Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Nous remercions l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université médicale de Xinxiang. Le développement de cette technologie a été soutenu par des subventions de la NSFC 81601360 à LZ, 81471595 et 32070898 à YL. Le travail est également soutenu par la Fondation du Comité éducatif du Henan n ° 21IRTSTHN030.

1. Conception et construction plasmidique de sgRNA ciblant rosa26 Locus
<ol><li>Guide de conception des ARN autour du site d’insertion souhaité
	<ol>
<li>S’assurer que le site d’insertion des expériences de frappe de souris Rosa26 (ci-après dénommée mRosa26)est situé dans le premier intron de mRosa26; ce site a été utilisé dans des études antérieures28,29. Pour les expérienc...

Dans nos expériences, nous avons démontré comment effectuer l’édition knock-in dans les cellules immunitaires, de la conception de la construction au criblage et à la validation des cellules knock-in, en utilisant les cellules T Jurkat humaines et les macrophages murins RAW264.7 à titre d’exemples. Les lignées cellulaires de lymphocytes T et de macrophages sont résistantes à la transfection36,37; cependant, le problème de la faible efficacité de la...

Les cellules immunitaires sont essentielles à la défense contre les agents pathogènes. L’immunité innée et adaptative est nécessaire pour l’élimination des infectieux et le maintien de l’homéostasie tissulaire1,2. Les modèles de lignées cellulaires sont des outils essentiels pour comprendre les fondements moléculaires du système immunitaire des mammifères; ils sont utilisés dans des tests fonctionnels in vitro, tels que ceux modélisant l’activation des lymphocytes T humains, et pour déterminer la fonction des facteurs génétiques dans l’activation ou l’amortissement des réponses immunitaires3,4. Il est important de noter que le système immunitaire des mammifères est extrêmement hétérogène et, tout aussi important, un grand nombre de molécules contrôlent la différenciation, la migration et la fonction d’une cellule donnée de type5,6.
Les outils d’édition du génome CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permettent la manipulation génétique de types cellulaires spécifiques, ce qui facilite l’annotation fonctionnelle des gènes de manière précise7,8. Plusieurs protocoles publiés ont décrit l’administration de CRISPR/Cas9 sous la forme de complexes d’ARN guides Cas9 connus sous le nom de ribonucléoprotéines (RRP) dans les cellules HEK293, les lignées cellulaires Jurkat, les cellules T primaires9,10,les macrophages11,12,13,les cellules souches14et d’autres15,16. Dans ces protocoles, le marquage génique est généralement réalisé en fusionnant une étiquette fluorescente à des protéines endogènes17,18. Cependant, peu de tentatives ont été faites pour utiliser des rapporteurs fluorescents doubles, qui sont compatibles avec le tri des cellules uniques, pour faciliter les expériencesknock-in 19,20, en particulier dans les cellules immunitaires.
Les analyses mécanistes approfondies visant à comprendre les fonctions d’un nouveau facteur génétique dans les cellules immunitaires nécessitent généralement la délétion spécifique d’un gène par type cellulaire, des expériences de sauvetage génétique et, idéalement, l’identification de ses interacteurs. Même si des méthodes d’optimisation de la délétion génétique des gènes dans les cellules immunitaires ont été publiées9,15,21, beaucoup moins de méthodes ont été rapportées pour introduire des allèles knock-in avec des fonctions polyvalentes pour comprendre la réponse immunitaire. Par conséquent, dans ce protocole, nous visons à décrire en détail un protocole efficace et hautement reproductible pour exprimer une protéine d’intérêt (POI) au locus refuge Rosa26 dans les lignées cellulaires immunitaires humaines et murines. Nous avons conçu un système rapporteur bicolore pour enrichir les cellules transfectées avec des plasmides exprimant CRISPR/Cas9 (DsRed2) et un modèle d’ADN recombinant (EBFP2), qui peut être isolé par tri cellulaire. Suite à ce protocole, nous avons obtenu plusieurs lignées knock-in de la lignée de cellules T humaines Jurkat et du macrophage murin RAW264.7 pour des analyses fonctionnelles de protéines mal étudiées.
À titre d’exemple, nous montrons dans ce protocole comment obtenir des macrophages RAW264.7 knock-in exprimant de manière stable l’ACE2 humain (un récepteur du SARS-Cov-2)22. Parce que les cellules immunitaires innées sont impliquées dans la pathogenèse du Covid-1923,24 et que l’ACE2 humain est considéré comme un récepteur majeur nécessaire à l’entrée virale dans les cellules avant la réplication, les macrophages avec knock-in de l’ACE2 humain peuvent servir d’outil utile pour les études mécanistes de la multiplication virale à l’intérieur des macrophages. En parallèle, nous présentons également un exemple de knock-in d’un gène au locus humain ROSA26 pour exprimer la protéine RASGRP1, qui a été fusionnée à son extrémité aminée avec une affinité Twin-Strep-tag (OST). Les lymphocytes T sont des cellules cibles clés dans les thérapies immunitaires, et un nombre croissant d’études se sont concentrées sur la manipulation de leur réactivité au cancer25,26. Comme Rasgrp1 est connu pour être une molécule de signalisation clé en aval du récepteur des lymphocytes T et que ses interacteurs ne sont pas bien élucidés27,le modèle d’inserrage OST-RASGRP1 fournit la base pour identifier les interacteurs régulant la réponse des lymphocytes T aux tumeurs et aux infections. Pris ensemble, ces outils peuvent être utilisés pour les études Covid-19 et la découverte de nouvelles molécules interagissant avec Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Les études de génomique fonctionnelle du système immunitaire nécessitent des manipulations génétiques qui impliquent à la fois la délétion des gènes cibles et l’ajout d’éléments aux protéines d’intérêt. L’identification des fonctions des gènes dans les modèles de lignées cellulaires est importante pour la découverte de gènes et l’exploration des mécanismes intrinsèques des cellules. Cependant, les manipulations génétiques des cellules immunitaires telles que les cellules T et les lignées cellulaires de macrophages utilisant l’entraînement médié par CRISPR / Cas9 sont difficiles en raison de la faible efficacité de transfection de ces cellules, en particulier dans un état de repos. Pour modifier les gènes dans les cellules immunitaires, la sélection de la résistance aux médicaments et les vecteurs viraux sont généralement utilisés pour enrichir les cellules exprimant le système CRIPSR / Cas9, ce qui entraîne inévitablement une intervention indésirable des cellules. Dans une étude précédente, nous avons conçu des rapporteurs fluorescents doubles couplés à CRISPR / Cas9 qui ont été exprimés transitoirement après électroporation. Cette solution technique conduit à une délétion rapide des gènes dans les cellules immunitaires; cependant, l’inserment de gènes dans les cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les macrophages sans l’utilisation de la sélection de la résistance aux médicaments ou de vecteurs viraux est encore plus difficile. Dans cet article, nous montrons qu’en utilisant le tri cellulaire pour faciliter la sélection de cellules exprimant transitoirement les constructions CRISPR / Cas9 ciblant le locus Rosa26 en combinaison avec un plasmide de donneur, le knock-in de gène peut être réalisé à la fois dans les cellules T et les macrophages sans enrichissement en résistance aux médicaments. À titre d’exemple, nous montrons comment exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du SARS-Cov-2, responsable de la pandémie actuelle de Covid-19, dans les macrophages RAW264.7 en effectuant des expériences knock-in. De telles cellules knock-in génétiques peuvent être largement utilisées pour les études mécanistes.

Suivant le protocole décrit ci-dessus pour effectuer des expériences knock-in au locus mRosa26 en utilisant des macrophages murins RAW264.7, nous avons conçu un vecteur de ciblage pour exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du virus SARS-Cov-2(Figure 2A). En utilisant une conception similaire, nous avons généré des cellules T Jurkat humaines avec l’apport de la protéine de fusion RASGRP1 marquée OST (Figure 2C). Après la transfection de troi...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Ce protocole utilise des rapporteurs fluorescents et le tri cellulaire pour simplifier les expériences d’entraînement dans les macrophages et les lignées cellulaires T. Deux plasmides sont utilisés pour ces expériences d’entraînement simplifiées, à savoir un plasmide exprimant CRISPR/Cas9 et DsRed2 et un plasmide donneur de recombinaison homologue exprimant EBFP2, qui est intégré en permanence au locus Rosa26 dans les cellules immunitaires.

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

L’objectif de ce protocole est de simplifier l’expérience d’entraînement médiée par CRISPR/Cas9 dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T, à l’aide de rapporteurs fluorescents et d’affecter le tri cellulaire. ROSA26 Locus est connu comme un site génomique sûr pour l’insertion de transgènes. Il est habituel d’exprimer une protéine d’intérêt avec ou sans attaque dans le monde de la souris de 26 locus, ou dans l’ortho log humain.Partie 1: Conception et construction plasmidique des sgRNA ciblant le locus Rosa26. Tout d’abord, concevez des sgRNA à partir du locus Rosa26 de la souris, en utilisant des séquences de l’informatique du génome de la souris et d’Ensemble Genome Browser, puis téléchargez la séquence génomique du gène Rosa26 de la souris. Accédez à l’outil Web en ligne, CRISPOR, collez 100 paires de bases de la séquence d’entrée du Locus Rosa26.Sélectionnez ensuite un génome, par exemple, Mus musculus-souris génome de référence 2011. Ensuite, sélectionnez le type de PAM. Utilisez le motif NGG"PAM 20bp, reconnu par spCas9.Cliquez sur Envoyer. Choisissez un guide avec un score de spécificité élevé, un score de performance élevé et un moins grand nombre de cibles. Les guides indiqués comme inefficaces doivent être évités.Notamment, il est préférable de sélectionner deux guides avec des séquences qui se chevauchent, ce qui peut augmenter l’efficacité de frappe comme indiqué. Pour la séquence de repas chauds, synthétisez un avant illégal et un renversement illégal, qui recuit phosphoré et prêt pour le clonage à factoriser. Préparer la diminution linéarisée par Vactor à laquelle pourrait exprimer si je dois reporter par BBS une digestion, comme obtenir le Neal, les légaux au vecteur linéarisé pour générer la construction finale, qui exprime simultanément l’ARN guide et le noyau CAS neuf liés à un DSRIP deux reporter fluorescents.Deuxième partie: Construction du vecteur de ciblage en tant que modèle de recombinaison homologue. Pour l’expression de la protéine d’intérêt. Par exemple, l’humain a duré.Vous voulez synthétiser la séquence d’ADNc par source commerciale et la balise OST d’affinité ou toute autre attaque couramment utilisée pour la purification des protéines peut être fusionnée à la séquence d’ADNc. N’oubliez pas d’inclure la séquence de consensus Kazak avant le lancement de l’ADNc. Digéré par l’enzyme de restriction Asc1, et comme obtenir le CD et l’insert dans l’épine dorsale.Vactor, à savoir pKhR26-IBFP IBP donnant le ciblage final concentre le conteneur, chacun, KB de cinq bras homologues premiers et trois premiers. L’ensemble d’expressions comprend un promoteur CG, le restaurant UST, si vous voulez la région de Koonin liée à un Iris, si VFD reporter et un poly AC fonds. Enfin, sur le vecteur de ciblage à l’horizon à l’aide d’enzymes de coupe uniques, telles que EcoR1 ou BamH1, les digestes et le produit sont purifiés dans un magasin de moins 20 degrés sur des notes d’électroporation.Il est recommandé d’obtenir une concentration élevée d’ADN vectoriel linéarisé. Troisième partie: L’électroporation des lignées de macrophages et de lymphocytes T prépare la culture cellulaire suivie de la séparation pour les cellules Geritalk. La densité cellulaire optimale était d’environ 0,5 million de cellules par ML au moment de la transfection.L’électroporation complète en dix formats macro little nuclear fashion tip prépare une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de croissance complète, milieu sans antibiotiques dans chaque puits. Précharssez les plaques dans un humidifié de 37 degrés, couvrant à 5% cet incubateur de réglage. Baissez les paramètres d’électroporation d’entrée du système d’exploitation électrique pour jet cat ou Rosales.Préparer des suivis de mélange d’ADN cellulaire ou opérer collecter des cellules de poulet. Curchin 25 centimètres carrés flacon de cellules de transfert chez les 15 animaux. Depuis vous tube, puis Phillip les cellules par centrofugation à 90 fois G pendant huit minutes à température ambiante, demandez-le, les surnageants.Pour le lavage, resuspendez les cellules avec les cinq PBS ML, puis faites tourner la suspension cellulaire par centrifugation en utilisant la même condition que l’étape précédente. Supprimez les DPP. Et ressuspendez les oreillers cellulaires en utilisant deux ML de DBS.Vous restez micro petite suspension de cellule et mélangez avec le volume égal de 0,2% Trepan Ballou pour estimer l’échantillon de charge de comptage en termes de fente de comptage insérer Connie glisser dans la cellule automatisée Connor et voir l’image eux-mêmes. Obtenez ensuite un résultat de comptage de cellules. Calculer 2 millions de cellules trouvera des réputations d’électroporation par expérience de frappe transférer le nombre de cellules dans 1,5 ML.Centrifuger deux cellules à granulés par centrifugation.Pour gagner du temps, un mélange d’électroporation peut être préparé pendant la centrifugeuse qui ajoute 2,5 microgrammes de chacun des neuf vecteurs CRISPR CAS 2,4 microgrammes de riz Belinda, vecteur bavard, et ressaison Buffalo. Notre volume total total de 55 macro litières dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 ML vertéxe doucement et. Tenez-vous brièvement debout pour bien mélanger.Laisser le mélange sous pression louxor et la température ambiante avant utilisation. Après avoir filé l’asparte, le DTB est essentiellement ce fusible pendant 30 secondes supplémentaires, retirez autant de surnageant que possible des cellules de suspension en ajoutant doucement la pipette de mélange d’électroporation préparée de haut en bas. L’électroporation demandée pour le mélangeur d’électroporation de cellule utilisant 10 micro petite pointe de faction nucléaire était des pipettes importantes.Évitez les bulles d’air pendant la mise en place, cela coûtera une défaillance de la galvanoplastie. Appuyez sur Démarrer. après quoi l’opération transfère l’échantillon en un certain temps.Puits de 24, les plaques de puits avec un pré-avertissement du milieu brut effectuent la même pression électrique et les mêmes procédures que ci-dessus sur les quatre échantillons répliqués restants, bercent doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés pendant 48 à 72 heures. Avant les faits, le tri cellulaire À 24 heures après la transfection, examiner l’expression de disrupt two pour le journaliste de restaurant en utilisant la microscopie fluorescente détachée du représentant pour nous-mêmes indique que l’électroporation fonctionne correctement.Partie 4: tri des cellules pour isoler les cellules knock-in putatives. Avant le tri cellulaire préparer, dans 96 plaques de puits avec 150 micro peu de milieu brut spécifique de type cellulaire par puits utiliser mauvais micro endroit inférieur pour la culture et lui-même et le micro endroit à fond plat pour toutes les cellules transférer les cellules dans un FACS stérile pour garder le tube sur la glace et mettre la boîte dans le chemin à travers la fenêtre, Connexion à la salle de tri cellulaire le cas échéant régler le trieur de cellules avec une buse de 85 micromètres et un faible débit pour le tri des cellules immunitaires afin d’obtenir une évaluabilité et une survie cellulaires optimales, prélever des échantillons du sommet de la fenêtre de passage brièvement et charger l’échantillon dans les acquisitions. Champer a mis en place un patinage de faits pour le tri cellulaire d’abord défini des entonnoirs de vente pour la dispersion Ford et la dispersion latérale, puis définir les cellules de vie en gagnant l’ensemble parle des cellules rouges négatives.Ensuite, ils trouvent une cellule unique vivante par un seul contrôle unique en utilisant le FSC H par rapport à FSE un bloc multi-varié. Enfin, définissez une porte pour les DSR souhaités deux et B si la sous-population positive volvo, ce qui indique que les cellules ont réussi à se transfecter avec le vecteur CRISPR et le vecteur de poche. Ainsi, 10 cellules simples dans chaque puits des 96, plaque de puits complétée par le pré-préchauve, le milieu de croissance complet en utilisant le mode période ou le mode cellule unique après tri incubent les 96 plaques de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pour l’expansion cellulaire.Cinquième partie: dépistage de l’élévation des cellules knock-in positives Après environ deux semaines d’expansion cellulaire après la survie, les cellules de la plaque de 48 puits évaluent l’expression de la BFP ou de la cytométrie en flux en utilisant une petite proportion de proliférer elle-même en utilisant les cellules de type paroi comme populations de cellules témoins négatives, possédant un pourcentage plus élevé de cellules BFP positives sont conservées pour remplir la validation extraire l’ADN génomique des cellules que nous devrions exprimer Les BFP transmettent l’ADN génomique isolé par PCR avec des amorces couvrant chaque côté des bras homologues, à savoir une localisation primaire dans la séquence génomique, à l’extérieur du vecteur cible. Le côté vu de parler au vecteur dans cette expérience, la taille prédite du produit PCR amplifié avec le primaire est de 1,2 KV. Et avec F deux et R deux est 1,2 Ko résultats de séquençage de Sanger. Ainsi, les produits PCR montrent les séquences de chaque jonction d’intégration démontrant la position correcte et de frappe dans le Rosa 26 Lucas.Je dis comme immuno blotting permet la validation du cognement correct au niveau de la protéine partie six résultats représentatifs. À titre d’exemple, publié dans une étude précédente, nous avons exprimé que 45 molécules tack que l’inter avec une étiquette OSD, et il y avait un 26 locus dans les cellules T de paiement par la suite USD tact. J’obtiens 45 et des directeurs d’incident ou tirés vers le bas par purification d’affinité et un sujet à la spectrométrie de masse.Les données protéomiques ont révélé l’interaction des lymphocytes T. Par conséquent, ce pool de produits a grandement facilité la recherche de nouveaux intercalateurs pour élucider la fonction d’une protéine donnée. Cette présentation technique a montré que par augmentation transitoire de l’appel d’offres par ligne de coulée avec le vecteur parlant co-exprimé et BFP pour le locus Rosa 26.Nous avons généré des lignées cellulaires de frappe avec une expression génique permanente dans les cellules T et les macrophages, qui sont difficiles à réaliser dans les manipulations génétiques. Ces méthodes et recommandations sont applicables à Chris autorisé dans les affirmations de grand segment d’ADN pour les études mécanistes des cellules immunitaires, telles que pour l’identification des protéines, l’étude de l’interaction protéique.

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The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...