Name: human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Vi vill tacka Paolo Matteuci och George Smith för att de tillhandahåller patientvävnad. Vi är också tacksamma mot Miss Amber Rose Stafford för att ha hjälpt till med vävnadsuppsamling och Daisy Appeal för att tillhandahålla laboratorieanläggningar.

Mänsklig hud erhölls från patienter som genomgick rekonstruktiv kirurgi vid Castle Hill Hospital och Hull Royal Infirmary (Hull, Storbritannien) under fullständigt informerat, skriftligt patientgodkännande, institutionella riktlinjer och etiskt godkännande (LRECs: 17/SC/0220 och 19/NE/0150). Icke-diabetiker hud samlades in från patienter som genomgår rutinmässig kirurgi (medelålder = 68). Diabetiker huden valdes från givare som hade fastställt typ II diabetes och en historia av ulceration (medelåldern = 81). Prover från kirurgi transporterades i holding media och bearbetades omedelbart vid ankomsten till laboratoriet. Alla experimentella steg med unfixed mänskliga vävnad utfördes på Biosafety Level-2 (BSL-2) i en klass II laminar flöde biosäkerhet skåp.
1. Beredning av hudkulturmedel och färgreagenser
OBS: Alla reagens- och förbrukningsdetaljer finns i materialförteckningen. Se till att alla reagenser och all utrustning som används för bearbetning och odling av mänsklig vävnad är sterila. Sterilisera instrumenten före användning och dekontaminera med desinfektionsmedel efter kontakt med vävnaden. Dekontaminera avfallsprodukter i 1% desinfektionsmedel före deponering.
<ol><li>Holding media: Komplettera hög glukos Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 2 mM L-glutamin och 4% (v/v) antibiotisk-antimykotisk lösning.</li>
	<li>Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med antibiotika: Tillsätt 4% (v/v) antibiotisk-antimykotisk lösning till HBSS. Förvara vid 4 °C tills den används.</li>
	<li>Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS): Förbered DPBS genom att lösa upp 9,6 g DPBS-pulver per liter destillerat vatten (dH2O). Autoklav för sterilisering och förvaring vid 4 °C tills den används.</li>
	<li>Human hud tillväxt media: Komplettera hög glukos DMEM med 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) antibiotiska-antimycotic lösning och 10% (v/v) fetala nötkreatur serum. Förvara vid 4 °C tills den används.</li>
	<li>Hudfixativ: Tillsätt 40 ml formaldehydlösning, 10 ml glacial ättiksyra, 4,5 g natriumklorid och 0,25 g alkylmethylammoniumbromid till 450 ml 2O. Förvara i rumstemperatur (RT) och använd inom några dagar. VARNING: Fixeringsmedel är farliga (irriterande och brandfarliga). Hantera med försiktighet och kassera via en lämplig rutt.</li>
	<li>Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): Förbered PBS för helmonteringsfärgning genom att tillsätta 6 g natriumklorid till 100 ml fosfatbuffertlösning och 900 ml dH2O.</li>
	<li>Färgningstvättbuffert: Lös upp 0,5% (v/v) Triton X-100 i PBS.</li>
	<li>Blockerande buffert: Tillsätt 0,2% (w/v) natriumazid och 2% (v/v) djurserum till färgningstvättbufferten. Förvara vid 4 °C i upp till två veckor. OBS: Blockera i serumet hos den sekundära antikroppsvärdarten. Natriumazid kommer att förhindra bakterietillväxt under inkubation.</li>
	<li>DAPI arbetslösning: Förbered ett 5 mg/ml bestånd av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i dimetylsulfoxid. Späd ut beståndet 1:1 000 i färgningstvättbuffert för att ge en 5 μg/mL DAPI arbetslösning.</li>
	<li>Peroxidasblock: Tillsätt 0,3% (v/v) väteperoxid till färgningstvättbufferten. Förvara vid 4 °C tills den används. Håll dig i mörkret för att förhindra nedbrytning.</li>
	<li>ABC-HRP-kit:<ol>
<li>HRP-konjugerad sekundär antikropp: 1 droppe biotinylerad kanin antiget IgG i 5 ml färgbuffert. Förvara vid 4 °C i upp till två veckor. OBS: Det kit/den sekundära som används beror på värdarterna för den primära antikroppen.</li>
		<li>Avidin-biotinkomplex (ABC) reagens: 2 droppar reagens A och 2 droppar reagens B i 5 ml färgningstvättbuffert. ABC-reagenset ska beredas minst 30 minuter före användning. Förvara vid 4 °C i upp till två veckor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peroxidassubstrat: 3 droppar reagens 1, 2 droppar reagens 2, 2 droppar reagens 3 och 2 droppar väteperoxid i 5 ml dH2O. Peroxidassubstratet ska beredas omedelbart före användning och kan inte lagras.</li>
</ol>2. Förberedelse av huden för sår
OBS: Dessa steg bör utföras i ett laminärt flödesbiosäkerhetsskåp av klass II.
<ol><li>Samla huden i holdingmedia och transportera till BSL-2 skåpet.</li>
	<li>Placera hudens huddermissida nedåt i en 90 mm steril Petri-skål och ta bort fettvävnaden med steril sax.</li>
	<li>Placera huden i ett 50 ml-rör som innehåller 25 ml HBSS med antibiotika i 10 minuter vid RT. Skaka intermittent för att avlägsna eventuellt kvarvarande blod och fettvävnad.</li>
	<li>Upprepa steg 2.3 med ett nytt 50 ml-rör.</li>
	<li>Placera huden i ett färskt 50 ml-rör som innehåller 25 ml HBSS, denna gång utan antibiotika i 10 minuter på RT. Skaka som i steg 2.3.</li>
	<li>Utför en slutlig hudsköljning genom att placera huden i ett nytt rör med 25 ml DPBS. Huden är nu redo att såra.</li>
</ol>3. Skapa ex vivo mänskliga hudsår
OBS: Dessa steg bör utföras i ett laminärt flödesbiosäkerhetsskåp av klass II.
<ol><li>Förbered hudkulturerna före sårning. Stapla två sterila absorberande kuddar i en 60 mm Petri-skål och tillsätt 4 ml människohudsmedia via sidan av skålen. Placera ett sterilt nylonfiltermembran på den absorberande dynan. OBS: Hudmedier kan ändras beroende på vilka behandlingsförhållanden som krävs. Upp till tre sår explanter kan odlas på varje stack.</li>
	<li>Torka hudens hudsida på steril gasväv i en 90 mm Petri-skål för att ta bort kvarvarande DPBS. OBS: Detta förhindrar att huden glider runt vid sårning.</li>
	<li>Placera hudens huddermissida nedåt på ett rent 90 mm Petri-lock och doppa epidermisen torr med färsk steril gasväv. OBS: Det är lättare att såra huden i ett petriskålslock än basen. Efterföljande arbete bör utföras snabbt för att förhindra att huden torkar ut.</li>
	<li>Håll huden spänd, tryck en 2 mm biopsi stans mot huden och vrid försiktigt. Slå inte helt genom huden. OBS: Partiella tjocklekssår är utformade för att stansa genom epidermis och delvis in i dermis. Det kan finnas variabilitet mellan givare och plats till plats i den kraft som krävs för att skapa det partiella tjocklekssåret.</li>
	<li>Använd böjda tandade vävnadstång för att plocka upp varje sida av 2 mm-såret och kroka böjd irissax under 2 mm-såret för att skära ut det jämnt.</li>
	<li>Biopsi runt det centrala 2 mm såret med en 6 mm biopsi stans för att skapa en 6 mm explant med en partiell tjocklek 2 mm sår i mitten. OBS: En 6 mm biopsi stans kan användas för att poängskinna för att markera var varje 2 mm sår ska vara. Var försiktig så att du inte genomborrar vävnaden helt. Skapa sårexplanter i ett bikakemönster för att minska slöseriet.</li>
	<li>Placera sårexplanter epidermis sida upp på nylonfiltermembranstacken (beredd i steg 3.1). OBS: Var försiktig så att inte det centrala såret skadas vid hantering av sårutplanter. Använd små tångar och plocka upp varje explant på motsatta sidor.</li>
	<li>Inkubera sår vid 32-37 °C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär (90-95%) i 1-7 dagar. Byt ut mediet var 2-3:e dag.</li>
</ol>4. Helmonteringsfärgning av ex vivo-sår
OBS: Detta avsnitt beskriver immunofluorescens och immunoperoxidase färgning metoder. Blanda alla reagenser i god tid före användning.
<ol><li>Fluorescerande färgningsmetod<ol>
<li>Samla sårexplanter i 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 500 μL hudfixerande och inkubera vid 4 °C över natten. OBS: Det fixativ som används i detta protokoll fungerar bra för de beskrivna antikropparna. Optimering kommer att krävas för andra antikroppar. Vävnadsfixering längre än 24 timmar kan leda till överfixering.</li>
		<li>Följande dag ta bort fixeringen och ersätt med 1 ml färgningstvättbuffert. Tarmbiopsier kan förvaras i färgningstvättbuffert vid 4 °C upp till 2 veckor före färgning. OBS: För alla tvättbuffertsteg, använd en serologisk pipett eller pipettspets, var försiktig så att såret inte skadas.</li>
		<li>Aspirera färgningstvättbufferten och utför ytterligare en sköljning med 1 ml färgningstvättbuffert.</li>
		<li>Beräkna mängden blockeringsbuffert som krävs för steg 4.1.5-4.1.6 (antal prover x 300 μL = mängden blockeringsbuffert i μL). Gör extra buffert om det behövs.</li>
		<li>Tillsätt 150 μL blockeringsbuffert till varje prov och inkubera i 1 timme vid RT. För alla färgningssteg, se till att varje prov är tillräckligt täckt och att det inte finns några bubblor som täcker biopsiskadans yta. OBS: Detta steg framåt kan utföras i 1,5 ml mikrocentrifugrör eller i en 48 brunnsplatta. Om du använder en 48 brunnsplatta, inkubera såren med ansiktet nedåt i varje brunn.</li>
		<li>Späd ut den primära antikroppen i den återstående blockeringsbufferten. OBS: Antimus keratin 14 (K14) utspädd 1:1,000 i blockerande buffert fungerar bra. Optimera det här steget för användning med andra antikroppar eller flera sonder.</li>
		<li>Aspirera blockeringsbufferten och tillsätt 150 μL primär antikropp per brunn/mikrocentrifugrör. Inkubera sår explanter i primära antikroppar vid 4 °C över natten.</li>
		<li>Nästa dag aspirera den primära antikroppen och skölj i färgningstvättbuffert som innehåller 0,2% natriumazid i 1 timme vid RT (500 μL per prov).</li>
		<li>Utför ytterligare tre sköljsteg med färgningstvättbuffert (30 min per tvätt, 500 μL per prov).</li>
		<li>Späd fluorescerande konjugerad sekundär antikropp vid färgningstvättbuffert (t.ex. getantimus 488 vid 1:400 utspädning).</li>
		<li>Beräkna den önskade mängden sekundär antikropp (antal prover x 150 μL = mängd i μL).</li>
		<li>Tillsätt 150 μL sekundär antikropp till varje brunn/mikrocentrifugrör. Inkubera i 1 timme vid RT. Utför inkubationssteg 4.1.10 - 4.1.16 i mörker eftersom den sekundära antikroppen är ljuskänslig. OBS: Detta steg kan utföras vid 4 °C över natten vid behov. Optimera koncentrationen av sekundär antikropp som krävs för adekvat signal och begränsad bakgrundsfärgning.</li>
		<li>Ta bort den sekundära antikroppen och utför sköljningar på 3 x 30 minuter med färgningstvättbuffert (500 μL per prov).</li>
		<li>Kassera den överblivna tvättbufferten och beräkna den mängd DAPI-arbetslösning som krävs (enligt steg 4.1.11).</li>
		<li>Kontrahåll varje explant med 150 μL DAPI-arbetslösning i 10 minuter på RT. DAPI färgar cellkärnorna blå. Hoechst färgämne kan användas som ett alternativ till DAPI.</li>
		<li>Utför två sista 30 min tvättar med färgningstvättbuffert (500 μL per prov). Tarmbiopsier kan förvaras i färgningstvättbuffert vid 4 °C i mörker upp till två veckor före avbildning.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield färgning metod.<ol>
<li>Utför steg 4.1.1 - 4.1.3.</li>
		<li>Släcker endogen peroxidasaktivitet med peroxidasblock vid 4 °C över natten. OBS: Detta steg är viktigt när du använder en HRP-konjugerad antikropp för att minska icke-specifik bakgrundsfärgning från vävnaden. Mycket vaskulär vävnad kommer att innehålla mer endogen peroxidas aktivitet.</li>
		<li>Kassera peroxidasblocket och skölj två gånger i 30 minuter i färgningstvättbufferten.</li>
		<li>Utför steg 4.1.4 - 4.1.8. OBS: Tvättar efter steg 4.1.7 är särskilt viktiga för att avlägsna natriumazid från proverna. Om natriumaziden inte avlägsnas tillräckligt kommer den att inaktivera HRP och störa färgningsdetektionen.</li>
		<li>Tillsätt 150 μL HRP-konjugerad sekundär antikropp till varje brunn/mikrocentrifugrör och inkubera över natten vid 4 °C eller 1 timme vid RT.</li>
		<li>Ta bort den sekundära antikroppen och utför 3 x 30 min tvättar i färgningstvättbufferten.</li>
		<li>Tillsätt 150 μL ABC-reagens till varje brunn/mikrocentrifugrör och inkubera över natten vid 4 °C eller 1 timme vid RT.</li>
		<li>Aspirera ABC-reagenset och utför 3 x 30 min tvättar i färgningstvättbuffert.</li>
		<li>Tillsätt 150 μL peroxidassubstrat till en explant och bestäm den tid som krävs för att upptäcka en märkbar färgförändring. OBS: Välj ett prov där stark färgning förväntas. I det här fallet en röd ring för att visa den migrerande epidermis (K14). 3,3'-diaminobenzidine-4, eller något annat lämpligt kromogent substrat, får användas som ersättning för detta peroxidassubstrat.</li>
		<li>När en färgförändring har observerats, ta bort peroxidassubstratet och ersätt med 1 ml dH2O.</li>
		<li>Upprepa peroxidassubstratdetektionen för de andra explanterna och inkubera under den tid som fastställs i steg 4.2.11.</li>
		<li>Skölj alla explanter med 1 ml dH2O för att avlägsna restperoxidassubstrat. Även om explanter kan lagras upp till en vecka vid 4 °C före avbildning, är det bättre att avbilda dem så snart som möjligt för att förhindra utlakning av peroxidassubstratet i dH2O över tiden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bildbehandling och kvantifiering
<ol><li>Fluorescerande avbildning OBS: Fluorescerande avbildning utförs med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop. Ett inverterat fluorescerande mikroskop kan dock vara tillräckligt för att förvärva 2D-bilder för att kvantifiera sårstängningshastigheter. Vid val av sekundära antikroppar, se till att de valda fluorokromerna är kompatibla med excitations- och emissionsspektrat hos den tillgängliga mikroskopiutrustningen.<ol>
<li>Använd ett konfokalt laserskanningsmikroskop utrustat med en 2,5x, 10x och 20x objektiv, x-y-z motoriserad scen, digitalkamera och förvärvsprogram. Slå på den överförda ljusdetektorn (TPMT) för att möjliggöra enkel visualisering av varje biopsi och för att möjliggöra mätning av total sårförslutning. Alternativt kan du mäta varje sår via brightfield mikroskopi efter fluorescens imaging.</li>
		<li>Placera en 60 mm Petri-skålbas på bildplattformen och tillsätt ett tunt lager (cirka 1 ml) DPBS. OBS: Om för mycket DPBS används kommer biopsin att röra sig under avbildningen. Alternativt kan du använda en 48 brunnsplatta om en plåthållare finns tillgänglig.</li>
		<li>Använd små vävnadstängar för att överföra sårexplanter från brunnar/mikrocentrifugrör till Petri-skålen som innehåller DPBS. Lägg biopsin lindad sida ner i Petri skålen.</li>
		<li>Använd okularet och lysrörslampan för att lokalisera och fokusera på såret. Om bubblor fastnar under provet inom synfältet, plocka upp såret med vävnadstång och flytta.</li>
		<li>Ställ in bildframställningsprogrammet, vilket säkerställer lika pinhole-storlek mellan kanalerna för optimal konokalitet. Kontrollera därför värdet på en luftig enhet för varje kanal och välj det största värdet. Välj skanningshastighet, bildkvalitet och genomsnitt. OBS: Fluorokromerna hos de konjugerade sekundära antikropparna och den valda motstecknen (t.ex. DAPI) kommer att diktera de kanaler som krävs.</li>
		<li>Slå på liveförvärvsprogramvaran och justera lasereffekten och förstärkningen för varje kanal till de nivåer som krävs för att visualisera färgning. Minska bakgrundsbruset genom att öka den digitala förskjutningen.</li>
		<li>Placera såret i mitten av bildplanet. OBS: Om såret inte fyller hela bilden på grund av att det använder ett mindre mål eller skapar ett större sår, ta en panel med bilder och sy ihop dem (manuellt eller med en plattsättningsfunktion i relevant bildprogramvara).</li>
		<li>Skaffa bilder av sårbiopsierna. Använd samma avbildningsinställningar mellan explanter. OBS: Bilder med högre effekt möjliggör bedömning av vävnadsstrukturer och cellulära marköruttryck och placering.</li>
		<li>Samla seriella Z staplar genom såret, särskilt där vävnaden inte är helt platt mot Petri-skålen. Använd analysprogramvara för att komprimera Z-stacken till en enda maximal intensitetprojektionsbild.</li>
	</ol></li>
	<li>Brightfield imaging OBS: Brightfield imaging av immunoperoxidas färgade tarmbiopsier kan utföras på flera sätt.<ol>
<li>Inverterad mikroskopavbildning: Förbered sårexplanter för avbildning genom att placera dem i en petriskål/brunn enligt beskrivningen i steg 5.1.2-5.1.3. Skaffa digitala bilder under ljusfältsbelysning på ett inverterat mikroskop utrustat med en digitalkamera. Sy ihop flera bilder om det behövs.</li>
		<li>Trådlös digital mikroskopavbildning: Använd ett trådlöst digitalt mikroskop som är anslutet till en telefon eller bärbar dator för att få högkvalitativa bilder på ett kostnadseffektivt sätt. Placera explanter lindade sida upp på någon vävnad och ta bort eventuella kvarvarande dH2O (eller färgning tvättbuffert) från provlagring. Placera såret explant i mitten av mikroskopets synfält. Hämta bilder med den anslutna kameran.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifiering OBS: Procentuell sårförslutning kan kvantifieras i alla program som gör att frihandsformer kan ritas och mätas. ImageJ kan användas för att utföra kvantifiering enligt följande:<ol>
<li>Öppna bilden som ska kvantifieras i ImageJ-programvaran.</li>
		<li>Använd frihandsformverktyget för att rita runt utsidan av det om epitelialiserade såret där det möter den normala huden. Tryck på M (eller analysera | Åtgärd) för att förvärva en "yttre" områdesmätning. OBS: Den re-epitelialiserade sårvävnadsstrukturen skiljer sig från normal hud. Bilderna behöver inte skalas före den här typen av analys.</li>
		<li>Använd frihandsformverktyget för att rita runt det öppna sårområdet. Det är här det öppna såret möter insidan av den åter epitelialiserande vävnaden. Tryck på M (eller analysera | Åtgärd) för att förvärva en "inre" områdesmätning.</li>
		<li>Använd följande ekvation för att härleda procentuell sårförstärkning/stängning: % stängning = (yttre sårområde - inre sårområde) / (yttre sårområde) x 100 OBS: Procentuell areala täckning av antikroppar kan härledas på samma sätt (t.ex. K14) eller i procent av den totala sårarealen. Procentuell intensitet kan också ge semikvantitativ information om vävnadsnivåuttryck av markörer av intresse, medan hög effektavbildning presenterar uttrycksdata på cellnivå.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+management+for+the+21st+century:+combining+effectiveness+and+efficiency.">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li><li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK's+National+Health+Service.">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK:+costs+and+outcomes.">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li><li>L&#243;pez-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation.">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair.">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds.">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes.">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modeling+conundrum:+murine+models+for+cutaneous+wound+healing.">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature.">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model.">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2.">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li><li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+(CC+motif)+ligands+17+and+22.">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li><li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis.">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).</li><li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models.">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li><li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+excisional+wound:+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies.">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li><li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds:+a+systematic+review.">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li><li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin:+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy.">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li><li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing.">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li><li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin.">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system.">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).</li><li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8++T+cells+in+human+skin.">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture.">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+immunocompetent+3D+skin+models.">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405 (2018).</li><li>Ata&#231;, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+and+hair+on-a-chip:+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion.">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale,+full-thickness,+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments.">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li><li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model.">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance.">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li><li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro.">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li><li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+senescence:+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing.">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li><li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin.">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li><li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin:+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function.">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

I detta experimentella protokoll beskriver vi en optimerad metod för att utvärdera sår stängning i mänskliga ex vivo huden med hjälp av hela mount vävnad färgning. Detta är en viktig resurs för att möjliggöra kritisk utvärdering av potentiella sårbehandlingar och för att ge bättre förståelse för det mänskliga sårreparationssvaret. Vi har publicerat helande bedömning i ex vivo hud sår tidigare12,13, men i dessa rapporter hela montering färgning strategi användes inte för att mäta sår stängning. Helmonteringsfärgning är mycket enklare och kräver mindre teknisk erfarenhet än standard histologi, vilket innebär paraffin eller OCT inbäddning och sektionering av prover. Hela monteringsförfarandet minskar också experimentell variabilitet, vilket möjliggör kvantifiering av hela såret och inte bara ett enda tvärgående avsnitt vid en definierad position i vävnaden (se figur 4B för jämförande illustration). Vi stöder fullt ut vikten av att kvantifiera läkning av hela den icke-symmetriska sårstrukturen, som tydligt skisseras av Rhea och Dunnwald för murin akuta sår14. Dessa författare visade vikten av seriellt dela in vivo excisional sår för reproducerbara och exakta mätningar av sår morfologi. Seriell sektionering kan också tillämpas på mänskliga ex vivo sår; För noggrann kvantifiering av sår stängning och re-epitelialization, hög genomströmning hela-mount färgning bör dock vara den föredragna metoden. Vi noterar att detta helt monteringsfärgningsprotokoll också bör vara kompatibelt med efterföljande bearbetning (vax eller OKT) för traditionell histologisk analys.
Helmonteringsfärgning är inte utan nackdelar. Även om det ger högre reproducerbarhet i sårläkningsexperiment, kräver det användning av mer vävnad för analys än vanliga histologiska tekniker. Detta kan vara ett problem där tillgången till vävnad är begränsad, särskilt när flera antikroppar behöver bedömas. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att använda en incisional sårmetod där sårbredden är relativt enhetlig och variabiliteten minskar (som visas i mus- och människosår15,16). Excisional sår är dock fortfarande mer tillämpliga på de flesta patologiska sårtyper17.
I denna studie skapades 2 mm partiella tjocklek sår inom mitten av 6 mm huden explanter. Denna metod kan optimeras för alternativa excisional sår och explant storlekar på olika huddjup18. Dessutom kommer kraften som krävs för att generera sår att variera mellan givare, där åldrad hud kommer att kräva mindre kraft till biopsi. Vi skulle också undvika att använda huden som visar framträdande bristningar eller andra strukturella förändringar. Vi har validerat en rad antikroppar för att överväga olika aspekter av ex vivo helande svar. Detta protokoll kan också användas med andra hudrelevanta antikroppar, där antikroppskoncentrationer och inkubationstider måste optimeras. Vi anser dock att vårt protokoll är mest lämpat för absolut kvantifiering av total sårstängning, följt av rumslig bedömning av specifika proteiner av intresse. Medan hela fäste ger minskad upplösning av immunolokalisering kontra standard histologisk analys av vävnad avsnitt, Det ger ytterligare 3D information som saknas i standard 2D histologi.
En varning för att bedöma läkning i ex vivo hud kontra in vivo modeller är att det saknar ett systemiskt svar. En viktig aspekt av sårreparation är inflammation och efterföljande vävnadsgranulering, som orsakas av en tillströmning av inflammatoriska celler och endotelceller från vaskulaturen19. Trots denna begränsning, ex vivo huden ger fortfarande en bättre rekapitulering av klinisk läkning än cellbaserade sår analyser. In vitro-experiment i allmänhet involverar monoskikt av en celltyp eller samkulturer som odlas på vävnadskulturplast, medan ex vivo-hud ger en inbyggd miljö för att utforska cellbeteende. På senare tid har ett antal hudekvivalenter dykt upp, där huden odlas i laboratoriemiljö från konstgjord matris och isoleradehudceller 20,21. Även om dessa modeller efterliknar mänsklig hud bättre än de flesta in vitro-metoder, simulerar de fortfarande inte helt den inhemska vävnadsmiljön och är i allmänhet för bräckliga för att skada reproducerbart. Dessutom har vi (och andra) visat att ex vivo mänsklig hudvävnad behåller bosatta immunceller, vilket utan tvekan kommer att bidra till reparation22,23. Det framtida arbetet bör nu inriktas på att utvidga lönsamheten och immunkompetensen hos ex vivo-modellen för bedömning av läkning i sent skede24. Ett alternativ är ytterligare framsteg av lovande organ-på-ett-chip-teknik som kan förlänga vävnadens livskraft och upprätthålla inhemsk hudarkitektur i upp till två veckor i kultur25. Ex vivo-modeller har också börjat överväga vikten av hudens inflammatoriska svar genom att framgångsrikt införliva immunceller, såsom neutrofiler, ivärdvävnaden 26 eller injicera värdvävnad med antikroppar för att framkalla en immunreaktion27. Vi förväntar oss att dessa resultat kommer att bana väg för utveckling av mer raffinerade och översättningsbara metoder i framtiden.
En stor fördel med att använda ex vivo hud för att mäta sårförslutning är förmågan att jämföra läkningshastigheter i friska (t.ex. icke-diabetiker) jämfört med patologisk (t.ex. diabetiker eller åldrad) vävnad. Här visade vi att re-epitelialization och barriär bildandet är verkligen nedsatt i diabetiker kontra friska ex vivo sår. Detta ger i själva sidan en väg för preklinisk bedömning av patologisk reparation, där åldrande och diabetes är viktiga riskfaktorer för att utveckla kroniska sår1. Medan in vitro patologiska modeller finns, såsom celler isolerade från åldrad och diabetiker vävnad, eller celler odlade i hög glukos för att efterlikna hyperglykemi28,29, dessa celler kan snabbt förlora sin fenotyp en gång bort från in vivo mikromiljö. En viktig komponent i den extrinsiska patologiska helande miljön är dermal matrisen, som ändras i både åldrande och diabetes30. Faktum är att denna störd matris påverkar beteendet hos bosatta och naiva fibroblaster31,32. Vikten av att studera celler i värdvävnadsmiljön kan därför inte underskattas.
Sammanfattningsvis ger vårt protokoll en viktig plattform för att kvantifiera återepthelialisering av mänskliga sår, utforska regulatoriska faktorer och testa giltigheten och effekten av potentiella terapier12,13. Medan prekliniska tester fortfarande kräver in vivo-metoder, bör en kombinerad strategi med hjälp av ex vivo mänsklig vävnad och in vivo murin sårning förfina den prekliniska vägen, minska djuranvändning samtidigt öka tvärgående översättbarhet.

Kroniska, icke-helande sår, som är mycket utbredda hos äldre och diabetiker, är ett mycket ouppskattat område av kliniska ouppfyllda behov. Dessa sår utgör en stor fysisk och psykisk börda för patienter och kostar vårdgivare miljarder varje år att behandla1. Trots förbättrad förståelse för sårbiologi och tekniska framsteg misslyckas upp till 40% av kroniska sår fortfarande att läka efter bästa standardvård2. Således kräver 14-26% av patienterna med diabetiker fotsår därefter amputation3, medan 5-årig dödlighet efter amputation ligger på cirka 70%4. Som ett resultat finns det ett brådskande krav på att utveckla effektiva nya terapier för att förbättra patientens livskvalitet samtidigt som den betydande sjukvårdsbördan som läggs på grund av dåliga helande sår minskar. Dåligt prediktiva prekliniska modeller är fortfarande ett betydande hinder för utvecklingen av effektiva nya terapier.
Sårreparation är en dynamisk och mångfacetterad process som involverar ett varierat utbud av celltyper, otaliga kommunikationsnivåer och en vävnadsmiljö som är tidsmässigt ombyggd. Huden helande stöds av fyra stora reparativa stadier: hemostas, inflammation, spridning och matris ombyggnad. Dessa steg verkar slutligen för att förhindra blodförlust och infektion, stänga sårytan (en process som kallas om epitelialisering) och återföra huden till ett oskadat tillstånd5. Kroniska sår är associerade med olika etiologi och utbredd oro för läkningsprocesser6, vilket ytterligare komplicerar identifieringen av terapeutiska mål. Ändå har ett brett utbud av modeller utvecklats för att både belysa de molekylära och cellulära drivkrafterna för sårpatologi och testa nya terapeutiska metoder7.
Den mest använda sårreparationsmodellen är akut sårning i musen. Möss är mycket lätthanterliga för mekanistiska studier och ger validerade modeller av åldrande och diabetes8. Trots de allmänna likheterna mellan mus och mänsklig läkning kvarstår skillnader mellan arter i hudstruktur och helande dynamik. Detta innebär att de flesta murin sår forskning inte lätt översättas tillkliniken 9. Följaktligen har det skett en push mot mänskliga in vitro- och ex vivo-system med hög tillämplighet och översättning10,11.
Här tillhandahåller vi ett djupgående protokoll för att utföra partiell tjocklek excisional sår i ex vivo mänskliga huden. Vi beskriver också vår helhetsfärgning som en mycket reproducerbar metod för att utvärdera ex vivo mänsklig hudläkning. Vi visar banan för epidermal reparation (re-epitelialization) och efterföljande barriärbildning, utvärderar takten av sår stängning i friska kontra diabetiker mänskliga huden. Slutligen visar vi hur helmonterad färgning kan anpassas för användning med en rad antikroppar för att bedöma olika aspekter av det helande svaret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>For skin washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1615-5510</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well CytoOne Plate, TC-Treated</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-7548</td>
			<td>For whole-mount staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0400/PB15</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyltrimethylammonium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7635</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td>Stains blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Stains collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1A Antibody (CTB6)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5265</td>
			<td>Stains Langerhans cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Counterstain for cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Antibody (EP5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8422</td>
			<td>Stains fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F/1501/PB17</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Swabs</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>CS1650</td>
			<td>To clean skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960044</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170088</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td>For viability assessment of tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15917</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501264</td>
			<td>To create wounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501263</td>
			<td>To remove adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905201</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905301</td>
			<td>Stains epidermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>For fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Absorbent pads</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>HNWP04700</td>
			<td>Human ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>Animal serum used depends on secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>Part of fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilisation Pouches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>SH3710</td>
			<td>To sterilise instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 2mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI0500</td>
			<td>For partial thickness wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stiefel 6mm biopsy punches</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>BI2000</td>
			<td>For outer explant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>To prepare skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T/3751/08</td>
			<td>For wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101</td>
			<td>For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4800</td>
			<td>For immunoperoxidase staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wireless Digital Microscope</td>
			<td>Jiusion</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brightfield imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human ex vivo wound model and whole-mount staining approach to accurately evaluate skin repair

Kroniska icke-helande sår, som främst påverkar äldre och diabetiker, är ett betydande område med kliniskt ouppfyllt behov. Tyvärr är nuvarande kroniska sårbehandlingar otillräckliga, medan tillgängliga prekliniska modeller dåligt förutsäger den kliniska effekten av nya terapier. Här beskriver vi en hög genomströmning, preklinisk modell för att bedöma flera aspekter av den mänskliga huden reparation svar. Partiell tjocklek sår skapades i mänskliga ex vivo hud och odlas över en helande tid kurs. Huden sår tarmbiopsier samlades in fixativ för hela montering färgning förfarande. Fasta prover blockerades och inkuberades i primär antikropp, med detektion uppnås via fluorescerande konjugerad sekundär antikropp. Sår var motstained och avbildas via confocal mikroskopi innan beräkna procentuella sår stängning (re-epithelialization) i varje biopsi. Tillämpa detta protokoll, vi avslöjar att 2 mm excisional sår som skapats i friska givaren huden är helt re-epithelialized av dag 4-5 post-wounding. Tvärtom minskar stängningsgraden för diabetiker hudsår avsevärt, åtföljd av störd barriärreformation. Genom att kombinera mänsklig hudsår med en ny helmonterad färgning kan en snabb och reproducerbar metod kvantifiera ex vivo sårreparation. Sammantaget ger detta protokoll en värdefull mänsklig plattform för att utvärdera effektiviteten av potentiella sårbehandlingar, omvandla preklinisk testning och validering.

I denna rapport presenterar vi en ny ex vivo hud sårning och hela mount färgning strategi för att bedöma faktorer som påverkar den mänskliga huden reparation svar. Figur 1A visar ett schema över den processuella rörledningen, som kan utföras på 3-10 dagar, beroende på sårinkubationstider. De partiella tjocklekssåren odlas på membranstackar i luften: membrangränssnitt och kan samlas in för helmonteringsfärgning, inbäddad i paraffin eller OCT-medium för allmän histologi eller fryses i flytande kväve för biokemisk analys (Figur 1B). Vi skapar i allmänhet 2 mm partiella tjocklek sår i mitten av 6 mm explanter. Sårets storlek och omgivande explant kan dock ändras beroende på kraven. Hela monteringsproceduren har framgångsrikt anpassats för både immunoperoxidas och immunofluorescensfärgningsmetoder(figur 1C).
Immunofluorescens möjliggör sondering av vävnad med flera antikroppar. För detta rekommenderar vi att du använder primära antikroppar som är uppvuxna i olika arter och artmatchade fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar för att begränsa reaktivitet mellan arter. Antikroppskoncentrationer och inkubationstider måste optimeras. Om bakgrundsfärgning observeras, minska antikroppskoncentrationerna, öka tvättstegen och lägg till blockeringsbuffert till den sekundära antikroppen. Färskvävnads livskraft kan bedömas direkt med kommersiella livsduglighetsfärgämnen (se Materialförteckning ). Vi visar också att vävnad kan vara fast efter viabilitet färgning och framgångsrikt avbildas när det är praktiskt lämpligt(figur 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figur 1:Den mänskliga ex vivo-sårningen och hela färgade metoden. (A) Pipeline som visar det procedurmässiga arbetsflödet från att samla in hud och utföra ex vivo-sår, till färgning av vävnad och analys av data. b)Diagram som visar det humana hudsårskultursystemet med analyser som rutinmässigt utförs på vävnaden. (C) Helmonteringsfärgning kan användas med både immunoperoxidas och immunofluorescenstekniker. K14 = keratin 14. D)Levande vävnad kan färgas med kommersiella livsduglighet färgämnen och avbildas framgångsrikt efter fixering. Stapel = 100 μm. Denna färgning utfördes i icke-diabetiker huden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Den mest tillämpliga användningen för helmonteringsfärgning av sår är att bestämma sårförslutningshastigheten på ett mer reproducerbart sätt än vad som kan tillhandahållas via histologisk sektionering. Den procentuella stängningen kvantifierades som en procentuell om epitelialisering av sårytan, vilket framgår av figur 2A. Procentuell arealertäckning för specifika markörer kan mätas från den totala sårytan eller i procent av det om epitelialiserade såret. Vi karakteriserade helande i friska (icke-diabetiker) kontra diabetiker hud över en tidskurs av sju dagar, samla sår vid varje dag efter sådd (representativa bilder, figur 2B). Friska hudsår stängdes över tid som förväntat, med fullständig stängning observerad i de flesta prover dag 4-5. Tvärtom kunde diabetiker hudsåren inte helt stängas inom den sju dagar långa analysperioden (figur 2C). En betydande försening i sår stängning observerades mellan friska och diabetiker huden sår när jämföra läkning priser vid varje tidpunkt efter skada(P < 0,001 till dag 6, P < 0,05 vid dag 6 och P < 0,05 till P < 0,001 vid dag 7).
Efter bedömning av de totala sårstängningsfrekvenserna. Vi mätte procentandelen av hela sårområdet (yttre område i figur 2A)där K14-positiva celler kunde visualiseras (grön färgning i figur 2B). Intressant nog observerade vi att i friska ex vivo hud sår, K14 färgning toppade på dag 2 och sedan snabbt minskade (betydelse vid varje tidpunkt jämfört med dag 2 topp, figur 2D). Detta återspeglar sannolikt ombildningen av den tidiga epidermala barriären, med undantag för K14-antikroppspenetration genom differentierade epidermala skikt (se figur 2E schematisk). Under om epitelialiseringsprocessen migrerar basala skikt (K14+ve) keratinocyter inåt över det öppna såret så att epidermis närmare den yttre sårkanten bildas tidigare än epidermis närmare den inre sårkanten (migrerande fram). Medan framkanten av den nybildade epidermis fortsätter att migrera för att stänga det återstående öppna såret, börjar ytterkanten epidermis att differentiera för att reformera de andra epidermala lagren. I tidig läkning skulle vi således förvänta oss att se de flesta av de om epitelialiserade området består av basala (K14 +ve) celler, medan senare reparation K14 färgning går förlorad som epidermis skiljer sig från utsidan inåt (se helmonterade bilder i figur 2E). Minskningen av K14-färgningen i figur 2D (nedåtpilar) korrelerar därför med ökad epidermal differentiering. Intressant nog toppade synlig K14-färgning tidigare i friska (dag 2) jämfört med diabetiker (dag 4) sår, vilket ytterligare visar att om epitelialisering och efterföljande epidermal differentiering är försenade i diabetiker hud sår.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figur 2:Helmonterad färgning visar störda läkningshastigheter i diabetiker kontra frisk hud. Brightfield bilder visar keratin 14 (K14) färgning i rött. Bar = 300 μm. (B) Representativa bilder av läkning över tid (dag efter sårning) i frisk och diabetiker hud. Bar = 500 μm. K14 = grön. DAPI = blå atomkärnor. C)Kvantifiering av sårförslutningshastigheter (procentuell omstoexiellisering) som visar att ex vivo-sår från frisk hud stängs betydligt snabbare än ex vivo-sår från diabetiker. H = frisk. Db = diabetiker. (D) Procent K14 färgning toppar tidigare i friska kontra diabetiker huden och sedan minskar i linje med ökad epidermal differentiering (nedåtpilar). (E) K14 (basal epidermal cell) färgning går förlorad som epidermis skiljer. D = differentierad. ND = inte differentierad. Vita prickade linjer visar inre och yttre sårkanter. Vita pilar = migreringsriktning. n = 6 sår per donator, per tidpunkt. Medelvärde +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 och *** = P < 0,001. Friska och diabetiker jämfört vid varje helande tidpunkt i C (P-värde för minst signifikant jämförelse). Temporal förändring i K14 färgning jämfört med topp för varje givare i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Vi använde sedan helmonterad färgning för att utforska vävnadsuttryck och lokalisering av andra sårrelevanta markörer i icke-diabetiker hud (Figur 3). Alla antikroppar som används och deras arbetskoncentrationer finns i materialförteckningen. Blodkärl i det öppna såret färgade positivt med alfaslät muskelaktinantikropp (a-SMA), som används i kombination med K14 för att avgränsa epidermala kanter i bilder med lägre effekt (Figur 3A). Dermal matrisen var fläckad med antikroppar mot kollagen typ I (COL 1) och fibronectin (Fn). Här observerades kollagen som rikliga tjocka fibrer medan fibronectinfibrer var glesa, vågiga och tunna (Figur 3A). Vår helmonterade färgning kan också ge cellnivåupplösning av färgning, vilket visas för K14-positiva keratinocyter(figur 3B).
Slutligen visar vi att mänskliga ex vivo-sår har bosatta immunceller, med Langerhans celler upptäckta runt nybildad epidermis vid dag 3 efter sådd (Figur 3C). Dessa resultat tyder faktiskt på att helmonterad färgning kan användas för att undersöka viktiga egenskaper hos det helande svaret, inklusive inflammation, spridning och den extracellulära matrisen (figur 4A). Sammantaget visar våra data att den kombinerade ex vivo hudsår och hela montering färgning förfarande är en giltig metod för att bedöma olika aspekter av friska och diabetiker (patologiska) mänskliga huden reparation.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figur 3: Optimering av hela monteringsfärgningsmetoden för användning med andra antikroppar. (A) Blodkärlen var färgade med alfaslät muskelaktin (α-SMA, grön) och keratin 14 (K14, röd), medan matrisfibrer var färgade med kollagen I (COL 1, rött) och fibronectin (Fn, grön). B)Hela monteringsförfarandet ger upp till cellnivåupplösning av lokalisering (K14, grön; K1, röd). C)CD1a+ve Langerhans celler (gröna) observerade i nybildad epidermis. DAPI = blå atomkärnor. Stapel = 100 μm. Vita prickade linjer visar inre och yttre sårkanter och separerar sår från epidermis. Denna färgning utfördes i icke-diabetiker huden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figur 4:Giltigheten av hela målningsproceduren för bedömning av sårläkning. (A) Illustration som visar hur hela monteringsfärgningstekniken kan utvärdera sårrelevanta processer. Antikroppar som används = röd text. K14 = keratin 14. COL 1 = kollagen 1. Fn = fibronectin. B)Hela markeringsförfarandet (blå pilar) medför mindre variationer i sårförslutningsmätningar än vanlig histologisk analys (röda pilar). S1 = avsnitt 1. VI = sårkant. Bar = 300 μm. Denna färgning utfördes i icke-diabetiker huden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair at JoVE.com

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Här demonstrerar vi en optimerad teknik för att bedöma sårreparation med ex vivo mänsklig hud i kombination med en helmonterad färgning strategi. Denna metod ger en preklinisk plattform för utvärdering av potentiella sårbehandlingar.

Human Ex vivo-sårmodell och helmonteringsfärgning för att noggrant utvärdera hudreparation

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

I den här artikeln presenterar vi ett optimerat ex vivo humant hudsårsprotokoll som kan ge viktiga effektdata som en del av en klinisk translationell pipeline. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör en noggrann bedömning av sårreparation i levande mänsklig hud. Elizabeth Roberts, postdoktor, och Alexandria Kidd, en forskningsassistent från vårt laboratorium, demonstrerar proceduren.För att förbereda ett hudvävnadsprov för sårning, placera hudens huddermissida ner i en 90 millimeters petriskål och använd steril sax för att ta bort fettvävnaden. När allt fett har avlägsnats, placera huden i 25 milliliter HBSS kompletterat med antibiotika i 10 minuter vid rumstemperatur med intermittent skakning för att avlägsna eventuellt kvarvarande blod i fettvävnad. Skölj huden i 25 milliliter DPBS efter 10 minuter.Efter 10 minuter, upprepa HBSS-sköljningen utan antibiotika och utför sedan en slutlig sköljning i 25 milliliter DPBS. Placera sedan ett sterilt nylonfiltermembran på den absorberande dynan och torka hudens hudsida på steril gasväv i en 90 millimeters petriskål för att ta bort kvarvarande DPBS. Placera den torkade huden dermis sida ner på ett rent 90 millimeter Petri disklock för att ta bort eventuella kvarvarande DPBS och doppa epidermis torr med färsk steril gasväv.För att skapa ett sår, tryck en två millimeters biopsislag mot huden samtidigt som du håller huden tätt och vrider försiktigt. Använd en krökt tandad vävnad tång, plocka upp varje sida av det cirka två millimeter diameter sår och krok böjda Iris sax under såret. Använd en sex millimeters biopsi stans till biopsi runt det centrala två millimetersåret för att skapa en sex millimeter explant med en partiell tjocklek två millimeter sår i mitten.Placera sedan såret explant epidermis sida upp på nylonfiltermembranstacken för en en till sju dagars inkubation vid 32 till 37 grader Celsius och 5% koldioxid. För fluorescerande färgning, samla sårexplanterna i 1,5 milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 500 mikroliter hudfixerande per rör och inkubera explanterna över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, byt ut fixativet mot en milliliter färgningstvättbuffert.Efter tvätten, täck varje prov med cirka 150 mikroliter blockeringsbuffert och inkubera i en timme vid rumstemperatur. Efter att ha tagit bort blockeringsbufferten, tillsätt 150 mikroliter primär antikropp utspädd i blockerande buffert per rör och inkubera sårexplanterna över natten vid fyra grader Celsius. Nästa morgon skölj proverna med 500 mikroliter färgningstvättbuffert som innehåller 0,2% natriumazid följt av tre sköljningar i vanlig tvättbuffert.Efter tvätten, tillsätt 150 mikroliter av en lämplig florescence-konjugerad sekundär antikropp utspädd i färgningstvättbuffert till varje brunn för en timmes inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, skölj explanten tre gånger i 30 minuter i 500 mikroliter färgningstvättbuffert per tvätt innan du motfärgar varje explant med 150 mikroliter DAPI i 10 minuter vid rumstemperatur. Slutligen tvätta explanten två gånger i 30 minuter med 500 mikroliter tvättbuffert per tvätt.För explant imaging, placera en 60 millimeters Petri-skål på bildplattformen i ett konfokalt mikroskop och tillsätt ett cirka ett milliliter lager DPBS till skålen. Använd tång för att överföra såret explanter till skålen. När du har konfigurerat bildframställningsprogramvaran som är lämplig för experimentet placerar du såret i mitten av bildplanet och skaffar bilder av sårbiopsierna.Om du vill utföra trådlös digital mikroskopavbildning för att få högkvalitativa bilder på ett kostnadseffektivt sätt ansluter du en telefon eller bärbar dator till ett trådlöst digitalt mikroskop. Placera explanterna lindade sida upp på en bit labbvävnad och ta bort eventuell resttvättbuffert från provet. Placera sedan explanten i mitten av mikroskopets synfält och skaffa bilder med hjälp av den anslutna kameran.Immunoperoxidas och immunofluorescens kan användas för hela mount vävnad färgning. Dessutom kan levande /död färgning utföras på färsk vävnad och avbildas före eller efter fixering. Hela fästet färgning av sår kan användas för att bestämma sår stängning priser på ett reproducerbart sätt.I denna representativa analys observerades friska huden sår stängning efter fyra till fem dagar medan diabetiker huden sår misslyckades att stänga helt inom sju dagars analysperioden. K14 uttryck toppade dag två i friska huden sår innan snabbt minska med ökad epidermal differentiering. Denna re-epitelialization och efterföljande epidermal differentiering försenades i diabetiker huden sår.Reformationen av den tidiga epidermal barriären utesluter K14 antikroppar penetration inom de differentierade epidermala skikten. Tidigt i om epitelialiseringsprocessen migrerar K14 positiva basala keratinocyter inåt över det öppna såret, så att epidermis närmare den yttre sårkanten bildas tidigare än epidermis närmare den inre sårkanten. Senare i reparationsstadiet går K14-färgning förlorad eftersom epidermis skiljer sig från utsidan inåt.Hela monteringsfärgning kan också användas för att studera uttryck och lokalisering av andra sårrelevanta markörer i huden, liksom närvaron av immunceller av intresse på sårplatsen i olika stadier av läkning. Att generera reproducerbara excisional sår kan vara utmanande till en början. Vi rekommenderar att du övar sårproceduren med överskottshud.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Inrättande av en kliniskt relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock kataraktoperation Modell för utredning Epithelial sårläkning i en Native mikromiljö

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ kultur och Hela Mount immunofluorescensfärgning av Mus Wolffian kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Odling av Retinal Pigment epitelial celler på en Ex Vivo modell av äldre människors Bruchs membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hela-mount konfokalmikroskopi för vuxna öron hud: modellsystem studera Neuro-vaskulär förgrenade morfogenes och immunceller Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hela berget immunofluorescens och follikeln kvantifiering av odlade mus äggstockarna

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...