Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Vi takker flowcytometrikernefaciliteten på Xinxiang Medical University. Udviklingen af en sådan teknologi er blevet støttet af NSFC-tilskud 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbejdet er også støttet af Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

1. Design og Plasmid Opførelse af SGRNAs Målretning Rosa26 Locus
<ol><li>Design guide RNA'er omkring det ønskede indsætningswebsted
	<ol>
<li>Sørg for, at indføringsstedet for mus Rosa26 (i det følgende benævnt mRosa26) knock-in eksperimenter er placeret i den første intron af mRosa26; dette websted er blevet anvendt i tidligere undersøgelser28,29. For knock-in forsøg i menneskelig...

I vores eksperimenter demonstrerede vi, hvordan man udfører knock-in redigering i immunceller fra konstruktionsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjælp af menneskelige Jurkat T-celler og murin RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-celle- og makrofagscellelinjer er modstandsdygtige over for transfection36,37; Problemet med lav effektivitet af CRISPR/Cas9-levering kan imidlertid løses ved hjælp af fluorescerende journalister kombineret me...

Immunceller er afgørende for forsvar mod patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance af infectants og vedligeholdelse af væv homøostase1,2. Cellelinjemodeller er vigtige værktøjer til at forstå de molekylære fundamentale elementer i pattedyrs immunsystem; de anvendes i in vitro funktionelle assays, såsom dem modellering human T-celle aktivering, og til bestemmelse af funktionen af genetiske faktorer i aktivering eller dæmpning immunrespons3,4. Det er vigtigt at bemærke, at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent, og lige så vigtigt styrer et stort antal molekyler differentiering, migration og funktion af en given celletype5,6.
Grupperet Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genom redigeringsværktøjer giver mulighed for genetisk manipulation af specifikke celletyper, hvilket letter funktionel anmærkning af gener på en præcis måde7,8. Flere offentliggjorte protokoller har beskrevet leveringen af CRISPR/Cas9 i form af Cas9-guide RNA-komplekser kendt som ribonucleoproteiner (RNG'er) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokoller opnås genmærkning normalt ved at sammensmelte et fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Men få forsøg er gjort for at bruge dobbelt fluorescerende reportere, som er kompatible med enkelt celle sortering, at lette knock-in eksperimenter19,20, især i immunceller.
Dybdegående mekanistiske analyser, der har til formål at forstå funktionerne i en ny genetisk faktor i immunceller, kræver generelt celletypespecifik sletning af et gen, genetiske redningsforsøg og ideelt identifikation af dets interactorer. Selvom metoder til optimering af genetisk sletning af gener i immunceller er blevet offentliggjort9,15,21, langt færre metoder er blevet rapporteret til at indføre knock-in alleler med alsidige funktioner til at forstå immunresponset. Derfor sigter vi i denne protokol mod i detaljer at beskrive en effektiv og meget reproducerbar protokol til at udtrykke et protein af interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murin immuncellelinjer. Vi designede et tofarvet reportersystem til at berige celler transfected med plasmider, der udtrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-skabelon (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Efter denne protokol opnåede vi flere knock-in linjer af den menneskelige T-cellelinje Jurkat og murine makrofag RAW264.7 til funktionelle analyser af dårligt studerede proteiner.
Som et eksempel viser vi i denne protokol, hvordan man får knock-in RAW264.7 makrofager, der stabilt udtrykker human ACE2 (en receptor af SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involveret i patogenesen af Covid-1923,24 og human ACE2 betragtes som en vigtig receptor, der kræves for viral indrejse i celler før replikation, makrofager med knock-in af menneskelige ACE2 kan tjene som et nyttigt redskab til mekanistiske undersøgelser af viral multiplikation inde makrofager. Parallelt, vi også præsentere et eksempel på knock-in af et gen på den menneskelige ROSA26 græshoppe til at udtrykke RASGRP1 protein, som blev smeltet på sin amino endestation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er centrale målceller i immunterapier, og et stigende antal undersøgelser har fokuseret på manipulation af deres reaktionsevne over for kræft25,26. Som Rasgrp1 er kendt for at være en vigtig signalering molekyle nedstrøms af T-celle receptor og dens interactors er ikke godt belyst27, OST-RASGRP1 knock-in model giver grundlaget for at identificere interactors regulerer reaktionen af T-celler til tumorer og infektion. Samlet set kan disse værktøjer bruges til Covid-19-studier og opdagelsen af nye molekyler, der interagerer med Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Funktionelle genomforskninger af immunsystemet kræver genetiske manipulationer, der involverer både sletning af målgener og tilsætning af elementer til proteiner af interesse. Identifikation af genfunktioner i cellelinjemodeller er vigtig for genopdagelse og udforskning af celle iboende mekanismer. Men genetiske manipulationer af immunceller som T-celler og makrofag cellelinjer ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret knock-in er vanskelige på grund af den lave transfection effektivitet af disse celler, især i en quiescent tilstand. For at ændre gener i immunceller, lægemiddelresistens udvælgelse og virale vektorer bruges typisk til at berige for celler, der udtrykker CRIPSR / Cas9-systemet, hvilket uundgåeligt resulterer i uønsket indgriben af cellerne. I en tidligere undersøgelse designede vi dobbelt fluorescerende journalister koblet til CRISPR /Cas9, der blev forbigående udtrykt efter elektroporation. Denne tekniske løsning fører til hurtig gensletning i immunceller; gen knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uden brug af valg af lægemiddelresistens eller virale vektorer er endnu mere udfordrende. I denne artikel viser vi, at ved at bruge cellesortering til at hjælpe med udvælgelse af celler, der forbigående udtrykker CRISPR / Cas9-konstruktioner rettet mod Rosa26-locus i kombination med en donorplasmid, kan gen knock-in opnås i både T-celler og makrofager uden lægemiddelresistensberigelse. Som et eksempel viser vi, hvordan man udtrykker human ACE2, en receptor af SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nuværende Covid-19-pandemi, i RAW264.7 makrofager ved at udføre knock-in eksperimenter. Sådanne gen knock-in celler kan i vid udstrækning anvendes til mekanistiske undersøgelser.

Efter protokollen beskrevet ovenfor til at udføre knock-in eksperimenter på mRosa26 græshoppe ved hjælp af murine RAW264.7 makrofager, vi designet en målretning vektor til at udtrykke menneskelige ACE2, en receptor for SARS-Cov-2 virus (Figur 2A). Ved hjælp af et lignende design genererede vi menneskelige Jurkat T-celler med knock-in af ost-mærket RASGRP1 fusion protein (Figur 2C). Efter transfektion af tre plasmider, hvoraf to blev brugt til udt...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Denne protokol bruger fluorescerende journalister og cellesortering til at forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T cellelinjer. To plasmider anvendes til disse forenklede knock-in eksperimenter, nemlig en CRISPR/Cas9- og DsRed2-udtrykke plasmid og en homolog rekombination donor plasmid udtrykke EBFP2, som er permanent integreret på Rosa26 græshoppe i immunceller.

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Målet med denne protokol er at forenkle CRISPR/Cas9 medieret knock-in eksperiment i makrofag og T-celle linjer, ved hjælp af fluorescerende reportere og påvirke celle sortering. ROSA26 Locus er kendt som et genomisk sikkert havnested til indsættelse af transgener. Det er en sædvanlig at udtrykke protein af interesse med eller uden angreb i musen verden af 26 græshoppe, eller i den menneskelige ortho log.Del 1: Design og Plasmid Opførelse af sgRNAs Målretning Rosa26 Locus. Først design sgRNAs fra musen Rosa26 locus, ved hjælp af sekvenser fra mus genom informatik, og Ensemble Genome Browser, derefter downloade genomisk sekvens af musen Rosa26 genet. Gå til online web-værktøjet, CRISPOR, indsæt 100 basispar af inputsekvensen fra Rosa26 Locus.Vælg derefter et genom, for eksempel Mus musculus-mouse reference genom 2011. Vælg derefter typen pam. Brug 20bp NGG"PAM-motiv, der genkendes af spCas9.Klik på Send. Vælg guide med en høj specificitet score, høj gør score, og en færre off mål. Vejledninger, der er angivet som ineffektive, bør undgås.Især foretrækkes det at vælge en to vejledninger med overlappende sekvenser, hvilket kan øge knock-in effektivitet som rapporteret. For varm spise sekvens, syntetisere en fremad ulovlig og en vending ulovlig, som annealed fosfor og klar til kloning til faktor. Forbered lineariseret fald pr Vactor, som kunne udtrykke er jeg nødt til at reporter af BBS en fordøjelse, ligesom få Neal, legals til lineariseret vektor til at generere den endelige konstruktion, som samtidig udtrykker guide RNA og CAS ni kerne forbundet med en DSRIP to fluorescerende reporter.Anden del: Konstruktion af målretningsvektor som homolog rekombinationsskabelon. For udtryk for protein af interesse. For eksempel varede mennesket op.Du ønsker syntetisere cDNA sekvens af kommercielle kilde og affinitet OST tag eller andre almindeligt anvendte angreb til rensning af protein kan smeltes til cDNA sekvens. Husk at inkludere den kasakiske konsensussekvens før indledningen af cDNA. Fordøjet af Asc1 begrænsning enzym, og gerne få cd'en og indsætte i rygraden.Vactor, nemlig pKhR26-IBFP IBP giver den endelige målretning koncentrere beholderen, hver enkelt, KB af fem prime og tre prime homologe arme. Udtrykket stemmer sæt omfatter en CG promotor, UST restaurant, hvis du vil Koonin region knyttet til en Iris, hvis VFD reporter og en poly AC midler. Endelig i horisonten målretning vektor ved hjælp af unikke fræser enzymer, såsom EcoR1 eller BamH1, fordøjer og produkt er renset i en butik, der minus 20 grader på elektroporation noter.Det anbefales at opnå høj koncentration af lineariseret vektor DNA. Del tre:Elektroporering af makrofag og T-celle linjer forberede cellekultur fulgte adskillelse for Geritalk celler. Optimal celletæthed var ca. 0,5 millioner celler pr. ML på tidspunktet for transfektion.Fuld elektroporation i ti makro små nukleare mode tip formater forberede en 24 brønd plade, der indeholder 500 mikroliter af fuldstændig vækst, medium uden antibiotika i hver brønd. Forvarm pladerne i befugtet 37 grader, 5%dækker denne indstilling inkubator. Skru ned for det elektriske operativsystem input elektroporation parametre for jet kat eller Rosales.Forbered celle DNA-blanding opfølgninger eller operation indsamle kylling celler. Curchin 25 kvadratcentimeter kolbe overførsel celler i de 15 dyr. Da du rør, så Phillip cellerne ved centrofugering på 90 gange G i otte minutter ved stuetemperatur, bede om det, supernatants.Til vask skal cellerne resuspend cellerne med de fem ML PBS, og drej derefter celleaffjedringen ved centrifugering ved hjælp af samme tilstand som det foregående trin. Fjern DPP'erne. Og genbruge cellepuderne ved hjælp af to ML DBS.Du forbliver mikro lille celle suspension og blandes med den samme mængde på 0,2% Trepan Ballou at estimere celletælling belastning prøve i form tælle slot indsætte Connie slide i den automatiserede celle Connor og se billedet selv. Så få et celletællingsresultat. Beregn 2 millioner celler vil finde ry for elektroporation per banke eksperiment overføre antallet af celler i 1,5 ML.Centrifuge to pellet celler ved centrifugalisering.For at spare tid kan elektroporationsblandingen fremstilles under centrifugaliseringen, der tilføjer 2,5 mikrogram af hver af CRISPR CAS ni vektor 2,4 mikrogram Belinda ris, snakkesalig vektor og re suspension Buffalo. Vores samlede volumen på 55 makro kuld i en ny 1,5 ML centrifugeret rør forsigtigt knudepunkt og. Kort står til at blande godt.Lad Luxor trykblandingen og rumtemperaturen stå før brug. Efter spinning aspart, DTB er denne væsentlige sikring i yderligere 30 sekunder, fjerne så meget supernatant som muligt re suspendere celler ved at tilføje den forberedte elektroporation blanding pipette op og ned forsigtigt. Elektroporation bedt om cellen elektroporation mixer ved hjælp af 10 mikro lille nukleare fraktion tip var pipetter vigtigt.Undgå luftbobler under pi petting det vil koste elektroplating fiasko. Tryk på start. hvorefter operationen overfører prøven om et stykke tid.Nå af 24, godt plader med en pre-advare brutto medium udføre det samme elektriske tryk og procedurer som ovenfor på de resterende fire replikerede prøver, forsigtigt rock pladen for at sikre jævn fordeling af cellerne. Inkuber cellerne i 37 graders inkubator i 48 til 72 timer. Før fakta, celle sortering På 24 timer efter transfection, undersøge udtrykket af forstyrre to for restaurant reporter ved hjælp af florescerende mikroskopi løsrevet fra rep for os selv viser, at elektroporation fungerer korrekt.Del 4:cellesortering for at isolere putative knock-in-celler. Før celle sortering forberede, i 96 brønd plader med 150 mikro lidt af celletype specifikke brutto medium per godt bruge forkert bund mikro sted for kultur og sig selv og den flade bund mikro sted for alle celler overføre celler til en steril FACS at holde røret i på is og til at sætte kassen i stien gennem vinduet, tilslutning til cellesorteringsrum, når det er relevant, sæt cellesortering med 85 mikrometer dyse og lav strømningshastighed for immuncellesortering for at opnå optimal celleværdighed og overlevelse tage prøver fra pass-through vinduet knudepunkt kort, og indlæse prøven i opkøb. Champer oprettet fakta skøjteløb for celle sortering først defineret salg tragte for Ford scatter og side scatter, derefter definere livsceller ved at få sættet taler røde negative celler.Dernæst finder de en levende enkelt celler ved enkelt singlet gating ved hjælp af FSC H versus FSE en multi-varieret blok. Sæt endelig en port til de ønskede DSR'er to og B, hvis Volvos positive delpopulation, som angiver, at cellerne med succes er blevet overført med CRISPR-vektor og lommevektoren. Så 10 enkeltceller i hver brønd af 96, godt plade suppleret med forvarm, den komplette vækst medium ved hjælp af periode mode eller enkelt celle mode efter sortering inkubere 96, godt plader i cellekultur inkubatoren for celle ekspansion.Del fem:screening af højde af positive knock-in celler Efter ca. to ugers celleudvidelse forbi overleve, cellerne i 48 brøndpladen vurdere udtrykket af BFP eller flow cytometri ved hjælp af en lille andel af formere sig ved hjælp af vægtype celler som en negativ kontrol cellepopulationer, besidder højere procentdel af BFP positive celler holdes til at opfylde validering udtrække genomiske DNA fra de celler, vi bør udtrykke BFP passerer pcr'ets isolerede genomiske DNA med primere, der spænder over hver side af de homologe arme, nemlig en primær lokaliserer i den genomiske sekvens, udvendigt til målretningsvektoren. Den set side til at tale med vektoren i dette eksperiment, den forudsagte størrelsen af PCR produkt forstærket med den primære er 1,2 KV. Og med F to og R to er 1,2 KB Sanger sekventering resultater. Så PCR-produkter viser sekvenserne af hvert integrationskryds, der demonstrerer den korrekte og bankeposition i Rosa 26 Lucas.Jeg siger ligesom immun blotting gør det muligt at validere korrekt banke på protein niveau del seks repræsentative resultater. Som et eksempel, offentliggjort i tidligere undersøgelse, vi gav udtryk for, at få 45 molekyler tack, at inter med en OSD-tag, og der var en 26 græshoppe i kassen T-celler efterfølgende USD takt. Jeg får 45 og hændelse direktører eller trukket ned af affinitet rensning og et emne for massespektrometri.De proteomics data afslørede interaktion mellem T-celler. Derfor har denne produktpulje i høj grad lettet søgningen efter nye intercalatorer til at belyse funktionen af et givet protein. Denne tekniske præsentation viste, at ved forbigående udtrykt øget per støbt linje RFP med taler vektor co-udtrykt og BFP for Rosa 26 græshoppe.Vi genererede banke cellelinjer med permanent genekspression i både T-celler og makrofager, som er vanskelige at udføre i genetiske manipulationer. Disse metoder og anbefalinger gælder for Chris tilladt i påstande om store DNA-segment for mekanistiske undersøgelser af immunceller, såsom til identifikation af protein, protein interaktion undersøgelse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserede Flowcytometri Assay til måling cytotoksisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolation og<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering til T-celledelmængder

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyse af mastcellernes funktioner i Vivo Ved hjælp af 'Mast Cell Knock-in' Mus

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...