Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

We bedanken de flowcytometrie kernfaciliteit van Xinxiang Medical University. De ontwikkeling van dergelijke technologie is ondersteund door NSFC-subsidies 81601360 aan LZ, 81471595 en 32070898 aan YL. Het werk wordt ook ondersteund door de Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.

1. Ontwerp en plasmideconstructie van sgRNA's gericht op Rosa26 Locus
<ol><li>Ontwerpgids RNA's rond de gewenste invoegplaats
	<ol>
<li>Ervoor zorgen dat de inbrengplaats voor muis Rosa26 (hierna aangeduid als mRosa26)knock-in experimenten zich in het eerste intron van mRosa26bevindt; deze site is gebruikt in eerdere studies28,29. Voor knock-in experimenten in menselijke cellen, zorg ervoor d...

In onze experimenten hebben we aangetoond hoe we knock-in-bewerkingen in immuuncellen kunnen uitvoeren, van constructontwerp tot knock-in celscreening en validatie met behulp van menselijke Jurkat T-cellen en murine RAW264.7 macrofagen als voorbeelden. Zowel T-cel- als macrofaagcellijnen zijn bestand tegen transfectie36,37; het probleem van de lage efficiëntie van CRISPR / Cas9-levering kan echter worden opgelost met behulp van fluorescerende verslaggevers in co...

Immuuncellen zijn van cruciaal belang voor de verdediging tegen ziekteverwekkers. Zowel aangeboren als adaptieve immuniteit zijn vereist voor de klaring van infectanten en het behoud van weefselhomeostase1,2. Cellijnmodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de moleculaire fundamenten van het immuunsysteem van zoogdieren; ze worden gebruikt in in vitro functionele assays, zoals die welke menselijke T-celactivatie modelleren, en bij het bepalen van de functie van genetische factoren bij het activeren of dempen van immuunresponsen3,4. Het is belangrijk op te merken dat het immuunsysteem van zoogdieren enorm heterogeen is en, even belangrijk, een groot aantal moleculen de differentiatie, migratie en functie van een bepaald celtyperegelen 5,6.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genome editing tools maken genetische manipulatie van specifieke celtypen mogelijk, wat functionele annotatie van genen op een precieze maniervergemakkelijkt 7,8. Verschillende gepubliceerde protocollen hebben de levering van CRISPR / Cas9 beschreven in de vorm van Cas9-gids RNA-complexen die bekend staan als ribonucleoproteïnen (RSP's) in HEK293-cellen, Jurkat-cellijnen, primaire T-cellen9,10,macrofagen11,12,13,stamcellen14en anderen15,16. In deze protocollen wordt gentagging meestal bereikt door een fluorescerende tag te fuseren met endogene eiwitten17,18. Er zijn echter weinig pogingen gedaan om dubbele fluorescerende reporters te gebruiken, die compatibel zijn met het sorteren van eencellige cellen, om knock-in experimenten19,20, met name in immuuncellen te vergemakkelijken.
Diepgaande mechanistische analyses gericht op het begrijpen van de functies van een nieuwe genetische factor in immuuncellen vereisen over het algemeen celtype specifieke deletie van een gen, genetische reddingsexperimenten en idealiter identificatie van de interactoren. Hoewel methoden voor optimalisatie van genetische deletie van genen in immuuncellen zijn gepubliceerd9,15,21,zijn er veel minder methoden gemeld voor het introduceren van knock-in allelen met veelzijdige functies om de immuunrespons te begrijpen. Daarom willen we in dit protocol in detail een efficiënt en zeer reproduceerbaar protocol beschrijven om een eiwit van belang (POI) tot expressie te brengen op de veiligehaven locus Rosa26 in zowel menselijke als muriene immuuncellijnen. We hebben een tweekleurig reportersysteem ontworpen om te verrijken voor cellen die zijn getransfecteerd met plasmiden die CRISPR / Cas9 (DsRed2) tot expressie brengen en een recombinant DNA-sjabloon (EBFP2), die kan worden geïsoleerd door celsortering. Volgens dit protocol verkregen we meerdere knock-in lijnen van de menselijke T-cellijn Jurkat en murine macrofaag RAW264.7 voor functionele analyses van slecht bestudeerde eiwitten.
Als voorbeeld laten we in dit protocol zien hoe je knock-in RAW264.7 macrofagen kunt verkrijgen die stabiel menselijke ACE2 (een receptor van SARS-Cov-2) tot expressie brengen22. Omdat aangeboren immuuncellen betrokken zijn bij de pathogenese van Covid-1923,24 en menselijk ACE2 wordt beschouwd als een belangrijke receptor die nodig is voor virale binnenkomst in cellen vóór replicatie, kunnen macrofagen met knock-in van humaan ACE2 dienen als een nuttig hulpmiddel voor mechanistische studies van virale vermenigvuldiging in macrofagen. Tegelijkertijd presenteren we ook een voorbeeld van knock-in van een gen op de menselijke ROSA26-locus om het RASGRP1-eiwit tot expressie te brengen, dat aan zijn amino-eindpunt was gefuseerd met een affiniteit Twin-Strep-tag (OST). T-cellen zijn belangrijke doelcellen in immuuntherapieën en een toenemend aantal studies heeft zich gericht op manipulatie van hun reactievermogen op kanker25,26. Aangezien Rasgrp1 bekend staat als een belangrijk signaalmolecuul stroomafwaarts van de T-celreceptor en de interactoren niet goed worden opgehelderd27, biedt het OST-RASGRP1 knock-in model de basis voor het identificeren van interactoren die de reactie van T-cellen op tumoren en infecties reguleren. Samen kunnen deze tools worden gebruikt voor Covid-19-studies en de ontdekking van nieuwe moleculen die interageren met Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Functionele genomics studies van het immuunsysteem vereisen genetische manipulaties die zowel deletie van doelgenen als toevoeging van elementen aan eiwitten van belang omvatten. Identificatie van genfuncties in cellijnmodellen is belangrijk voor genontdekking en verkenning van celintrinsieke mechanismen. Genetische manipulaties van immuuncellen zoals T-cellen en macrofaagcellijnen met behulp van CRISPR / Cas9-gemedieerde knock-in zijn echter moeilijk vanwege de lage transfectie-efficiëntie van deze cellen, vooral in een rustige toestand. Om genen in immuuncellen te modificeren, worden medicijnresistentieselectie en virale vectoren meestal gebruikt om te verrijken voor cellen die het CRIPSR / Cas9-systeem tot expressie brengen, wat onvermijdelijk resulteert in ongewenste interventie van de cellen. In een eerdere studie ontwierpen we dubbele fluorescerende reporters gekoppeld aan CRISPR / Cas9 die tijdelijk tot expressie kwamen na elektroporatie. Deze technische oplossing leidt tot snelle gendeletie in immuuncellen; gen knock-in in immuuncellen zoals T-cellen en macrofagen zonder het gebruik van medicijnresistentieselectie of virale vectoren is echter nog uitdagender. In dit artikel laten we zien dat door celsortering te gebruiken om de selectie te ondersteunen van cellen die tijdelijk CRISPR / Cas9-constructies tot expressie brengen die gericht zijn op de Rosa26-locus in combinatie met een donorplasmide, gen-knock-in kan worden bereikt in zowel T-cellen als macrofagen zonder verrijking van medicijnresistentie. Als voorbeeld laten we zien hoe menselijke ACE2, een receptor van SARS-Cov-2, die verantwoordelijk is voor de huidige Covid-19-pandemie, tot expressie kan worden brengen in RAW264.7-macrofagen door knock-in-experimenten uit te voeren. Dergelijke gen knock-in cellen kunnen op grote schaal worden gebruikt voor mechanistische studies.

Volgens het hierboven beschreven protocol om knock-in experimenten uit te voeren op de mRosa26-locus met behulp van murine RAW264.7 macrofagen, hebben we een targetingvector ontworpen om menselijke ACE2 tot expressie te brengen, een receptor voor het SARS-Cov-2-virus (Figuur 2A). Met behulp van een vergelijkbaar ontwerp genereerden we menselijke Jurkat T-cellen met knock-in van het OST-gelabelde RASGRP1-fusie-eiwit(Figuur 2C). Na transfectie van drie pl...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende reporters en celsortering om knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen. Twee plasmiden worden gebruikt voor deze vereenvoudigde knock-in experimenten, namelijk een CRISPR/Cas9- en DsRed2-tot expressie brengend plasmide en een homoloog recombinatiedonorplasmide dat EBFP2 tot expressie brengt, dat permanent is geïntegreerd op de Rosa26-locus in immuuncellen.

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Het doel van dit protocol is om crispr/cas9 gemedieerde knock-in experimenten in macrofaag- en T-cellijnen te vereenvoudigen, met behulp van fluorescerende verslaggevers en celsortering te beïnvloeden. ROSA26 Locus staat bekend als een genomische veilige havenplaats voor het inbrengen van transgenen. Het is gebruikelijk om eiwit van belang met of zonder aanval uit te drukken in de muizenwereld van 26 locus, of in de menselijke ortho log.Deel 1: Ontwerp en de plasmideconstructie van sgRNA's gericht op Rosa26 Locus. Ontwerp eerst sgRNA's van muis Rosa26 locus, met behulp van sequenties van muisgenoominformatica, en Ensemble Genome Browser, en download vervolgens de genomische sequentie van het Rosa26-gen van de muis. Ga naar de online webtool CRISPOR, plak 100 basenpaar van de invoervolgorde van de Rosa26 Locus.Selecteer vervolgens een genoom, bijvoorbeeld Mus musculus-muis referentiegenoom 2011. Selecteer vervolgens het type PAM. Gebruik 20bp NGG"PAM-motief, herkend door spCas9.Klik op Verzenden. Kies een gids met een hoge specificiteitsscore, een hoge score en minder off-targets. Gidsen die als inefficiënt zijn aangegeven, moeten worden vermeden.Met name heeft het de voorkeur om twee hulplijnen met overlappende sequenties te selecteren, wat de knock-in-efficiëntie zoals gerapporteerd kan verhogen. Voor warme dine-sequentie, synthetiseer een voorwaartse illegale en een omkering illegaal, die gegloeid gefosforeerd en klaar voor klonen om te factor. Bereid de lineaire afname per Vactor voor waarop zou kunnen uitdrukken dat ik door BBS één vertering moet rapporteren, zoals de Neal, de legalen naar de lineaire vector om het uiteindelijke construct te genereren, dat tegelijkertijd gids-RNA en de CAS-negen kern uitdrukt, gekoppeld aan een DSRIP twee fluorescerende reporter.Deel twee: Constructie van targetingvector als homologe recombinatiesjabloon. Voor expressie van het eiwit van belang. De mens hield het bijvoorbeeld vol.U wilt de cDNA-sequentie synthetiseren per commerciële bron en affiniteit OST-tag of andere veelgebruikte aanval voor zuivering van eiwitten kan worden samengevoegd met de cDNA-sequentie. Vergeet niet om de Kazachse consensussequentie op te nemen vóór de start van het cDNA. Verteerd door Asc1 restrictie-enzym, en zoals krijgen de CD en de insert in de ruggengraat.Vactor, namelijk pKhR26-IBFP IBP die het uiteindelijke richtconcentraat van de container oplevert, elk, KB van vijf priem- en drie priem-homologe armen. De expressie cast set bevat een CG promotor, het UST restaurant, als je wilt Koonin regio gekoppeld aan een Iris, als VFD verslaggever en een poly AC fondsen. Ten slotte wordt aan de horizon gericht op vector met behulp van unieke snijderenzymen, zoals EcoR1 of BamH1, de digesten en het product gezuiverd in een winkel die min 20 graden op elektroporatietonen.Het wordt aanbevolen om een hoge concentratie gelineariseerd vector-DNA te verkrijgen. Deel drie: Elektroporatie van macrofaag- en T-cellijnen bereiden celcultuur voor op scheiding voor geritalkcellen. De optimale celdichtheid was ongeveer 0,5 miljoen cellen per ML op het moment van transfectie.Volledige elektroporatie in tien macro kleine nucleaire modetipformaten bereiden een 24-putplaat met 500 microliter volledige groei, medium zonder antibiotica in elke put. Verwarm de platen voor in bevochtigde 37 graden, 5% die die setting incubator bedekt. Zet de ingangselektroporatieparameters van het elektrische besturingssysteem voor jet cat of Rosales lager.Bereid cel DNA-mengsel follow-ups of operatie verzamelen kippencellen. Curchin 25 vierkante centimeter kolf transfer cellen in de 15 dieren. Omdat je buis, dan Phillip de cellen door centrofugatie op 90 keer G gedurende acht minuten bij kamertemperatuur, vraag ernaar, de supernatanten.Voor het wassen resuspendeert u de cellen met de vijf ML PBS en spint u de celsuspensie door centrifugeren onder dezelfde voorwaarde als de vorige stap. Verwijder de DPP's. En resuspend de celkussens met behulp van twee ML DBS.Je blijft micro kleine cel suspensie en mengt met het gelijke volume van 0,2% Trepan Ballou om het celgetal te schatten in termen van telsleuf invoegen Connie dia in de geautomatiseerde cel Connor en bekijk het beeld zelf. Krijg vervolgens een celtellingsresultaat. Bereken 2 miljoen cellen zullen reputaties van elektroporatie vinden per klopexperiment breng het aantal cellen over in 1,5 ML.Centrifugeer twee pelletcellen door centrifugaalisatie.Om tijd te besparen, kan tijdens de centrifugalisatie een elektroporatiemengsel worden bereid dat 2,5 microgram van elk CRISPR CAS negen vector 2,4 microgram Belinda-rijst, talkative vector en re suspension Buffalo toevoegt. Ons totale volume van 55 macrostrooisel in een nieuwe 1,5 ML gecentrifugeerde buis vertex zachtjes en. Even goed mengen.Laat het Luxor drukmengsel en de kamertemperatuur voor gebruik staan. Na het draaien van aspart, de DTB is deze in wezen zekering voor een extra 30 seconden, verwijder zoveel mogelijk supernatant re suspensie cellen door het toevoegen van de bereide elektroporatie mengsel pipet op en neer zachtjes op en neer. Elektroporatie vroeg om de cel elektroporatie mixer met behulp van 10 micro kleine nucleaire factie tip was pipetten belangrijk.Vermijd luchtbellen tijdens het piaaien, het kost galvaniseerfouten. Druk op start. waarna de bewerking het monster binnen een tijdje overdraagt.Put van 24, putplaten met een pre-warn het bruto medium voeren dezelfde elektrische druk en procedures uit als hierboven op de resterende vier gerepliceerde monsters, schommelen de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen. Incubeer de cellen in een incubator van 37 graden gedurende 48 tot 72 uur. Voorafgaand aan de feiten, celsortering Op 24 uur na transfectie, onderzoek de expressie van verstoring twee voor restaurantverslaggever met behulp van fluorescerende microscopie los van de vertegenwoordiger voor ons zelf geeft aan dat de elektroporatie naar behoren werkt.Deel 4: celsortering om vermeende knock-in cellen te isoleren. Voordat celsortering zich voorbereidt, in 96 putplaten met 150 micro weinig celtype specifiek bruto medium per put gebruik verkeerde bodem micro plaats voor cultuur en zichzelf en de platte bodem micro plaats voor alle cellen overbrengen cellen in een steriele FACS om de buis in ijs te houden en om de doos in het pad door venster te zetten, aansluiten op celsorteerkamer indien van toepassing set celsorteerder met 85 micro meter mondstuk en lage stroomsnelheid voor immuuncelsortering om optimale celbewasbaarheid en overleving te bereiken, neem monsters van de pass-through venstervertex kort en laad het monster in de acquisities. Champer zette fact skating op voor celsortering, definieerde eerst verkooptrechters voor Ford-scatter en side scatter en definieerde vervolgens de levenscellen door de set talks rode negatieve cellen te verkrijgen.Vervolgens vinden ze een levende enkele cel door singlet gating met behulp van de FSC H versus FSE een multi-gevarieerd blok. Stel ten slotte een poort in voor de gewenste DSRs twee en B als de Volvo-positieve subpopulatie, wat aangeeft dat cellen met succes zijn getransfecteerd met CRISPR-vector en de pocketing vector. Dus 10 enkele cellen in elke put van de 96, putplaat aangevuld met de voorwarm, het volledige groeimedium met behulp van periodemodus of eencellige modus na sortering incuberen de 96, putplaten in de celkweekincubator voor celexpansie.Deel vijf:screening van verhoging van positieve knock-in cellen Na ongeveer twee weken celexpansie voorbij de overleven, beoordelen de cellen in de 48-putplaat de expressie van BFP of flowcytometrie met behulp van een klein deel van proliferaat zichzelf met behulp van de wandtype cellen als een negatieve controlecelpopulaties, die een hoger percentage BFP-positieve cellen bezitten, worden bewaard om te voldoen aan het validatie-extract van het genomische DNA uit de cellen die we moeten uitdrukken BFP passeert het geïsoleerde genomische DNA door PCR met primers die elke kant van de homologe armen overspannen, namelijk één primaire lokallocatie in de genomische sequentie, buiten de targetingvector. De geziene kant van het praten met de vector in dit experiment, de voorspelde grootte van het PCR-product versterkt met de primaire is 1,2 KV. En met F twee en R twee is 1,2 KB Sanger sequencing resultaten. Pcr-producten tonen dus de sequenties van elk integratieknooppunt dat de juiste en kloppende positie in de Rosa 26 Lucas demonstreert.Ik zeg dat immuno blotting de validatie van correct kloppen op eiwitniveau mogelijk maakt deel zes representatieve resultaten. Als voorbeeld, gepubliceerd in eerdere studie, hebben we uitgedrukt dat krijgen 45 moleculen tack dat de inter met een OSD-tag, en er was een 26 locus in checkout T-cellen vervolgens USD tact. Ik word 45 en incidentdirecteuren of naar beneden getrokken door affiniteitszuivering en een onderwerp van massaspectrometrie.Ze proteomics gegevens onthulden interactie van T-cellen. Daarom heeft deze productpool de zoektocht naar nieuwe intercalators om de functie van een bepaald eiwit op te helderen aanzienlijk vergemakkelijkt. Deze technische presentatie toonde aan dat door transiënt uitgedrukte verhoogde per gegoten lijn RFP met de sprekende vector co-uitgedrukt en BFP voor Rosa 26 locus.We genereerden kloppende cellijnen met permanente genexpressie in zowel T-cellen als macrofagen, die moeilijk uit te voeren zijn bij genetische manipulaties. Deze methoden en aanbevelingen zijn van toepassing op Chris toegestaan in beweringen van groot DNA-segment voor mechanistische studies van immuuncellen, zoals voor identificatie van eiwitten, eiwitinteractiestudie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm - / -</sup En P53 - / -</sup Muizen

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...