Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

نشكر مرفق التدفق الخلوي الأساسي لجامعة شينشيانغ الطبية. وقد تم دعم تطوير هذه التكنولوجيا من خلال منح NSFC 81601360 إلى LZ 81471595 32070898 إلى YL. ويدعم هذا العمل أيضا مؤسسة هينان لجنة التعليم رقم 21IRTSTHN030.

1. تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 لوكو
<ol><li>دليل التصميم RNAs حول موقع الإدراج المطلوب
	<ol>
<li>تأكد من أن موقع الإدراج ل Rosa26 الماوس (فيما يلي يسمى mRosa26) تجارب knock-in يقع في intron الأول من mRosa26; وقد استخدم هذا الموقع في الدراسات السابقة28<su...

في تجاربنا، أظهرنا كيفية إجراء التحرير طرق في الخلايا المناعية من تصميم بناء لفحص الخلايا طرق في والتحقق من صحة باستخدام خلايا T جوركات الإنسان وال الضامة RAW264.7 مورين كأمثلة. كل من الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة مقاومة لالعابر36،37؛ ومع ذلك ، يمكن التغلب ?...

الخلايا المناعية حاسمة للدفاع ضد مسببات الأمراض. مطلوبة على حد سواء المناعة الفطرية والتكيفية لإزالة المصابات والحفاظ على التوازن النسيج1،2. نماذج خط الخلية هي أدوات أساسية لفهم الأسس الجزيئية للجهاز المناعي الثدييات. يتم استخدامها في المقايسات الوظيفية في المختبر ، مثل تلك التي تصمم تنشيط الخلايا التائية البشرية ، وفي تحديد وظيفة العوامل الوراثية في تنشيط أو تخفيف الاستجابات المناعية3،4. من المهم ملاحظة أن جهاز المناعة الثديي غير متجانس بشكل كبير ، وبنفس القدر من الأهمية ، يتحكم عدد كبير من الجزيئات في التمايز والهجرة ووظيفة نوع الخلية المحدد5،6.
تتجمع بانتظام قصيرة باليندروميك يكرر (CRISPR) / Cas9 أدوات تحرير الجينوم تسمح للتلاعب الجيني لأنواع الخلايا المحددة، مما يسهل التعليق الوظيفي للجينات بطريقة دقيقة7،8. وقد وصفت العديد من البروتوكولات المنشورة تسليم CRISPR / Cas9 في شكل مجمعات الحمض النووي الريبي Cas9 دليل المعروفة باسم ريبونوكليوبروتس (RNPs) في خلايا HEK293، خطوط الخلايا جوركات، الخلايا التائيةالأولية 9،10،الضامة11،12،13،الخلايا الجذعية14،وغيرها15،16. في هذه البروتوكولات ، يتم عادة وضع علامات الجينات عن طريق دمج علامة الفلورسنت إلى البروتينات الذاتية17،18. ومع ذلك بذلت محاولات قليلة لاستخدام المراسلين الفلورسنت المزدوج، والتي تتوافق مع فرز خلية واحدة، لتسهيل التجارب طرق في19،20،لا سيما في الخلايا المناعية.
تتطلب التحليلات الميكانيكية المتعمقة التي تهدف إلى فهم وظائف عامل وراثي جديد في الخلايا المناعية بشكل عام حذف جين معين من نوع الخلية ، وتجارب الإنقاذ الجيني ، وتحديد تفاعله بشكل مثالي. على الرغم من أن أساليب التحسين من الحذف الجيني للجينات في الخلايا المناعية قد نشرت9،15،21، تم الإبلاغ عن طرق أقل بكثير لإدخال أليليس طرق في وظائف متعددة لفهم الاستجابة المناعية. لذلك، نهدف في هذا البروتوكول إلى وصف بروتوكول فعال وقابل للاستنساخ بشكل كبير للتعبير عن بروتين مهم (POI) في مكان الميناء الآمن Rosa26 في كل من خطوط الخلايا المناعية البشرية والمرينية. صممنا نظام مراسلة من لونين لإثراء الخلايا المصابة بلازميدات تعبر عن CRISPR/Cas9 (DsRed2) وقالب الحمض النووي المؤتلف (EBFP2) ، والذي يمكن عزله عن طريق فرز الخلايا. بعد هذا البروتوكول، حصلنا على عدة خطوط طرق في خط الخلية التائية البشرية جوركات ومورين macrophage RAW264.7 للتحليلات الوظيفية للبروتينات درس بشكل سيئ.
كمثال على ذلك، نعرض في هذا البروتوكول كيفية الحصول على الضامة RAW264.7 التي تعبر بشكل ثابت عن ACE2 البشري (مستقبلات سارس-كوف-2)22. لأن الخلايا المناعية الفطرية تشارك في الإمراض من Covid-1923،24 ويعتبر ACE2 الإنسان كم مستقبلات رئيسية مطلوبة للدخول الفيروسي إلى الخلايا قبل النسخ المتماثل ، يمكن أن تكون الضامة مع طرق في ACE2 الإنسان بمثابة أداة مفيدة للدراسات الميكانيكية للتكاثر الفيروسي داخل الضامة. بالتوازي، نقدم أيضا مثالا على طرق في جين في مكان ROSA26 الإنسان للتعبير عن البروتين RASGRP1، الذي تم تنصهر في نهاية الأمينية مع تقارب التوأم ستريب العلامة (OST). الخلايا التائية هي الخلايا المستهدفة الرئيسية في العلاجات المناعية، وقد ركز عدد متزايد من الدراسات على التلاعب في استجابتها للسرطان25،26. كما Rasgrp1 ومن المعروف أن جزيء الإشارات الرئيسية المصب لمستقبلات الخلايا التائية والتفاعل لها ليست واضحة جيدا27، وOSST -RASGRP1 ضرب في نموذج يوفر الأساس لتحديد interactors تنظيم استجابة الخلايا التائية للأورام والعدوى. ويمكن استخدام هذه الأدوات معا لدراسات كوفيد-19 واكتشاف جزيئات جديدة تتفاعل مع Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

تتطلب دراسات الجينوم الوظيفية للجهاز المناعي التلاعب الجيني الذي ينطوي على حذف الجينات المستهدفة وإضافة عناصر إلى البروتينات ذات الاهتمام. تحديد وظائف الجينات في نماذج خط الخلية مهم لاكتشاف الجينات واستكشاف الآليات الجوهرية للخلايا. ومع ذلك ، فإن التلاعب الجيني للخلايا المناعية مثل الخلايا التائية وخطوط خلايا الضامة باستخدام CRISPR / Cas9 بوساطة طرق في صعبة بسبب انخفاض كفاءة العدوى من هذه الخلايا ، وخاصة في حالة هادئة. لتعديل الجينات في الخلايا المناعية، يتم استخدام اختيار مقاومة الأدوية والنواقل الفيروسية عادة لإثراء الخلايا التي تعبر عن نظام CRIPSR/Cas9، مما يؤدي حتما إلى تدخل غير مرغوب فيه للخلايا. في دراسة سابقة، قمنا بتصميم المراسلين الفلوريين المزدوجين إلى جانب CRISPR/Cas9 التي تم التعبير عنها بشكل عابر بعد الصعق الكهربائي. هذا الحل التقني يؤدي إلى حذف الجينات بسرعة في الخلايا المناعية; ومع ذلك ، فإن طرق الجينات في الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية والكوافير دون استخدام اختيار مقاومة الأدوية أو ناقلات الفيروسات هو أكثر تحديا. في هذه المقالة، نظهر أنه باستخدام فرز الخلايا للمساعدة في اختيار الخلايا التي تعبر بشكل عابر عن بنيات CRISPR/Cas9 التي تستهدف مكان Rosa26 بالاشتراك مع بلازميد المانح، يمكن تحقيق طرق الجينات في كل من الخلايا التائية وال الضامة دون إثراء مقاومة للأدوية. وكمثال على ذلك، نعرض كيفية التعبير عن ACE2 البشري، وهو مستقبل للسارس-كوف-2، المسؤول عن وباء كوفيد-19 الحالي، في الضامة RAW264.7 من خلال إجراء تجارب طرق. يمكن استخدام هذه الخلايا الجينية على نطاق واسع للدراسات الميكانيكية.

بعد البروتوكول المذكور أعلاه لإجراء تجارب طرق في موقع mRosa26 باستخدام الضامة RAW264.7 مورين، صممنا متجه استهداف للتعبير عن ACE2 الإنسان، وهو مستقبل لفيروس سارس-كوف-2(الشكل 2A). باستخدام تصميم مماثل، ونحن ولدت الإنسان الخلايا T Jurkat مع طرق في من البروتين الانصهار RASGRP1 الموسومة OST<s...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

يستخدم هذا البروتوكول المراسلات الفلورية وفرز الخلايا لتبسيط التجارب في الماكروفاج وخطوط الخلايا التائية. وتستخدم اثنين من البلازميدات لهذه التجارب المبسطة في طرق، وهي CRISPR/Cas9- وDsRed2 التعبير عن البلازميد وplasmid المانحة إعادة التركيب متجانسة التعبير عن EBFP2، والتي يتم دمجها بشكل دائم في مكان Rosa26 في الخلايا المناعية.

الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

الهدف من هذا البروتوكول هو تبسيط CRISPR /Cas9 بوساطة ضرب في تجربة في الضامة وخطوط الخلايا التائية ، مع مساعدة من المراسلين الفلورسنت وتؤثر على فرز الخلايا. يعرف موقع ROSA26 Locus كموقع ميناء آمن جينومي لإدراج المتحولات. ومن المعتاد للتعبير عن البروتين من الفائدة مع أو بدون هجوم في عالم الماوس من 26 مكان، أو في سجل العظام البشرية.الجزء 1: تصميم وبناء البلازميد من sgRNAs استهداف روسا26 الجراد. أولا، تصميم sgRNAs من موقع Rosa26 الماوس، وذلك باستخدام تسلسل من المعلوماتية الجينوم الماوس، ومتصفح الجينوم الفرقة، ثم تحميل التسلسل الجينومي للجين Rosa26 الماوس. انتقل إلى أداة الويب عبر الإنترنت ، CRISPOR ، الصق 100 زوج أساسي من تسلسل الإدخال من مكان Rosa26.ثم حدد الجينوم، على سبيل المثال، موس العضلات الماوس الجينوم المرجعي 2011. بعد ذلك، حدد نوع PAM. استخدم 20bp NGG "PAM motif، المعترف بها من قبل spCas9.انقر فوق إرسال. اختيار دليل مع درجة عالية من التحديد ، وارتفاع درجة القيام به ، وأقل من الأهداف. وينبغي تجنب الأدلة التي يشار إليها على أنها غير فعالة.وتجدر الإشارة إلى أنه يفضل تحديد دليلين مع تسلسل متداخل ، مما قد يزيد من كفاءة الضربة القاضية كما ورد. لتسلسل تناول الطعام الدافئ ، توليف غير قانوني إلى الأمام وعكس غير قانوني ، والذي تم صلب الفوسفور وعلى استعداد للاستنساخ إلى عامل. إعداد انخفاض خطي لكل Vactor التي يمكن أن تعبر عن هو لا بد لي من مراسل من قبل BBS هضم واحد ، مثل الحصول على نيل ، والقانونية لنواقل خطي لتوليد بناء النهائي ، والذي يعبر في وقت واحد دليل الجيش الملكي النيبالي و CAS تسع نواة مرتبطة مع DSRIP اثنين من المراسلين الفلورسنت.الجزء الثاني: بناء موجه الاستهداف كقالب إعادة دمج متجانس. للتعبير عن البروتين من الاهتمام. على سبيل المثال، استمر الإنسان.تريد توليف تسلسل cDNA حسب المصدر التجاري وتقارب علامة OST أو غيرها من الهجوم شائع الاستخدام لتنقية البروتين يمكن دمجها في تسلسل cDNA. تذكر أن تدرج تسلسل توافق Kazak قبل بدء cDNA. هضمها Asc1 تقييد الانزيم ، ومثل الحصول على القرص المضغوط وإدراج في العمود الفقري.Vactor، وهي pKhR26-IBFP IBP تسفر عن الاستهداف النهائي تركيز الحاوية، كل واحد، كيلوبايت من خمسة رئيس الوزراء وثلاثة أذرع رئيسية متجانسة. مجموعة يلقي التعبير يتضمن المروج CG، ومطعم UST، إذا كنت تريد منطقة كونين مرتبطة إيريس، إذا مراسل VFD وصناديق بولي AC. وأخيرا في الأفق استهداف ناقلات باستخدام إنزيمات قطع فريدة من نوعها، مثل EcoR1 أو BamH1، يتم تنقية الهضمات والمنتج في مخزن أن ناقص 20 درجة على ملاحظات الكهربائي.فمن المستحسن الحصول على تركيز عال من الحمض النووي ناقلات خطية. الجزء الثالث: الكهرومربوجين من خطوط الماكروفاج والخلايا التائية إعداد ثقافة الخلية يتبع فصل لخلايا جيريتوك. وكانت الكثافة المثالية للخلايا حوالي 0.5 مليون خلية لكل مل في وقت العدوى.الكهربية الكاملة في عشرة الماكرو قليلا صيغ تلميح الموضة النووية إعداد لوحة بئر 24 تحتوي على 500 ميكرولتر من النمو الكامل، والمتوسطة دون المضادات الحيوية في كل بئر. ما قبل الحرب لوحات في الرطوبة 37 درجة، 5٪ تغطي أن حاضنة الإعداد. رفض معلمات إدخال نظام التشغيل الكهربائي للقط النفاث أو روزاليس.إعداد خلية الحمض النووي المتابعة خليط أو عملية جمع خلايا الدجاج. Curchin 25 قارورة سنتيمتر مربع نقل الخلايا في الحيوانات 15. منذ كنت أنبوب، ثم فيليب الخلايا عن طريق القنطرة في 90 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونسأل عن ذلك، وsupernatants.لغسل, Resuspend الخلايا مع برنامج تلفزيوني ML خمسة, ثم تدور تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي باستخدام نفس الشرط كما في الخطوة السابقة. إزالة DPPs. وإعادة إنفاق الوسائد الخلية باستخدام اثنين من ML من DBS.يمكنك البقاء تعليق الخلية الصغيرة الصغيرة ومزيج مع حجم متساو من 0.2٪ تريبان بالو لتقدير عينة تحميل عدد الخلايا من حيث عد فتحة إدراج كوني الشريحة في كونور الخلية الآلي وعرض الصورة نفسها. ثم الحصول على نتيجة عدد الخلايا. حساب 2 مليون خلية سوف تجد سمعة من electroporation لكل تجربة طرق نقل عدد الخلايا إلى 1.5 ML.Centrifuge اثنين من خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي.لتوفير الوقت، يمكن إعداد خليط الكهربوجين أثناء الطرد المركزي الذي يضيف 2.5 ميكروغرام من كل من CRISPR CAS تسعة ناقلات 2.4 ميكروغرام من أرز بليندا، ناقل ثرثار، وإعادة تعليق الجاموس. لدينا إجمالي حجم القمامة الماكرو 55 في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل جديدة بلطف والقمة. لفترة وجيزة الوقوف على مزيج جيد.اترك خليط ضغط الأقصر ودرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد الغزل aspart، وDTB هو هذا الصمامات أساسا لمدة 30 ثانية إضافية، وإزالة أكبر قدر ممكن من الخلايا إعادة تعليق عن طريق إضافة ماصة خليط الكهربائي المعدة صعودا وهبوطا بلطف. طلب Electroporation لخلاط كهربائي الخلية باستخدام 10 صغيرة تلميح فصيل النووية الصغيرة كانت ماصة مهمة.تجنب فقاعات الهواء أثناء pi petting سيكلف فشل الصعق بالكهرباء. اضغط على البدء. وبعد ذلك نقل العملية العينة في حين.حسنا من 24، لوحات الآبار مع قبل تحذير المتوسط الإجمالي أداء نفس الضغط الكهربائي والإجراءات المذكورة أعلاه على العينات الأربع المتبقية المكررة، صخرة بلطف لوحة لضمان توزيع حتى من الخلايا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة لمدة 48 إلى 72 ساعة. قبل وقوعها ، وفرز الخلية في 24 ساعة بعد transfection ، ودراسة التعبير عن تعطيل اثنين لمراسل مطعم باستخدام المجهر فلوريسي منفصلة عن مندوب بالنسبة لنا أنفسهم يشير إلى أن electroporation يعمل بشكل صحيح.الجزء 4: فرز الخلية لعزل الخلايا المفترضة. قبل فرز الخلية إعداد، في 96 لوحات بئر مع 150 ميكرو قليل من نوع الخلية المتوسطة الإجمالية محددة لكل بئر استخدام مكان خاطئ أسفل الصغرى للثقافة نفسها ومكان صغير أسفل شقة لجميع الخلايا نقل الخلايا إلى FACS عقيمة للحفاظ على أنبوب في على الجليد ووضع مربع في المسار من خلال النافذة، الاتصال غرفة فرز الخلية عند تطبيقها مجموعة فرز الخلية مع فوهة 85 متر صغير وانخفاض معدل التدفق لفرز الخلايا المناعية لتحقيق المثلى evaluability الخلية والبقاء على قيد الحياة تأخذ عينات من قمة النافذة العابرة لفترة وجيزة، وتحميل العينة في عمليات الاستحواذ. Champer إعداد التزحلق على الحقائق لفرز الخلية المحددة أولا مسارات المبيعات لتشتت فورد وتشتت الجانب، ثم تحديد خلايا الحياة عن طريق الحصول على مجموعة محادثات الخلايا السلبية الحمراء.بعد ذلك ، يجدون خلايا واحدة حية عن طريق gating singlet واحد باستخدام FSC H مقابل FSE كتلة متعددة المتنوعة. وأخيرا تعيين بوابة لDSRs المطلوب اثنين وباء إذا كان السكان الفرعية فولفو إيجابية، مما يشير إلى الخلايا بنجاح co transfected مع ناقلات CRISPR وناقل الجيب. حتى 10 خلايا واحدة في كل بئر من 96، لوحة جيدة تكملها مع ما قبل الحرب، ومتوسط النمو الكامل باستخدام وضع الفترة أو وضع خلية واحدة بعد فرز احتضان 96، لوحات الآبار في حاضنة ثقافة الخلية لتوسيع الخلية.الجزء الخامس: فحص ارتفاع الخلايا الإيجابية بعد أسبوعين تقريبا من توسع الخلية بعد البقاء على قيد الحياة ، تقوم الخلايا في لوحة البئر 48 بتقييم تعبير BFP أو قياس التدفق الخلوي باستخدام نسبة صغيرة من الانتشار نفسه باستخدام خلايا نوع الجدار كخلايا تحكم سلبية ، ويتم الاحتفاظ بنسبة أعلى من الخلايا الإيجابية BFP لتحقيق التحقق من صحة استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا التي يجب أن نعبر عنها BFP تمرير الحمض النووي الجينومي معزولة من قبل PCR مع التمهيديات التي تمتد على كل جانب من الأسلحة متجانسة، وهي واحدة يحدد الأولية في تسلسل الجينوم، والخارج إلى ناقلات الاستهداف. الجانب ينظر إلى الحديث إلى المتجه في هذه التجربة، وتوقع حجم المنتج PCR تضخيمها مع الابتدائي هو 1.2 كيلو فولت. ومع F اثنين و R اثنين هو 1.2 كيلو بايت نتائج تسلسل سانجر. حتى منتجات PCR تظهر تسلسل كل تقاطع التكامل مما يدل على الموقف الصحيح وطرق في روزا 26 لوكاس.أقول مثل النشاف المناعي تمكن من التحقق من صحة طرق الصحيح على مستوى البروتين الجزء السادس النتائج التمثيلية. على سبيل المثال ، نشرت في دراسة سابقة ، أعربنا عن أن الحصول على 45 جزيئات تك أن إنتر مع علامة OSD ، وكان هناك 26 موضعا في الخروج T -cells في وقت لاحق لباقة الدولار الأمريكي. أحصل على 45 ومديري الحوادث أو سحبت إلى أسفل عن طريق تنقية تقارب وموضوع لقياس الطيف الشامل.وكشفت بيانات البروتيوميات التفاعل بين الخلايا التائية. ولذلك فإن هذا المجمع المنتج قد سهلت إلى حد كبير البحث عن intercalators رواية لتوضيح وظيفة بروتين معين. وأظهر هذا العرض الفني أن أعرب عابرة عن زيادة لكل خط الزهر RFP مع ناقلات الحديث أعرب المشتركة وBFP لروسا 26 الموضع.لقد ولدنا خطوط خلايا مدقة بتعبير جيني دائم في كل من الخلايا التائية والكوابير، والتي يصعب إجراؤها في التلاعب الجيني. تنطبق هذه الطرق والتوصيات على كريس المسموح به في التأكيدات على جزء كبير من الحمض النووي للدراسات الميكانيكية للخلايا المناعية ، مثل تحديد البروتين ، دراسة التفاعل البروتيني.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...