frekvensen av sårlukking i sunn versus diabetiker menneskelig hud. Til slutt demonstrerer vi hvordan helmontert farging kan tilpasses for bruk med en rekke antistoffer for å vurdere ulike aspekter av helbredelsesresponsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Kroniske ikke-helbredende sår, som primært påvirker eldre og diabetikere, er et betydelig område med klinisk udekket behov. Dessverre er nåværende kroniske sårbehandlinger utilstrekkelige, mens tilgjengelige prekliniske modeller dårlig forutsier den kliniske effekten av nye terapier. Her beskriver vi en høy gjennomstrømning, preklinisk modell for å vurdere flere aspekter av den menneskelige hudreparasjonsresponsen. Delvis tykkelse sår ble opprettet i menneskelig ex vivo hud og dyrket over en helbredende tid kurs. Hudsårbiopsier ble samlet inn i fixative for hele monteringsfargingsprosedyren. Faste prøver ble blokkert og inkubert i primært antistoff, med deteksjon oppnådd via fluorescerende konjugert sekundært antistoff. Sår ble mottellert og avbildet via konfektmikroskopi før de beregnet prosentvis sårlukking (re-epithelialisering) i hver biopsi. Ved å bruke denne protokollen avslører vi at 2 mm eksisjonelle sår skapt i sunn donorhud er fullstendig re-epitelialisert ved dag 4-5 etter såring. Tvert imot reduseres lukkingsraten for diabetiske hudsår betydelig, ledsaget av forstyrret barrierereformering. Kombinere menneskelig hudsår med en ny helmontert farging tilnærming tillater en rask og reproduserbar metode for å kvantifisere ex vivo sår reparasjon. Samlet sett gir denne protokollen en verdifull menneskelig plattform for å evaluere effektiviteten av potensielle sårbehandlinger, transformere preklinisk testing og validering.

I denne rapporten presenterer vi en ny ex vivo hudsår og helmontert farging tilnærming for å vurdere faktorer som påvirker den menneskelige hudreparasjonsresponsen. Figur 1A viser et skjema av prosedyrerørledningen, som kan utføres på 3-10 dager, avhengig av sårinkubasjonstider. De delvise tykkelsessårene dyrkes på membranbunker i luften : membrangrensesnitt og kan samles for helmontert farging, innebygd i parafin eller OCT-medium for generell histologi, eller frosset i flytende nitrogen for biokjemisk analyse (Figur 1B). Vi lager vanligvis 2 mm delvise tykkelsessår i midten av 6 mm utplanter. Imidlertid kan størrelsen på såret og omkringliggende utvisning endres avhengig av krav. Helmonteringsprosedyren er vellykket tilpasset både immunoperoxidase og immunfluorescensfargingsmetoder (Figur 1C).
Immunfluorescens gjør det mulig å undersøke vev med flere antistoffer. For dette anbefaler vi å bruke primære antistoffer oppdratt i forskjellige arter, og artstilpassede fluorescerende konjugerte sekundære antistoffer for å begrense reaktivitet på tvers av arter. Antistoffkonsentrasjoner og inkubasjonstider må optimaliseres. Hvis bakgrunnsfarging observeres, reduser antistoffkonsentrasjoner, øk vasketrinnene og legg til blokkeringsbuffer til sekundært antistoff. Frisk vevs levedyktighet kan vurderes direkte med kommersielle levedyktighetsfarger (se Materialtabell). Vi viser også at vev kan være fast etter levedyktighet farging og vellykket avbildet når det er praktisk talt egnet (Figur 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figur 1: Den menneskelige eksvivosår og helmonterte fargingstilnærming. (A) Rørledning som viser den prosedyremessige arbeidsflyten fra å samle inn hud og utføre ex vivo-sår, til farging av vev og analyse av data. (B) Diagram som demonstrerer det menneskelige ex vivo hud sårkultursystemet med analyser rutinemessig utført på vevet. (C) Helmontert farging kan brukes ved hjelp av både immunoperoxidase og immunfluorescensteknikker. K14 = keratin 14. (D) Levende vev kan være farget med kommersielle levedyktighetsfarger og avbildet vellykket etter fiksering. Stang = 100 μm. Denne fargingen ble utført i ikke-diabetikerhud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Den mest anvendelige bruken for helmontert farging av sår er å bestemme sårlukkingshastigheten på en mer reproduserbar måte enn det som kan gis via histologisk seksjonering. Prosentvis lukking ble kvantifisert som prosentvis re-epithelialisering av såroverflaten, som vist i figur 2A. Prosentvis arealdekning av spesifikke markører kan måles fra det totale sårområdet eller som en prosentandel av det re-epitelialiserte såret. Vi karakteriserte helbredelse i sunn (ikke-diabetiker) versus diabetiker hud over en tid på syv dager, samle sår på hver dag etter såring (representative bilder, figur 2B). Friske hudsår lukket over tid som forventet, med full lukking observert i de fleste prøver etter dag 4-5. Tvert imot klarte ikke diabetiske hudsår å lukke seg helt innenfor syv-dagers analyseperioden (Figur 2C). Det ble observert en betydelig forsinkelse i sårlukking mellom friske og diabetikere hudsår ved sammenligning av helbredende hastigheter ved hvert tidspunkt etter skaden (P < 0,001 til dag 6, P < 0,05 på dag 6 og P < 0,05 til P < 0,001 på dag 7).
Etter vurdering av generelle sårstengingsrater; vi målte prosentandelen av hele sårområdet (ytre område i figur 2A) der K14 positive celler kunne visualiseres (grønn farging i figur 2B). Interessant nok observerte vi at i sunne eks vivo hudsår toppet K14-fargingen på dag 2 og deretter raskt avtok (betydning ved hvert tidspunkt kontra dag 2-toppen, figur 2D). Dette gjenspeiler sannsynligvis reformasjon av den tidlige epidermale barrieren, unntatt K14 antistoffinntrengning gjennom differensierte epidermale lag (se figur 2E skjematisk). Under re-epitelialiseringsprosessen migrerer basallag (K14 +ve) keratinocytter innover over det åpne såret slik at epidermis nærmere den ytre sårkanten dannes tidligere enn epidermis nærmere den indre sårkanten (migrerende front). Mens forkanten av den nyopprettede epidermis fortsetter å migrere for å lukke det gjenværende åpne såret, begynner ytre kant epidermis å skille seg ut for å reformere de andre epidermale lagene. Ved tidlig helbredelse forventer vi dermed å se at det meste av det re-epitelialiserte området består av basale celler (K14+ve), mens I senere reparasjon går K14-farging tapt når epidermis skiller seg fra utsiden innover (se helmonterte bilder i figur 2E). Derfor korrelerer nedgangen i K14-farging vist i figur 2D (nedoverpiler) med økt epidermal differensiering. Interessant, synlig K14 farging toppet tidligere i sunn (dag 2) versus diabetikere (dag 4) sår, noe som ytterligere viser at re-epithelialisering og påfølgende epidermal differensiering er forsinket i diabetiske hudsår.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figur 2: Helmontert farging viser forvrengte helbredelseshastigheter i diabetiker versus sunn hud. (A) Metoden som brukes til å kvantifisere sårlukking fra ytre og indre sårmålinger. Brightfield-bilder viser keratin 14 (K14) flekker i rødt. Bar = 300 μm. (B) Representative bilder av helbredelse over tid (dag etter såring) i sunn og diabetiker hud. Bar = 500 μm. K14 = grønn. DAPI = blå kjerner. (C) Kvantifisering av sårlukkingshastigheter (prosent re-epithelialisering) som viser at eks vivo sår fra sunn hud lukkes betydelig raskere enn ex vivo sår fra diabetisk hud. H = sunn. Db = diabetiker. (D) Prosent K14 farging topper tidligere i sunn versus diabetiker hud og deretter avtar i tråd med økt epidermal differensiering (nedpiler). (E) K14 (basal epidermal celle) farging går tapt som epidermis differensierer. D = differensiert. ND = ikke differensiert. Hvite stiplede linjer viser indre og ytre sårkanter. Hvite piler = retning for migrering. n = 6 sår per donor, per tidspunkt. Gjennomsnitt +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 og *** = P < 0,001. Sunn og diabetiker sammenlignet ved hvert helbredende tidspunkt i C (P-verdi for minst signifikant sammenligning). Tidsendring i K14 farging sammenlignet med topp for hver donor i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Vi brukte deretter helmontert farging for å utforske vevsuttrykk og lokalisering av andre sårrelevante markører i ikke-diabetikerhud (figur 3). Alle antistoffer som brukes og deres arbeidskonsentrasjoner er gitt i materialtabellen. Blodkar i det åpne såret farget positivt med alfa glatt muskel actin (a-SMA) antistoff, brukt i kombinasjon med K14 for å avgrense epidermale kanter i lavere effekt bilder (Figur 3A). Den dermale matrisen ble farget med antistoffer mot kollagen type I (COL 1) og fibronectin (Fn). Her ble kollagen observert som rikelig tykke fibre mens fibronectinfibre var sparsomme, bølgete og tynne (Figur 3A). Vår helmonterte fargingstilnærming er også i stand til å gi cellenivåoppløsning av farging, som vist for K14-positive keratinocytter (Figur 3B).
Til slutt viser vi at menneskelige eks vivo sår har bosatte immunceller, med Langerhans celler oppdaget rundt nydannede epidermis på dag 3 post-sår (Figur 3C). Faktisk antyder disse resultatene at helmontert farging kan brukes til å undersøke viktige trekk ved den helbredende responsen, inkludert betennelse, spredning og den ekstracellulære matrisen (figur 4A). Samlet sett avslører våre data at den kombinerte ex vivo hudsår og helmontert farging prosedyre er en gyldig metode for å vurdere ulike aspekter av sunn og diabetiker (patologisk) menneskelig hud reparasjon.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figur 3: Optimalisering av helmontert fargingstilnærming for bruk med andre antistoffer. (A) Blodårene ble farget med alfa glatt muskel aktin (α-SMA, grønn) og keratin 14 (K14, rød), mens matrisefibre ble farget med kollagen I (COL 1, rød) og fibronectin (Fn, grønn). (B) Hele monteringsprosedyren gir opptil cellenivåoppløsning av lokalisering (K14, grønn; K1, rød). (C) CD1a+ve Langerhans celler (grønn) observert i nyopprettet epidermis. DAPI = blå kjerner. Stang = 100 μm. Hvite stiplede linjer viser indre og ytre sårkanter og separate sår fra epidermis. Denne fargingen ble utført i ikke-diabetikerhud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figur 4: Gyldigheten av fargingsprosedyren for hele monteringen for å vurdere sårheling. (A) Illustrasjon som viser hvordan fargingsteknikken for hele monteringen kan evaluere sårrelevante prosesser. Antistoffer brukt = rød tekst. K14 = keratin 14. COL 1 = kollagen 1. Fn = fibronectin. (B) Den helmonterte fargingsprosedyren (blå piler) introduserer mindre variasjon i sårlukkingsmålinger enn standard histologisk analyse (røde piler). S1 = seksjon 1. WE = sårkant. Bar = 300 μm. Denne fargingen ble utført i ikke-diabetikerhud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Her demonstrerer vi en optimalisert teknikk for å vurdere sårreparasjon ved hjelp av ex vivo menneskelig hud kombinert med en helmontert farging tilnærming. Denne metodikken gir en preklinisk plattform for evaluering av potensielle sårbehandlinger.

Human Ex vivo wound modell og hel-mount farging tilnærming for å nøyaktig evaluere hud reparasjon

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

I denne artikkelen presenterer vi en optimalisert ex vivo human hudsårprotokoll som kan gi viktige effektdata som en del av en klinisk translasjonsrørledning. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater en nøyaktig vurdering av sårreparasjon i levende menneskelig hud. Elizabeth Roberts, postdoktor og Alexandria Kidd, en forskningsassistent fra laboratoriet vårt, demonstrerer prosedyren.For å forberede en hudvevsprøve for såring, plasser huden dermis side ned i en 90 millimeter Petri tallerken og bruk steril saks for å fjerne fettvevet. Når alt fettet er fjernet, plasser huden i 25 milliliter HBSS supplert med antibiotika i 10 minutter ved romtemperatur med periodisk risting for å fjerne eventuelt gjenværende blod i fettvev. Etter 10 minutter, skyll huden i 25 milliliter DPBS.Etter 10 minutter gjenta HBSS skyll uten antibiotika, og utfør deretter en siste skylling i 25 milliliter DPBS. Legg deretter en steril nylonfiltermembran på den absorberende putebunken og tørk den dermale siden av huden på steril gasbind i en 90 millimeter Petri-tallerken for å fjerne gjenværende DPBS. Plasser den tørkede huddermis-siden ned på et rent 90 millimeter Petri-parabollokk for å fjerne eventuelle gjenværende DPBS og dab epidermis tørre med frisk steril gasbind.For å skape et sår, trykk en to millimeter biopsi slag mot huden mens du holder huden stram og vri forsiktig. Bruk en buet tannvevs tang, plukk opp hver side av omtrent to millimeter diameter sår og krok buet Iris saks under såret. Bruk en seks millimeter biopsi punch til biopsi rundt det sentrale to millimeter såret for å skape en seks millimeter utvisning med en delvis tykkelse to millimeter sår i midten.Plasser deretter såret explant epidermis side opp på nylonfiltermembranstakken for en til syv-dagers inkubasjon ved 32 til 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. For fluorescerende farging, samle såret utviser i 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder 500 mikroliter hudfiksative per rør og inkuberer explants over natten ved fire grader Celsius. Neste dag erstatter du fikseringen med en milliliter fargevaskbuffer.Etter vasken, dekk hver prøve med ca. 150 mikroliter blokkeringsbuffer og inkuber i en time ved romtemperatur. Etter å ha fjernet blokkeringsbufferen, tilsett 150 mikroliter primær antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer per rør og inkuber såret utviser over natten ved fire grader Celsius. Neste morgen skyller du prøvene med 500 mikroliter fargevaskbuffer som inneholder 0,2% natriumazid etterfulgt av tre skyllinger i vanlig vaskebuffer.Etter vasken, tilsett 150 mikroliter av en passende florescence-konjugert sekundært antistoff fortynnet i farging vaskebuffer til hver brønn for en times inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen skyller du utløpet tre ganger i 30 minutter i 500 mikroliter fargevaskbuffer per vask før du motflekker hver utvisning med 150 mikroliter DAPI i 10 minutter ved romtemperatur. Til slutt vasker du utløpet to ganger i 30 minutter med 500 mikroliter vaskebuffer per vask.For utvisning, legg en 60 millimeter Petri-tallerken på bildeplattformen til et konfokalt mikroskop og legg til et omtrent en milliliterlag DPBS til parabolen. Bruk tang til å overføre såret utviser til parabolen. Etter å ha satt opp bildeprogramvaren etter behov for eksperimentet, plasserer du såret i midten av bildeplanet og skaffer bilder av sårbiopsiene.Hvis du vil utføre trådløs digital mikroskopavbildning for å få bilder av høy kvalitet på en kostnadseffektiv måte, kobler du en telefon eller bærbar DATAMASKIN til et trådløst digitalt mikroskop. Plasser utløpssårssiden opp på et stykke laboratorievev og fjern eventuell gjenværende vaskebuffer fra prøven. Plasser deretter utvisningen i midten av mikroskopets synsfelt og skaff bilder ved hjelp av det tilkoblede kameraet.Immunoperoxidase og immunfluorescens kan brukes til helmontert vevsfarging. I tillegg kan levende / død farging utføres på friskt vev og avbildet pre eller post-fiksering. Hel monteringsfarging av sår kan brukes til å bestemme sårlukkingshastigheter på en reproduserbar måte.I denne representative analysen ble det observert sunn hudsårlukking etter fire til fem dager, mens diabetikere ikke klarte å lukke seg helt innen syv-dagers analyseperioden. K14-uttrykket toppet seg på dag to i friske hudsår før det raskt avtok med økt epidermal differensiering. Denne re-epitelialiseringen og påfølgende epidermal differensiering ble forsinket i diabetiske hudsår.Reformasjonen av den tidlige epidermale barrieren utelukker K14 antistoff penetrasjon i de differensierte epidermale lagene. Tidlig i re-epitelialiseringsprosessen migrerer K14 positive basale lag keratinocytter innover over det åpne såret, slik at epidermis nærmere den ytre sårkanten dannes tidligere enn epidermis nærmere den indre sårkanten. Senere i reparasjonsfasen går K14-farging tapt når epidermis skiller seg fra utsiden og innover.Hel monteringsfarging kan også brukes til å studere uttrykket og lokaliseringen av andre sårrelevante markører i huden, samt tilstedeværelsen av immunceller av interesse på sårstedet på forskjellige stadier av helbredelse. Å generere reproduserbare eksisjonssår kan være utfordrende med det første. Vi vil anbefale å praktisere sårprosedyren ved hjelp av overflødig hud.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering av en klinisk relevant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modell for Gransker Epithelial Wound Reparasjon i Native mikromiljøet

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Dyrking av netthinnens Pigment epitelceller på en Ex Vivo modell av alderen menneskelige Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hele-mount AC Confocal mikroskopi for voksen øre hud: et modellsystem Nevro-vaskulær Branching Morphogenesis og immun celle distribusjon

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...