Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить г-на Паоло Маттеучи и г-на Джорджа Смита за предоставление тканей пациента. Мы также благодарны мисс Эмбер Роуз Стаффорд за помощь в сборе тканей и Призыву Дейзи за предоставление лабораторных помещений.

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

В этом экспериментальном протоколе мы описываем оптимизированный метод оценки закрытия раны в коже человека ex vivo с использованием окрашивания тканей цельного крепления. Это важный ресурс, позволяющий критически оценить потенциальные методы лечения ран и обеспечить лучшее понимание реакции человека на восстановление ран. Мы опубликовали оценку заживления ран кожи ex vivoранее 12,13,но в этих отчетах подход к окрашиванию всего крепления не использовался для измерения закрытия раны. Окрашивание цельным креплением намного проще и требует меньшего технического опыта, чем стандартная гистология, которая включает в себя встраивание парафина или ОКТ и секционирование образцов. Процедура полного крепления также снижает экспериментальную изменчивость, позволяя количественно оценить всю рану, а не только один поперечный участок в определенном положении в ткани (см. Рисунок 4B для сравнительной иллюстрации). Мы полностью поддерживаем важность количественного заживления всей несимметричной структуры раны, как это четко изложено Реей и Даннвальдом для мышиных острых ран14. Эти авторы показали важность последовательного секционирования in vivo эксцизионных ран для воспроизводимых и точных измерений морфологии раны. Серийное сечение может в равной степени применяться к ранам человека ex vivo; однако для точной количественной оценки закрытия раны и повторной эпителизации предпочтительным методом должно быть высокопроизводительное окрашивание всего крепления. Отметим, что этот протокол окрашивания всего крепления также должен быть совместим с последующей обработкой (воск или ОКТ) для традиционного гистологического анализа.
Окрашивание цельным креплением не лишено недостатков. Хотя он обеспечивает более высокую воспроизводимость в экспериментах по заживлению ран, он требует использования большего количества тканей для анализа, чем стандартные гистологические методы. Это может быть проблемой, когда доступ к тканям ограничен, особенно там, где необходимо оценить несколько антител. Альтернативным подходом было бы использование метода разрезанного ранирования, при котором ширина раны относительно равномерна, а изменчивость снижается (как показано в ранах мышей и человека15,16). Однако эксцизные раны остаются более применимыми к большинству патологических ран типов17.
В этом исследовании раны частичной толщины 2 мм были созданы в центре 6 мм эксплантов кожи. Этот метод может быть оптимизирован для альтернативных размеров эксцизионных ран и эксплантов на разных глубинах кожи18. Кроме того, сила, необходимая для создания ран, будет варьироваться между донорами, где стареющая кожа будет требовать меньше силы для биопсии. Мы также избегаем использования кожи, отображающей заметные растяжки или другие структурные изменения. Мы проверили ряд антител для рассмотрения различных аспектов реакции заживления ex vivo. Этот протокол также может быть использован с другими антителами, относящимися к коже, где концентрации антител и время инкубации должны быть оптимизированы. Тем не менее, мы считаем, что наш протокол наиболее подходит для абсолютной количественной оценки общего закрытия раны с последующей пространственной оценкой конкретных белков, представляющих интерес. В то время как цельное крепление обеспечивает снижение разрешения иммунолокализации по сравнению со стандартным гистологическим анализом участков тканей, оно предоставляет дополнительную 3D-информацию, отсутствующую в стандартной 2D-гистологии.
Одно из предостережений при оценке заживления кожи ex vivo по сравнению с моделями in vivo заключается в том, что ему не хватает системного ответа. Важным аспектом заживления ран является воспаление и последующая грануляция тканей, которая вызвана притоком воспалительных клеток и эндотелиальных клеток из сосудистой клетки19. Несмотря на это ограничение, кожа ex vivo по-прежнему обеспечивает лучшее повторение клинического заживления, чем анализы ран на основе клеток. Эксперименты in vitro в целом включают монослои одноклеточного типа или совместные культуры, выращенные на пластике тканевой культуры, тогда как кожа ex vivo обеспечивает нативную среду для изучения поведения клеток. Совсем недавно появился ряд кожных эквивалентных систем, где кожа выращивается в лабораторных условиях из искусственного матрикса и изолированных клеток кожи20,21. Хотя эти модели имитируют кожу человека лучше, чем большинство подходов in vitro, они все еще не полностью имитируют среду нативной ткани и, как правило, слишком хрупкие, чтобы воспроизводимо травмировать. Кроме того, мы (и другие) продемонстрировали, что ткань кожи человека ex vivo сохраняет резидентные иммунные клетки, которые, несомненно, будут способствовать восстановлению22,23. Будущая работа теперь должна быть сосредоточена на расширении жизнеспособности и иммунокомпетентности модели ex vivo для оценки заживления на поздней стадии24. Одним из вариантов является дальнейшее продвижение перспективных технологий «орган на чипе», способных продлить жизнеспособность тканей и поддерживать нативную архитектуру кожи на срок до двух недель в культуре25. Модели ex vivo также начали учитывать важность воспалительной реакции кожи путем успешного включения иммунных клеток, таких как нейтрофилы, в ткань хозяина26 или введения в ткань хозяина антител для вызова иммунной реакции27. Мы ожидаем, что эти результаты проложат путь к разработке более совершенных и переводимых методов в будущем.
Основным преимуществом использования кожи ex vivo для измерения закрытия раны является возможность сравнивать показатели заживления в здоровой (например, недиабетической) и патологической (например, диабетической или пожилой) ткани. Здесь мы показали, что реэпителизация и формирование барьера действительно нарушаются при диабетических и здоровых ранах ex vivo. Действительно, это обеспечивает путь для доклинической оценки патологического восстановления, где старение и диабет являются основными факторами риска развития хроническихран1. В то время как существуют патологические модели in vitro, такие как клетки, выделенные из пожилой и диабетической ткани, или клетки, культивируемые в высоком уровне глюкозы для имитации гипергликемии28,29,эти клетки могут быстро потерять свой фенотип после удаления из микросреды in vivo. Важным компонентом внешней патологической заживляющей среды является дермальный матрикс, который изменяется как при старении, так и при диабете30. Действительно, эта возмущенная матрица влияет на поведение резидентных и наивных фибробластов31,32. Таким образом, важность изучения клеток в среде тканей хозяина нельзя недооценивать.
Таким образом, наш протокол предоставляет важную платформу для количественной оценки реэпителизации ран человека, изучения регуляторных факторов и проверки достоверности и эффективности потенциальных терапевтических средств12,13. В то время как доклинические испытания по-прежнему требуют подходов in vivo, комбинированная стратегия с использованием ex vivo человеческих тканей и in vivo мышиных ран должна усовершенствовать доклинический путь, уменьшая использование животных при одновременном повышении межвидовой переводимости.

Хронические, незаживающие раны, которые широко распространены у пожилых людей и диабетиков, являются в значительной степени недооцененной областью клинической неудовлетворенной потребности. Эти раны представляют собой серьезное физическое и психологическое бремя для пациентов и обойдётся медицинским работникам в миллиарды долларов каждый год длялечения 1. Несмотря на улучшение понимания биологии ран и достижения в области технологий, до 40% хронических ран все еще не заживают в соответствии с лучшим стандартным уходом2. Так, 14-26% пациентов с диабетической язвой стопы впоследствии нуждаются в ампутации3,в то время как 5-летняя смертность после ампутации составляет примерно 70%4. В результате возникает настоятельная необходимость в разработке новых эффективных методов лечения для улучшения качества жизни пациентов при одновременном снижении существенного бремени здравоохранения, вызванного плохо заживающими ранами. Плохо прогностические доклинические модели остаются значительным препятствием для разработки эффективных новых методов лечения.
Восстановление раны - это динамичный и многогранный процесс, включающий в себя разнообразный спектр типов клеток, бесчисленные уровни коммуникации и тканевую среду, которая временно реконструируется. Заживление кожи подкрепляется четырьмя основными репаративными стадиями: гемостаз, воспаление, пролиферация и ремоделирование матрицы. Эти стадии в конечном итоге действуют, чтобы предотвратить потерю крови и инфекцию, закрыть раневую поверхность (процесс, называемый реэпителизацией) и вернуть кожу в неповреженое состояние5. Хронические раны связаны с различной этиологией и широко распространенным возмущением процессов заживления6,что еще больше усложняет идентификацию терапевтических мишеней. Тем не менее, был разработан широкий спектр моделей для выяснения молекулярных и клеточных факторов патологии ран и тестирования новых терапевтических подходов7.
Наиболее используемой моделью восстановления ран является острое ранение у мыши. Мыши очень хорошо поддаются механистическим исследованиям и предоставляют проверенные модели старения и диабета8. Несмотря на общее сходство, показанное среди мышиного и человеческого исцеления, различия между видами в структуре кожи и динамике заживления сохраняются. Это означает, что большинство исследований мыщерий не так легко перевести в клинику9. Следовательно, произошел толчок к человеческим системам in vitro и ex vivo с высокой применимостью и переводимостью10,11.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения эксцизальных ран частичной толщины в ex vivo коже человека. Мы также описываем наш подход к окрашиванию всего крепления как высоко воспроизводимый метод оценки заживления кожи человека ex vivo. Показана траектория восстановления эпидермия (реэпителизации) и последующего формирования барьера, оценивая скорость закрытия раны у здоровой и диабетической кожи человека. Наконец, мы демонстрируем, как окрашивание цельного крепления может быть адаптировано для использования с целым рядом антител для оценки различных аспектов реакции на заживление.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Хронические незаживающие раны, которые в первую очередь поражают пожилых людей и диабетиков, являются значительной областью клинической неудовлетворенной потребности. К сожалению, современные методы лечения хронических ран являются неадекватными, в то время как имеющиеся доклинические модели плохо предсказывают клиническую эффективность новых методов лечения. Здесь мы описываем высокопроизводительную доклиническую модель для оценки нескольких аспектов реакции на восстановление кожи человека. Раны частичной толщины были созданы в коже человека ex vivo и культивированы в течение времени заживления. Биопсия раны кожи была собрана в фиксатор для процедуры окрашивания всего крепления. Фиксированные образцы блокировали и инкубировали в первичном антителе, причем обнаружение достигалось с помощью флуоресцентно конъюгированных вторичных антител. Раны были контрокрашиваемы и визуалированы с помощью конфокальной микроскопии перед расчетом процента закрытия раны (повторной эпителизации) в каждой биопсии. Применяя этот протокол, мы выявляем, что 2 мм эксцизионные раны, созданные в здоровой донорской коже, полностью повторно эпителизуются к 4-5 дню после ранения. Напротив, показатели закрытия диабетических ран кожи значительно снижаются, что сопровождается возмущенной барьерной реформацией. Сочетание ран кожи человека с новым подходом к окрашиванию цельным креплением позволяет быстро и воспроизводимо использовать метод количественной оценки восстановления ран ex vivo. В совокупности этот протокол предоставляет ценную человеческую платформу для оценки эффективности потенциальных методов лечения ран, трансформируя доклинические испытания и валидацию.

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Здесь мы демонстрируем оптимизированную технику оценки заживления ран с использованием кожи человека ex vivo в сочетании с подходом окрашивания целиком. Эта методология обеспечивает доклиническую платформу для оценки потенциальных методов лечения ран.

Модель раны человека Ex vivo и подход к окрашиванию цельного крепления для точной оценки восстановления кожи

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

В этой статье мы представляем оптимизированный протокол ран кожи человека ex vivo, который может предоставить важные данные об эффективности в рамках клинического трансляционного конвейера. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет высокопроизводительно точно оценить заживение ран в живой коже человека. Продемонстрировать процедуру будут Элизабет Робертс, постдокторант-исследователь, и Александрия Кидд, научный сотрудник нашей лаборатории.Чтобы подготовить образец кожной ткани к ране, поместите дерму кожи стороной вниз в 90-миллиметровую чашку Петри и используйте стерильные ножницы для удаления жировой ткани. Когда весь жир будет удален, поместите кожу в 25 миллилитров HBSS, дополненных антибиотиками, в течение 10 минут при комнатной температуре с прерывистым встряхиванием, чтобы удалить любую остаточную кровь в жировой ткани. Через 10 минут промойте кожу в 25 миллилитрах DPBS.Через 10 минут повторите полоскание HBSS без антибиотиков, а затем выполните окончательное полоскание в 25 миллилитрах DPBS. Затем поместите стерильную нейлоновую фильтрующей мембрану на блок абсорбирующей прокладки и высушите кожную сторону кожи на стерильной марле в 90-миллиметровой чашке Петри, чтобы удалить остаточные DPBS. Поместите высушенную кожу дермы стороной вниз на чистую 90-миллиметровую крышку чашки Петри, чтобы удалить остатки DPBS и смазать эпидермис свежей стерильной марлей.Чтобы создать рану, прижмите двухмиллиметровый биопсийный удар к коже, удерживая кожу плотно и осторожно скручивая. Используя изогнутые зубчатые тканевые щипцы, подберите каждую сторону раны диаметром примерно два миллиметра и зацепить изогнутые ножницы Ириса под рану. Используйте шестимиллиметровый биопсийный пунш для биопсии вокруг центральной двухмиллиметровой раны, чтобы создать шестимиллиметровую эксплант с частичной толщиной два миллиметра раны в центре.Затем поместите раневой эксплант эпидермиса стороной вверх на стек нейлоновой фильтрующей мембраны для одно-семидневной инкубации при 32-37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Для флуоресцентного окрашивания соберите раневые экспланты в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, содержащие 500 микролитров фиксатора кожи на трубку, и высиживьте экспланты на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующий день замените фиксатор на один миллилитр окрашивания промывного буфера.После промывки накройте каждый образец примерно 150 микролитрами блокирующего буфера и инкубируем в течение одного часа при комнатной температуре. После удаления блокирующего буфера добавьте 150 микролитров первичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере на трубку, и инкубируйте раневые экспланты на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующее утро промойте образцы 500 микролитрами окрашивающего буфера для стирки, содержащего 0,2% азида натрия, а затем три полоскания в обычном буфере для стирки.После промывки добавьте в каждую лунку 150 микролитров соответствующего флуоресцентно-конъюгированного вторичного антитела, разведенного в окрашивательном буфере для промывки для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промойте эксплант три раза в течение 30 минут в 500 микролитрах окрашивающего буфера для стирки на одну стирку, прежде чем противокрасить каждый эксплант 150 микролитрами DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, вымойте эксплант два раза в течение 30 минут с 500 микролитрами моечного буфера за одну стирку.Для эксплантной визуализации поместите 60-миллиметровую чашку Петри на платформу визуализации конфокального микроскопа и добавьте примерно один миллилитровый слой DPBS в тарелку. Используйте щипцы для переноса раневых эксплантов на блюдо. После настройки программного обеспечения для визуализации в соответствии с экспериментом, расположите рану в центре плоскости визуализации и получите изображения биопсии раны.Для выполнения беспроводной цифровой микроскопической визуализации для получения высококачественных изображений экономически эффективным способом подключите телефон или ноутбук к беспроводному цифровому микроскопу. Поместите экспланты, намотаные стороной вверх, на кусок лабораторной ткани и удалите из образца любой остаточный буфер промывки. Затем расположите эксплант в центре поля зрения микроскопа и получите изображения с помощью подключенной камеры.Иммунопероксидаза и иммунофлуоресценция могут быть использованы для окрашивания целых тканей mount. Кроме того, живое/ мертвое окрашивание может быть выполнено на свежих тканях и изображено до или после фиксации. Окрашивание ран целым креплением может быть использовано для определения скорости закрытия раны воспроизводимым способом.В этом репрезентативном анализе здоровое закрытие раны кожи наблюдалось через четыре-пять дней, в то время как диабетические раны кожи не смогли полностью закрыться в течение семидневного периода анализа. Экспрессия K14 достигла пика на второй день в здоровых ранах кожи, прежде чем быстро снизиться с увеличением эпидермальной дифференцировки. Эта реэпителизация и последующая эпидермальная дифференцировка были задержаны в диабетических ранах кожи.Реформирование раннего эпидермального барьера исключает проникновение антителА К14 в дифференцированные эпидермальные слои. В начале процесса реэпителизации кератиноциты K14 с положительным базальным слоем мигрируют внутрь над открытой раной, так что эпидермис ближе к внешнему краю раны образуется раньше, чем эпидермис ближе к внутреннему краю раны. Позже на этапе восстановления окрашивание K14 теряется, поскольку эпидермис дифференцируется от внешней внутрь.Окрашивание всего крепления также может быть использовано для изучения экспрессии и локализации других раневых соответствующих маркеров в коже, а также наличия иммунных клеток, представляющих интерес на участке раны на разных стадиях заживления. Создание воспроизводимых эксцизирующих ран может быть сложной задачей на первых порах. Мы бы посоветовали практиковать процедуру накрутки ран с использованием излишков кожи.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Создание клинически значимых<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мок хирургии катаракты модель для исследования Эпителиальный заживления раны в родной микроокружения

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Культивирование клеток эпителия сетчатки пигментного модель Ex Vivo мембраны Бруха возрасте человека на

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...