Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Wir danken der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung der Xinxiang Medical University. Die Entwicklung einer solchen Technologie wurde durch NSFC-Zuschüsse 81601360 an LZ, 81471595 und 32070898 an YL unterstützt. Die Arbeit wird auch von der Stiftung des Henan Educational Committee Nr. 21IRTSTHN030 unterstützt.

1. Design und Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus
<ol><li>Designleitfaden-RNAs rund um die gewünschte Einfügestelle
	<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass sich die Einfügestelle für Rosa26-Knock-in-Experimente der Maus Rosa26 (im Folgenden als mRosa26bezeichnet) im ersten Intron von mRosa26befindet. Diese Seite wurde in früheren Studien verwendet28,29. Stellen Sie bei Knock-in-...

In unseren Experimenten haben wir gezeigt, wie man Knock-in-Editing in Immunzellen vom Konstruktdesign bis zum Knock-in-Zellscreening und Validierung am Beispiel menschlicher Jurkat-T-Zellen und muriner RAW264.7-Makrophagen durchführt. Sowohl T-Zell- als auch Makrophagen-Zelllinien sind resistent gegen Transfektion36,37; Das Problem der geringen Effizienz der CRISPR/Cas9-Abgabe kann jedoch mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern in Verbindung mit der Zellsortie...

Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich1,2. Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten3,4. Es ist wichtig zu beachten, dass das Immunsystem von Säugetieren enorm heterogen ist und, ebenso wichtig, eine große Anzahl von Molekülen die Differenzierung, Migration und Funktion eines bestimmten Zelltyps5,6steuert.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genome Editing Tools ermöglichen die genetische Manipulation bestimmter Zelltypen, was die funktionelle Annotation von Genen auf präzise Weise erleichtert7,8. Mehrere veröffentlichte Protokolle haben die Abgabe von CRISPR/Cas9 in Form von Cas9-Guide-RNA-Komplexen beschrieben, die als Ribonukleoproteine (RNPs) in HEK293-Zellen, Jurkat-Zelllinien, primären T-Zellen9,10, Makrophagen11,12,13, Stammzellen14und anderen15,16bekannt sind . In diesen Protokollen wird das Gen-Tagging normalerweise durch Verschmelzen eines fluoreszierenden Tags mit endogenen Proteinenerreicht 17,18. Es wurden jedoch nur wenige Versuche unternommen, duale fluoreszierende Reporter zu verwenden, die mit der Einzelzellsortierung kompatibel sind, um Knock-in-Experimente19,20, insbesondere in Immunzellen , zu erleichtern.
Eingehende mechanistische Analysen, die darauf abzielen, die Funktionen eines neuartigen genetischen Faktors in Immunzellen zu verstehen, erfordern in der Regel eine zelltypspezifische Deletion eines Gens, genetische Rettungsexperimente und idealerweise die Identifizierung seiner Interaktoren. Obwohl Methoden zur Optimierung der genetischen Deletion von Genen in Immunzellen veröffentlicht wurden9,15,21, wurden weit weniger Methoden zur Einführung von Knock-in-Allelen mit vielseitigen Funktionen zum Verständnis der Immunantwort berichtet. Daher wollen wir in diesem Protokoll ein effizientes und hochreproduzierbares Protokoll beschreiben, um ein Protein von Interesse (POI) am Safe-Harbor-Locus Rosa26 sowohl in menschlichen als auch in murinen Immunzelllinien zu exprimieren. Wir haben ein zweifarbiges Reportersystem entwickelt, um Zellen anzureichern, die mit Plasmiden transfiziert sind, die CRISPR/Cas9 (DsRed2) exprimieren, und eine rekombinante DNA-Vorlage (EBFP2), die durch Zellsortierung isoliert werden kann. Nach diesem Protokoll erhielten wir mehrere Knock-in-Linien der menschlichen T-Zelllinie Jurkat und des murinen Makrophagen RAW264.7 für funktionelle Analysen von schlecht untersuchten Proteinen.
Als Beispiel zeigen wir in diesem Protokoll, wie man Knock-in RAW264.7 Makrophagen erhält, die stabil menschliches ACE2 (ein Rezeptor von SARS-Cov-2)22exprimieren. Da angeborene Immunzellen an der Pathogenese von Covid-1923beteiligt sind,24 und humanes ACE2 als hauptrezeptor gilt, der für den viralen Eintritt in Zellen vor der Replikation benötigt wird, können Makrophagen mit Knock-in von humanem ACE2 als nützliches Werkzeug für mechanistische Studien der viralen Vermehrung in Makrophagen dienen. Parallel dazu präsentieren wir auch ein Beispiel für das Einschalten eines Gens am menschlichen ROSA26-Locus, um das RASGRP1-Protein zu exprimiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Affinitäts-Twin-Strep-Tag (OST) verschmolzen wurde. T-Zellen sind wichtige Zielzellen in Immuntherapien, und eine zunehmende Anzahl von Studien hat sich auf die Manipulation ihrer Reaktionsfähigkeit auf Krebs konzentriert25,26. Da Rasgrp1 als schlüsselhaftes Signalmolekül nach dem T-Zell-Rezeptor bekannt ist und seine Interaktoren nicht gut aufgeklärt sind27, bietet das OST-RASGRP1-Knock-in-Modell die Grundlage für die Identifizierung von Interaktoren, die die Reaktion von T-Zellen auf Tumore und Infektionen regulieren. Zusammengenommen können diese Werkzeuge für Covid-19-Studien und die Entdeckung neuartiger Moleküle verwendet werden, die mit Rasgrp1 interagieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll zur Durchführung von Knock-in-Experimenten am mRosa26-Locus mit murinen RAW264.7-Makrophagen haben wir einen Zielvektor entwickelt, um menschliches ACE2, einen Rezeptor für das SARS-Cov-2-Virus, zu exprimiert (Abbildung 2A). Mit einem ähnlichen Design erzeugten wir menschliche Jurkat-T-Zellen mit Knock-In des OST-markierten RASGRP1-Fusionsproteins (Abbildung 2C). Nach der Transfektion von drei Plasmiden, von dene...

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Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Ziel dieses Protokolls ist es, das CRISPR/Cas9-vermittelte Knock-in-Experiment in Makrophagen- und T-Zelllinien mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern zu vereinfachen und die Zellsortierung zu beeinflussen. ROSA26 Locus ist als genomischer Safe-Harbor-Standort für die Insertion von Transgenen bekannt. Es ist üblich, Proteine von Interesse mit oder ohne Angriff in der Mauswelt von 26 Locus oder im menschlichen Ortho-Log auszudrücken.Teil 1: Design und die Plasmidkonstruktion von sgRNAs für Rosa26 Locus. Entwerfen Sie zuerst sgRNAs aus dem Rosa26-Locus der Maus unter Verwendung von Sequenzen aus der Genominformatik der Maus und dem Ensemble Genome Browser, und laden Sie dann die genomische Sequenz des Rosa26-Gens der Maus herunter. Gehen Sie zum Online-Web-Tool CRISPOR, fügen Sie 100 Basenpaare der Eingabesequenz aus dem Rosa26 Locus ein.Wählen Sie dann ein Genom aus, zum Beispiel Mus musculus-mouse Referenzgenom 2011. Als nächstes wählen Sie den Typ von PAM. Verwenden Sie 20bp NGG"PAM Motiv, erkannt von spCas9.Klicken Sie auf Senden. Wählen Sie einen Leitfaden mit einem hohen Spezifitätswert, einem hohen Doing-Score und weniger Off-Zielen. Als ineffizient gekennzeichnete Leitfäden sollten vermieden werden.Insbesondere wird es bevorzugt, zwei Hilfslinien mit überlappenden Sequenzen auszuwählen, die die Knock-in-Effizienz wie berichtet erhöhen können. Für die warme Dine-Sequenz synthetisieren Sie ein Forward Illegal und ein Reversal Illegal, das phosphorisiert und bereit zum Klonen zum Faktor glüht. Bereiten Sie die linearisierte Abnahme pro Vactor vor, zu der ich durch BBS eine Verdauung melden muss, wie den Neal, die Legals zum linearisierten Vektor zu bekommen, um das endgültige Konstrukt zu erzeugen, das gleichzeitig Die Leit-RNA und den CAS-Neunkern exprimiert, die mit einem DSRIP zwei fluoreszierenden Reportern verbunden sind.Zweiter Teil: Konstruktion des Zielvektors als homologe Rekombinationsvorlage. Zur Expression des interessierenden Proteins. Zum Beispiel hat der Mensch durchgehalten.Sie möchten die cDNA-Sequenz nach kommerzieller Quelle synthetisieren und Affinität OST-Tag oder ein anderer häufig verwendeter Angriff zur Reinigung von Protein kann mit der cDNA-Sequenz verschmolzen werden. Denken Sie daran, die kasachische Konsenssequenz vor der Einleitung der cDNA einzubeziehen. Verdaut durch Asc1 Restriktionsenzym, und wie bekommen Sie die CD und den Einsatz in das Rückgrat.Vactor, nämlich pKhR26-IBFP IBP, das das endgültige Zielkonzentrat des Behälters ergibt, jeweils einen KB von fünf prime und drei prime homologen Armen. Das Ausdrucks-Cast-Set enthält einen CG-Promoter, das UST-Restaurant, wenn Sie eine Koonin-Region mit einer Iris verknüpft haben möchten, wenn VFD-Reporter und ein Poly-AC-Fonds finanziert werden. Schließlich wird auf dem Horizont-Targeting-Vektor mit einzigartigen Cutter-Enzymen wie EcoR1 oder BamH1 das Ferment und das Produkt in einem Lager gereinigt, das minus 20 Grad auf Elektroporationsnoten liegt.Es wird empfohlen, eine hohe Konzentration linearisierter Vektor-DNA zu erhalten. Teil drei: Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien bereiten zellkulturiert und trennt sich von Geritalkzellen. Die optimale Zelldichte betrug zum Zeitpunkt der Transfektion etwa 0,5 Millionen Zellen pro ML.Volle Elektroporation in zehn Makro-Kleinen-Kern-Mode-Tip-Formaten bereitet eine 24-Well-Platte vor, die 500 Mikroliter vollständiges Wachstum enthält, Medium ohne Antibiotika in jeder Vertiefung. Vorwärmen Sie die Platten in befeuchteten 37 Grad vor, wobei 5% diesen Einstellinkubator abdecken. Schalten Sie die Elektrischen Betriebssystem-Eingangselektroporationsparameter für Jet Cat oder Rosales herunter.Bereiten Sie Zell-DNA-Mischungs-Follow-ups oder Operationen vor, um Hühnerzellen zu sammeln. Curchin 25 Quadratzentimeter Kolbentransferzellen in den 15 Tieren. Da man röhren, dann Phillip die Zellen durch Zentrugation bei 90 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur, fragen Sie danach, die Überstände.Zum Waschen die Zellen mit den fünf ML PBS erneut umdrehen und dann die Zellsuspension durch Zentrifugation unter Verwendung der gleichen Bedingung wie im vorherigen Schritt drehen. Entfernen Sie die DPPs. Und resuspendieren Sie die Zellkissen mit zwei ML DBS.Sie bleiben Mikro-Kleine-Zell-Suspension und mischen mit dem gleichen Volumen von 0,2% Trepan Ballou, um die Zellzahl-Load-Probe in Bezug auf die Zählung Slot Insert Connie gleiten in der automatisierten Zelle Connor und sehen Sie das Bild selbst. Erhalten Sie dann ein Zellanzahlergebnis. Berechnen Sie 2 Millionen Zellen werden Den Ruf der Elektroporation pro Klopfexperiment finden, übertragen Sie die Anzahl der Zellen in 1,5 ML.Zentrifuge zwei Pelletzellen durch Zentrifugalisierung.Um Zeit zu sparen, kann während der Zentrifugalisierung eine Elektroporationsmischung hergestellt werden, die jeweils 2,5 Mikrogramm CRISPR CAS-Neunvektor 2,4 Mikrogramm Belinda-Reis, gesprächigen Vektor und Re-Suspension Buffalo hinzufügt. Unser Gesamtvolumen von 55 Makrostreu in einem neuen 1,5 ML Zentrifugenrohr sanft Vertex und. Kurz stehen, um gut zu mischen.Lassen Sie die Luxor Druckmischung und Raumtemperatur vor Gebrauch. Nach dem Spinnen von Aspart, der DTB ist diese im Wesentlichen Sicherung für weitere 30 Sekunden, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich re suspend Zellen durch Zugabe der vorbereiteten Elektroporationsmischung Pipette nach oben und unten vorsichtig. Elektroporation fragte für den Zellelektroporationsmischer mit 10 Mikro kleine Kernfraktion Spitze war Pipetten wichtig.Vermeiden Sie Luftblasen während der Pi-Streichelung, es kostet einen Galvanikausfall. Drücken Sie Start. Danach überträgt die Operation die Probe in einer Weile.Bohrplatz von 24 Bohrplatten mit einer Vorwarnung des Bruttomediums führen den gleichen elektrischen Druck und die gleichen Verfahren wie oben auf den verbleibenden vier replizierten Proben aus, schaukeln sie sanft die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37-Grad-Inkubator für 48 bis 72 Stunden. Vor der Tat, Zellsortierung 24 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die Expression von Disrupt zwei für Restaurant Reporter mit floreszierender Mikroskopie, die von der Rep für uns selbst getrennt ist, zeigt an, dass die Elektroporation richtig funktioniert.Teil 4: Zellsortierung zur Isolierung mutmaßlicher Knock-in-Zellen. Bevor die Zellsortierung vorbereitet wird, in 96 Well-Platten mit 150 Mikro-Wenig zelltypspezifischem Bruttomedium pro Bohrung verwenden Sie den falschen unteren Mikroplatz für die Kultur und sich selbst und den flachen unteren Mikroplatz für alle Zellen, um die Röhre auf Eis zu halten und die Box in den Weg durch das Fenster zu legen, Anschluss an den Zellsortierraum, falls zutreffend, Stellen Sie den Zellsortierer mit 85-Mikrometer-Düse und niedriger Durchflussrate für die Immunzellsortierung ein, um eine optimale Zellevaluierbarkeit und -überleben zu erreichen, nehmen Sie Kurz Proben aus dem Pass-Through-Fenster-Scheitelpunkt und laden Sie die Probe in die Aufnahmen. Champer richtete Fact Skating für die Zellsortierung ein, definierte zuerst Verkaufstrichter für Ford-Scatter und Side Scatter, dann definieren Sie die Lebenszellen, indem Sie die Set-Talks roten negativen Zellen gewinnen.Als nächstes finden sie eine lebende Einzelzelle durch Single Single Single Tating mit dem FSC H versus FSE einem multi-diversen Block. Setzen Sie schließlich ein Gate für die gewünschten DSRs zwei und B, wenn die Volvo-positive Subpopulation, die darauf hinweist, dass Zellen erfolgreich mit CRISPR-Vektor und dem Pocketing-Vektor kotransfiziert wurden. So 10 Einzelzellen in der jeweils Bohrung der 96, Gutplatte ergänzt mit dem Vorwärmen, dem kompletten Wachstumsmedium im Periodenmodus oder Einzelzellmodus nach dem Sortieren inkubieren die 96, Brunnenplatten im Zellkulturinkubator zur Zellexpansion.Teil fünf: Screening der Erhöhung positiver Knock-in-Zellen Nach etwa zwei Wochen Zellexpansion nach dem Überleben beurteilen die Zellen in der 48-Well-Platte die Expression von BFP oder Durchflusszytometrie unter Verwendung eines kleinen Anteils der Proliferation selbst unter Verwendung der Wandzellen als negative Kontrollzellpopulationen, die einen höheren Prozentsatz an BFP-positiven Zellen besitzen, um die Validierung zu erfüllen extrahieren die genomische DNA aus den Zellen, die wir exprimieren sollten BFP passieren die isolierte genomische DNA durch PCR mit Primern, die jede Seite der homologen Arme überspannen, nämlich eine primäre Lokalisierung in der genomischen Sequenz, außerhalb des Zielvektors. Die gesehene Seite des Gesprächs mit dem Vektor in diesem Experiment, die vorhergesagte Größe des PCR-Produkts, das mit dem Primären verstärkt wird, beträgt 1,2 KV. Und mit F zwei und R zwei sind 1,2 KB Sanger Sequenzierungsergebnisse. So zeigen PCR-Produkte die Sequenzen jedes Integrationsübergangs, die die richtige und klopfende Position in den Rosa 26 Lucas demonstrieren.Ich sage, wie Immun-Blotting ermöglicht die Validierung des korrekten Klopfens auf Proteinebene Teil sechs repräsentative Ergebnisse. Als Beispiel, das in einer früheren Studie veröffentlicht wurde, haben wir ausgedrückt, dass 45 Moleküle das Inter mit einem OSD-Tag anheften, und es gab einen 26 Locus in Checkout-T-Zellen anschließend USD Takt. Ich bekomme 45 und Incident Directors oder durch Affinitätsreinigung und ein Thema der Massenspektrometrie heruntergezogen.Ihre Proteomik-Daten zeigten die Interaktion von T-Zellen. Daher hat dieser Produktpool die Suche nach neuartigen Interkalatoren zur Aufklärung der Funktion eines bestimmten Proteins erheblich erleichtert. Diese technische Präsentation zeigte, dass durch transient ausgedrückte erhöhte pro Gusslinie RFP mit dem sprechenden Vektor co-exprimiert und BFP für Rosa 26 Locus.Wir erzeugten klopfende Zelllinien mit permanenter Genexpression sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen, die bei genetischen Manipulationen schwer durchzuführen sind. Diese Methoden und Empfehlungen sind auf Chris anwendbar, die in Behauptungen eines großen DNA-Segments für mechanistische Studien von Immunzellen zugelassen sind, z. B. zur Identifizierung von Proteinen, Proteininteraktionsstudien.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...