Name: gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של האוניברסיטה הרפואית שינש'יאנג. פיתוח של טכנולוגיה כזו נתמך על ידי מענקי NSFC 81601360 LZ, 81471595 32070898 ל- YL. העבודה נתמכת גם על ידי קרן ועדת החינוך של הנאן מס ' 21IRTSTHN030.

1. עיצוב ופלסטיד בניית sgRNAs מיקוד Rosa26 לוקוס
<ol><li>RNAs של מדריך עיצוב סביב אתר ההוספה הרצוי
	<ol>
<li>ודא כי אתר ההחדרה עבור העכבר Rosa26 (להלן מוגדר mRosa26) ניסויי נוק-אין ממוקם אינטרון הראשון של mRosa26; אתר זה שימש במחקרים קודמים28,29. לנ?...

בניסויים שלנו, הדגמנו כיצד לבצע עריכה נוק-אין בתאי מערכת החיסון מעיצוב מבנים ועד הקרנת תאים ואימות באמצעות תאי Jurkat T אנושיים ו macrophages RAW264.7 murine כדוגמאות. הן קווי תא T והן קווי תא מקרופאג' עמידים בפני טרנספקטיון36,37; עם זאת, הבעיה של יעילות נמוכה של משלוח CRISPR / Cas9 נ...

תאי מערכת החיסון הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים. חסינות מולדת ומסתגלת נדרשים לפינוי זיהומים ותחזוקה של הומאוסטזיסרקמות 1,2. מודלים של קו התאים הם כלים חיוניים להבנת היסודות המולקולריים של מערכת החיסון של היונקים; הם משמשים במבחנה תפקודית בדיקות, כגון אלה מודל הפעלת תאי T אנושי, בקביעת הפונקציה של גורמים גנטיים בהפעלת או שיכוך תגובות חיסוניות3,4. חשוב לציין כי מערכת החיסון של היונקים היא הטרוגנית מאוד, ולא פחות חשוב, מספר עצום של מולקולות לשלוט בידול, הגירה, ותפקוד של תא נתון סוג5,6.
מקובצים באופן קבוע בין-מרחבים קצר פלינדרומי חוזרים (CRISPR)/Cas9 כלי עריכת גנום המאפשרים מניפולציה גנטית של סוגי תאים ספציפיים, המאפשר ביאור תפקודי של גנים בצורה מדויקת7,8. מספר פרוטוקולים שפורסמו תיארו את המסירה של CRISPR/Cas9 בצורה של מתחמי RNA של Cas9-guide המכונים ריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) בתאי HEK293, קווי תאים של Jurkat, תאי T ראשיים9,10, מקרופאגים11,12,13, תאי גזע14, ואחרים15,16. בפרוטוקולים אלה, תיוג גנים מושגת בדרך כלל על ידי היתוך תג פלואורסצנטי לחלבונים אנדוגניים17,18. עם זאת, נעשו ניסיונות מעטים להשתמש בכתבים פלואורסצנטיים כפולים, התואמים למיון תאים בודדים, כדי להקל על ניסויי נוק-אין19,20, במיוחד בתאי מערכת החיסון.
ניתוחים מכניסטיים מעמיקים שמטרתם להבין את תפקודו של גורם גנטי חדשני בתאי החיסון דורשים בדרך כלל מחיקה ספציפית מסוג תאים של גן, ניסויי הצלה גנטיים וזיהוי אידיאלי של האינטראקטיבים שלו. למרות שיטות לאופטימיזציה של מחיקה גנטית של גנים בתאי מערכת החיסוןפורסמו 9,15,21, הרבה פחות שיטות דווחו עבור החדרת אללים knock-in עם פונקציות מגוונות כדי להבין את התגובה החיסונית. לכן, בפרוטוקול זה אנו שואפים לתאר בפירוט פרוטוקול יעיל מאוד לשחזור כדי להביע חלבון של עניין (POI) על locus הנמל הבטוח Rosa26 הן בקווי תאי החיסון האנושיים והן מורין. עיצבנו מערכת כתבים בשני צבעים כדי להעשיר עבור תאים שהודבקו בפלסמידים המבטאים CRISPR/Cas9 (DsRed2) ותבנית דנ"א רקומביננטית (EBFP2), שניתן לבודד על ידי מיון תאים. בעקבות פרוטוקול זה, השגנו שורות נוק-אין מרובות של קו תא T האנושי Jurkat ו מקרופאגים מורין RAW264.7 עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים שנחקרו בצורה גרועה.
כדוגמה, אנו מראים בפרוטוקול זה כיצד להשיג נוק-אין RAW264.7 מקרופאגים מבטאים ביציבות ACE2 אנושי (קולטן של SARS-Cov-2)22. מכיוון שתאי חיסון מולדים מעורבים בפתוגנזה של Covid-1923,24 ו- ACE2 האנושי נחשב לקולטן מרכזי הנדרש לכניסה ויראלית לתאים לפני השכפול, מקרופאגים עם נוק-אין של ACE2 האנושי יכולים לשמש ככלי שימושי למחקרים מכניים של כפל ויראלי בתוך מקרופאגים. במקביל, אנו מציגים גם דוגמה של נוק-אין של גן על locus ROSA26 האנושי להביע את חלבון RASGRP1, אשר הותך במינוח האמינו שלה עם זיקה טווין-סטרפטופט -תג (OST). תאי T הם תאי יעד מרכזיים לטיפולים במערכת החיסון, ומספר גדל והולך של מחקרים התמקדו במניפולציה של התגובה שלהם לסרטן25,26. כמו Rasgrp1 ידוע להיות מולקולת איתות מפתח במורד הזרם של קולטן תא T ואת interactors שלה אינם מנוכרים היטב27, מודל OST-RASGRP1 knock-in מספק את הבסיס לזיהוי אינטראקציות המסדיר את התגובה של תאי T לגידולים וזיהום. יחד, כלים אלה יכולים לשמש למחקרי Covid-19 וגילוי של מולקולות חדשניות אינטראקציה עם Rasgrp1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600</td>
			<td>Ge Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>imaging of chemiluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin, sodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MABS146</td>
			<td>1.0 &#956;g/mL of working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AscI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0558S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8457</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>196055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria&#8482; Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>equipped with biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo version 10.7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (D16H11) XP&#160;Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5174</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31430</td>
			<td>at 1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel Pipette (30-300 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System, 10 &#956;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq&#174; Hot Start Quick-Load&#174; 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>(M0489)</td>
			<td>for high GC% template</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 0.1-20&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 2-200&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip 50-1000&#181;l</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 075.064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458-DsRed2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>purify plasmid from restriction digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0494S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td>https://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108252</td>
			<td>at 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose beads</td>
			<td>IBA Lifesciences</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX&#8482; Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes, PCR-clean</td>
			<td>Eppendorf, or similar</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene knock-in by crispr/cas9 and cell sorting in macrophage and t cell lines

מחקרים גנומיים פונקציונליים של המערכת החיסונית דורשים מניפולציות גנטיות הכרוכות הן במחיקת גנים ממוקדים והן בתוספת אלמנטים לחלבונים בעלי עניין. זיהוי פונקציות גנים במודלים של קו התא חשוב לגילוי גנים וחקירה של מנגנונים מהותיים של תאים. עם זאת, מניפולציות גנטיות של תאים חיסוניים כגון תאי T וקווי תאי מקרופאגים באמצעות נוק-אין בתיווך CRISPR/Cas9 קשות בגלל יעילות ההדבקה הנמוכה של תאים אלה, במיוחד במצב של ירידה. כדי לשנות גנים בתאי מערכת החיסון, בחירת עמידות לתרופות וקטורים ויראליים משמשים בדרך כלל להעשרה עבור תאים המבטאים את מערכת CRIPSR/Cas9, אשר בהכרח גורמת להתערבות בלתי רצויה של התאים. במחקר קודם, עיצבנו כתבים פלואורסצנטיים כפולים בשילוב CRISPR / Cas9 שבאו לידי ביטוי ארעי לאחר אלקטרופורציה. פתרון טכני זה מוביל למחיקת גנים מהירה בתאי מערכת החיסון; עם זאת, נוק-אין גנים בתאי מערכת החיסון כגון תאי T ו macrophages ללא שימוש בבחירת התנגדות לסמים או וקטורים ויראליים הוא אפילו יותר מאתגר. במאמר זה, אנו מראים כי באמצעות מיון תאים כדי לסייע בבחירת תאים המבטאים באופן ארעי מבנים CRISPR/Cas9 המתמקדים בלוקוס Rosa26 בשילוב עם פלסמיד תורם, ניתן להשיג נוק-אין גנטי הן בתאי T והן במקרופג'ים ללא העשרה עמידות לסמים. כדוגמה, אנו מראים כיצד לבטא ACE2 אנושי, קולטן של SARS-Cov-2, האחראי על מגיפת Covid-19 הנוכחית, במקרופגים RAW264.7 על ידי ביצוע ניסויים נוק-אין. תאים כאלה נוק-אין גנים ניתן להשתמש נרחב עבור מחקרים מכניים.

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל לביצוע ניסויי נוק-אין בלוקוס mRosa26 באמצעות מקרופאגים RAW264.7 murine, עיצבנו וקטור מיקוד כדי לבטא ACE2 אנושי, קולטן עבור וירוס SARS-Cov-2 (איור 2A). באמצעות עיצוב דומה, יצרנו תאי Jurkat T אנושיים עם נוק-אין של חלבון היתוך RASGRP1 מתויג OST(איור 2C). לאח?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines at JoVE.com

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

מטרת פרוטוקול זה היא לפשט את ניסוי הנוק-אין המתווך CRISPR/Cas9 בקווים של תא מקרופאגים ותאי T, בעזרת כתבים פלואורסצנטיים ולהשפיע על מיון תאים. ROSA26 לוקוס ידוע כאתר נמל בטוח גנומי להחדרת טרנסג'נים. זה הרגיל להביע חלבון של עניין עם או בלי התקפה בעולם העכבר של 26 לוקוס, או ביומן האורתופדיה האנושית.חלק 1: עיצוב ובניית פלסמיד של sgRNAs מיקוד Rosa26 לוקוס. ראשית, עיצוב sgRNAs מן העכבר Rosa26 לוקוס, באמצעות רצפים מן אינפורמטיקה גנום העכבר, ודפדפן הגנום אנסמבל, ולאחר מכן להוריד את הרצף הגנומי של הגן Rosa26 העכבר. עבור אל כלי האינטרנט המקוון, CRISPOR, הדבק 100 זוג בסיס של רצף הקלט מ- Rosa26 Locus.לאחר מכן בחר גנום, למשל, גנום התייחסות שרירים ועכבר 2011. לאחר מכן, בחר את סוג ה- PAM. השתמש במוטיב NGG"PAM של 20bp, המזוהה על-ידי spCas9.לחץ על שלח. בחר מדריך עם ציון ייחודיות גבוה, ציון ביצוע גבוה ופחות מחוץ ליעדים. יש להימנע ממדריכים המצוינים כחי כשם שלא יעילים.ראוי לציין, מומלץ לבחור שני מדריכים עם רצפים חופפים, אשר עשוי להגביר את יעילות knock-in כפי שדווח. לרצף הסעודה החמה, לסנתז קדימה לא חוקי היפוך בלתי חוקי, אשר חישל זרחן ומוכן לשיבוט לגורם. הכן את הירידה הליניארית לכל Vactor אשר יכול להביע הוא אני צריך כתב על ידי BBS עיכול אחד, כמו לקבל את ניל, את החוק לווקטור הליניארי כדי ליצור את המבנה הסופי, אשר בו זמנית מבטא RNA מדריך ואת גרעין CAS תשע מקושר עם DSRIP שני כתב פלואורסצנטי.חלק שני: בניית וקטור פילוח כתבנית רקומבינציה הומולוגית. לביטוי של חלבון מעניין. לדוגמה, האדם החזיק מעמד.אתה רוצה לסנתז את רצף cDNA על ידי מקור מסחרי זיקה OST תג או התקפה נפוצה אחרת לטיהור של חלבון ניתן למזג את רצף cDNA. זכור לכלול את רצף הקונצנזוס הקזחי לפני תחילת cDNA. מתעכל על ידי אנזים הגבלת Asc1, וכמו לקבל את התקליטור ואת ההחדרה לתוך עמוד השדרה.Vactor, כלומר pKhR26-IBFP מניב את המטרה הסופית לרכז את המיכל, כל אחד, KB של חמש זרועות הומולוגיות ראשוניות ושלוש זרועות הומולוגיות ראשוניות. ערכת השחקנים של הביטוי כוללת מקדם CG, מסעדת UST, אם אתה רוצה אזור Koonin מקושר איריס, אם כתב VFD וקרנות AC פולי. לבסוף באופק מיקוד וקטור באמצעות אנזימי חותך ייחודיים, כגון EcoR1 או BamH1, התקציר והמוצר מטוהרים בחנות מינוס 20 מעלות על הערות אלקטרופורציה.מומלץ להשיג ריכוז גבוה של DNA וקטורי ליניארי. חלק שלישי: אלקטרופורציה של קווי מקרופאג' ותאי T להכין תרבית תאים בעקבות הפרדה לתאי Geritalk. צפיפות התאים האופטימלית הייתה כ-0.5 מיליון תאים ל-ML בזמן ההדבקה.אלקטרופורציה מלאה בעשרה פורמטי טיפים לאופנה גרעינית מאקרו להכין צלחת 24 באר המכילה 500 microliter של צמיחה מלאה, בינוני ללא אנטיביוטיקה בכל באר. תחמם מראש את הלוחות ב-37 מעלות לחות, 5% מכסות את האינקובטור הזה. תנמיך את הפרמטרים של אלקטרופורציה קלט מערכת ההפעלה החשמלית עבור חתול סילון או Rosales.הכן מעקבים אחר תערובת דנ"א של התא או מבצע לאסוף תאי עוף. קורצ'ין 25 ס"מ בקבוקון להעביר תאים ב 15 בעלי חיים. מאז שאתה צינור, אז פיליפ התאים על ידי צנטריפוגציה ב 90 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, לבקש את זה, supernatants.לשטיפה, resuspend התאים עם חמשת ה- ML PBS, ולאחר מכן לסובב את ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה באמצעות אותו מצב כמו השלב הקודם. הסר את העקורים. וחידש את כריות התאים באמצעות שני ML של DBS.אתה נשאר השעיית תא זעירה ומערבב עם נפח שווה של 0.2%Trepan Ballou כדי להעריך את דגימת עומס ספירת התא במונחים ספירת חריץ להכניס שקופית קוני בתא האוטומטי קונור ולהציג את התמונה עצמם. ואז לקבל תוצאה של ספירת תאים. חשב 2 מיליון תאים ימצאו מוניטין של אלקטרופורציה לניסוי דפיקות להעביר את מספר התאים לתוך 1.5 ML.Centrifuge שני תאים כדוריים על ידי צנטריפוגליזציה.כדי לחסוך זמן, תערובת אלקטרופורציה ניתן להכין במהלך צנטריפוגליזציה המוסיפה 2.5 מיקרוגרם של כל אחד CRISPR CAS תשעה וקטור 2.4 מיקרוגרם של אורז בלינדה, וקטור פטפטן, ו- Re suspension באפלו. הנפח הכולל הכולל שלנו של 55 המלטה מאקרו בצינור צנטריפוגה חדש 1.5 ML קודקוד בעדינות ו. עומדים בקצרה לערבב היטב.יש להשאיר את תערובת הלחץ של לוקסור ואת טמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר ספינינג כמו חלק, DTB הוא זה בעצם נתיך במשך 30 שניות נוספות, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר להשעות תאים על ידי הוספת פיפטה תערובת אלקטרופורציה מוכן למעלה ולמטה בעדינות. אלקטרופורציה ביקשה את מערבל אלקטרופורציה התא באמצעות 10 מיקרו קטן קצה הסיעה הגרעינית היה pipettes חשוב.הימנע בועות אוויר במהלך ליטוף pi זה יעלה כשל electroplating. לחץ על התחל. לאחר מכן הפעולה מעבירה את המדגם לזמן מה.ובכן של 24, לוחות היטב עם מראש להזהיר המדיום ברוטו לבצע את אותו לחץ חשמלי ונהלים כמו לעיל על ארבע הדגימות המשוכפלות הנותרות, בעדינות לטלטל את הצלחת כדי להבטיח אפילו התפלגות של התאים. לדגור על התאים באינקובטור של 37 מעלות במשך 48 עד 72 שעות. לפני מעשה, מיון תאים בשעה 24 שעות לאחר ההדבקה, לבחון את הביטוי של שיבוש שניים עבור כתב מסעדה באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט מנותקת מהנציג עבורנו עצמם מצביעה על כך האלקטרופורציה פועלת כראוי.חלק 4: מיון תאים כדי לבודד תאים נוק-אין putative. לפני מיון התאים להתכונן, ב 96 לוחות היטב עם 150 מיקרו קטן של סוג התא מדיום ברוטו ספציפי לכל טוב להשתמש במקום מיקרו התחתון הלא נכון לתרבות ואת המקום מיקרו התחתון השטוח עבור כל התאים להעביר תאים לתוך FACS סטרילי כדי לשמור על הצינור על קרח ולשים את התיבה בנתיב דרך החלון, חיבור לחדר מיון התאים כאשר ממיין התאים המוגדר החל עם זרבובית 85 מיקרו מטר וקצב זרימה נמוך למיון תאי מערכת החיסון כדי להשיג הערכת תאים אופטימלית והישרדות לקחת דגימות מקודקוד החלון לעבור בקצרה, ולהעמיס את המדגם ברכישות. Champer להגדיר החלקה על עובדות עבור מיון תאים להגדיר תחילה משפכי מכירות עבור פיזור פורד ופיזור צד, ולאחר מכן להגדיר את תאי החיים על ידי השגת ערכת שיחות תאים שליליים אדומים.לאחר מכן, הם מוצאים תאים בודדים חיים על ידי גטינג יחיד יחיד באמצעות FSC H לעומת FSE בלוק רב-מגוון. לבסוף הגדר שער עבור DSRs הרצוי 2 ו- B אם תת-אוכלוסין חיובי של וולוו, המציין תאים שהודבקו בהצלחה עם וקטור CRISPR ווקטור הכיס. אז 10 תאים בודדים בכל באר של 96, צלחת היטב בתוספת עם טרום המלחמה, מדיום הצמיחה המלא באמצעות מצב תקופה או מצב תא יחיד לאחר מיון דגירה 96, לוחות היטב בחממה תרבית התא להרחבת התא.חלק 5: סינון של העלאת תאים חיוביים לאחר כשבועיים של התרחבות תאים לאחר ההישרדה, התאים בצלחת 48 באר מעריכים את הביטוי של BFP או ציטומטריית זרימה באמצעות חלק קטן של להתרבות עצמו באמצעות תאים סוג הקיר כאוכלוסיות תא שליטה שלילית, בעל אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים BFP נשמרים כדי למלא את תמצית האימות את ה- DNA הגנומי מהתאים שעלינו לבטא BFP מעביר את הדנ"א הגנומי המבודד על ידי PCR עם פריימרים המשתרעים על כל צד של הזרועות ההומולוגיות, כלומר אחד מאתר ראשי ברצף הגנומי, חיצוני לווקטור המטרה. הצד הנראה לדבר עם הווקטור בניסוי זה, התחזית בגודל של מוצר PCR מוגבר עם הראשי הוא 1.2 KV. ועם F שתיים ו R שתיים הוא 1.2 KB תוצאות ריצוף סנגר. אז מוצרי PCR מראים את הרצפים של כל צומת אינטגרציה המדגים את המיקום הנכון והדופק לתוך רוזה 26 לוקאס.אני אומר כמו אימונו סופג מאפשר אימות של דפיקות נכונות ברמת החלבון חלק שש תוצאות מייצגות. כדוגמה, שפורסם במחקר הקודם, הבענו כי לקבל 45 מולקולות tack כי inter עם תג OSD, והיה 26 לוקוס בתאי T קופה לאחר מכן טקט דולר. אני מקבל 45 ומנהלי תקריות או משך למטה על ידי טיהור זיקה ונושא ספקטרומטריית מסה.הם נתוני פרוטאומיקס חשפו אינטראקציה של תאי T. לכן מאגר מוצרים זה הקל מאוד על החיפוש אחר intercalators חדש כדי להדגיש את הפונקציה של חלבון נתון. מצגת טכנית זו הראתה כי על ידי התבטאות ארעית מוגברת לכל קו יצוק RFP עם הווקטור המדבר בא לידי ביטוי ו- BFP עבור רוזה 26 לוקוס.יצרנו דפיקות של קווי תאים עם ביטוי גנים קבוע הן בתאי T והן במקרופגים, שקשה לבצעם במניפולציות גנטיות. שיטות והמלצות אלה חלות על כריס המותר בקביעות של מקטע DNA גדול למחקרים מכניסטיים של תאי מערכת החיסון, כגון לזיהוי חלבון, מחקר אינטראקציה עם חלבון.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...